重组腺病毒及其用图
【专利说明】重组腺病毒及其用途
[0001] 关于联邦资助研究的声明
[0002] 本发明在受美国国立卫生研究院（NIH)授予的政府支持下完成，批准号为 AI078526、AI096040和0D011170。政府在本发明中具有一定权利。
[0003]发明背景
[0004] 重组腺病毒载体已经在疫苗的研发中使用。至今，已鉴别出约55种不同的腺病毒 血清型。亚组C腺病毒已被最广泛地研究用于如疫苗接种和基因治疗的应用。具体地讲，腺 病毒血清型2和5 (Ad2和Ad5)广泛用于该领域。重要的是，基于Ad5载体的疫苗已显示在各 种各样的动物模型中引发有效且具保护性的免疫反应。此外，关于使用基于Ad5的重组载 体的HIV疫苗接种的大规模临床试验正在进行（参见，例如W0 01/02607 ;W0 02/22080 ;希 沃尔等人，自然，415:331-335, 2002(Shiveretal.，Nature. 415:331-335, 2002);赖特文 等人，免疫学年评，20:73-99, 2002(Letvinetal.，Annu.Rev.Immunol. 20:73-99, 2002); 以及希沃尔和伊米妮，医学年评，55:355,2004(311；[￥61&11(1￡111；[11；[，4111111.1^￥. Med. 55:355, 2004)) 0
[0005] 然而，基于重组Ad5载体的疫苗用于HIV和其他病原体的有效性可能由于人类群 体中已存在的较高的抗Ad5免疫力而受到限制。在小鼠和猕猴研究中，抗Ad5免疫力的 存在与基于Ad5的疫苗的免疫原性的降低有关联。1期临床试验的早期数据显示此问题 也可能在人类中出现。虽然Ad5特异性中和抗体（NAb)和CD8+T淋巴细胞两者都引起抗 Ad5免疫力，但似乎Ad5特异性NAb在此过程中起到主要作用（苏米达等人，病毒学杂志， 174:7179-7185, 2004(Sumidaetal.，J.Virol. ,174:7179-7185, 2004))。
[0006]因此，在本领域中存在未满足的对于具有低血清阳性率和有效免疫原性的替代性 腺病毒载体的需要。
[0007] 发明概述
[0008] 已鉴别出三种新型猿猴腺病毒（sAd)sAd4287、sAd4310A和sAd4312的完整基因 组，并且确定了它们的完整基因组。这些腺病毒表现出出人意料地低的血清阳性率和有效 的免疫原性两者，这表明这些病毒可以用作新型疫苗载体候选物。在第一方面，本发明的特 征在于分离的多核苷酸，分离的多核苷酸包括与SEQIDN0s:l-3中任一个的全部或一部 分，或其互补序列至少90 % -致（例如，至少91 %、92 %、93 %或94% -致）、至少95 % -致 (例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的核苷酸序列。SEQIDN0s:l、2 和3分别是野生型sAd4287、sAd4310A和sAd4312的全长基因组序列。本发明的分离多核苷 酸可以包括参考多核苷酸分子（例如，SEQIDN0s:l-3)的至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、 6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000 或 35000 或更多个连续或非连续 的核苷酸。
[0009] 在一些实施例中，本发明的分离多核苷酸包括与SEQIDNOs:4-12中任一个的全 部或一部分，或其互补序列至少90%-致（例如，至少91 %、92%、93%或94%-致）、至 少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的核苷酸序列。SEQ N0s:4-12的特征在于编码野生型sAd4287、sAd4310A和sAd4312的纤维蛋白-1、纤维蛋 白-2和六邻体蛋白的核苷酸序列。因此，在一些实施例中，编码纤维蛋白-1的全部或一部 分的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-1的核苷 酸序列（分别对应于SEQIDN0:4、5和6)至少90%-致（例如，至少91%、92%、93%或 94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致。在一 些实施例中，编码纤维蛋白-2的全部或一部分的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、 sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-2的核苷酸序列（分别对应于SEQIDNO:7、8和9)至 少90% -致（例如，至少91%、92%、93%或94% -致）、至少95% -致（例如，至少96%、 97%、98%或99%-致）或100%-致。在一些实施例中，编码六邻体蛋白的全部或一部分 的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的六邻体蛋白的核苷酸序 列（分别对应于SEQIDN0:10、ll和12)至少90%-致（例如，至少91%、92%、93%或 94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致。在一 些实施例中，核苷酸序列可以与一个或多个六邻体蛋白高变区（HVR)(例如，sAd4287六邻 体蛋白（SEQIDN0:10)的HVRl(nt403至nt489)、HVR2(nt520至nt537)、HVR3(nt592 至nt618)、HVR4(nt706至nt744)、HVR5(nt763至786)、HVR6(nt856至nt874)和/ 或HVR7(nt1201至nt1296) ;sAd4310A六邻体蛋白（SEQIDNO:ll)的HVRl(nt403至nt 477)、HVR2(nt505至nt516)、HVR3(nt571至nt591)、HVR4(nt679至nt690)、HVR5(nt 709至735)、HVR6(nt805至nt816)和/或HVR7(nt1144至nt1236);或sAd4312六邻 体蛋白（SEQIDNO:12)的HVRl(nt403至nt474)、HVR2(nt505至nt522)、HVR3(nt577 至nt597)、HVR4(nt685至nt726)、HVR5(nt748至777)、HVR6(nt847至nt864)和/ 或HVR7(nt1192至nt1284)的全部或一部分至少90%-致（例如，至少91%、92%、93% 或94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致。
[0010] 在一些实施例中，本发明的编码一个或多个六邻体蛋白高变区（HVR)的一个或多 个核苷酸序列已经被另一种病毒的序列（例如，sAd4287六邻体蛋白（SEQIDN0:10)的 HVR1(nt403 至nt489)、HVR2(nt520 至nt537)、HVR3(nt592 至nt618)、HVR4(nt706 至nt744)、HVR5(nt763 至 786)、HVR6(nt856 至nt874)和 / 或HVR7(nt1201 至nt 1296)) ;sAd4310A六邻体蛋白（SEQIDN0:11)的HVRl(nt403 至nt477)、HVR2(nt505 至 nt516)、HVR3(nt571 至nt591)、HVR4(nt679 至nt690)、HVR5(nt709 至 735)、HVR6(nt 805 至nt816)和 / 或HVR7(ntll44 至nt1236);或sAd4312 六邻体蛋白（SEQIDN0:12) 的HVR1 (nt403 至nt474)、HVR2(nt505 至nt522)、HVR3(nt577 至nt597)、HVR4(nt 685 至nt726)、HVR5(nt748 至 777)、HVR6(nt847 至nt864)和 / 或HVR7(nt1192 至nt 1284)取代，该另一种病毒的序列被一种或多种其他病毒的相对应HVR序列取代，该一种或 多种其他病毒例如腺病毒，例如相比Ad5具有较低的血清阳性率的腺病毒，如亚组B(Adi1、 八(134^(135和八(150)和亚组0仏(115^(124^(126^(148和4(149)腺病毒以及猿猴腺病毒（例 如，Pan9,也称作AdC68))。在其他实施例中，核苷酸序列包括具有sAd4287、sAd4310A和/ 或sAd4312的以上六邻体HVR中的一个或多个的全部或一部分的取代的Ad5、Adll、Adl5、 Ad24、Ad26、Ad34、Ad48、Ad49、Ad50 或Pan9/AdC68 的腺病毒载体骨架。
[0011] 在一些实施例中，本发明的分离多核苷酸包括与SEQIDNOs: 13-18中任一个的全 部或一部分，或其互补序列至少90% -致（例如，至少91%、92%、93%或94% -致）、至少 95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的核苷酸序列。SEQID NOs:13-18的特征在于编码野生型sAd4287、sAd4310A和sAd4312的纤维蛋白-1和纤维蛋 白-2的knob结构域的核苷酸序列。在一些实施例中，编码纤维蛋白-1的knob结构域的全 部或一部分的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-1 的knob结构域的核苷酸序列（分别对应于SEQIDNO: 13、14和15)至少90%-致（例如， 至少91%、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99% - 致）或100%-致。在一些实施例中，编码纤维蛋白-2的knob结构域的全部或一部分的核 苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-2的knob结构域的 核苷酸序列（分别对应于SEQIDNO: 16、17和18)至少90%-致（例如，至少91 %、92%、 93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97 %、98%或99 %-致）或100% - 致。在一些实施例中，本发明的编码纤维蛋白（例如纤维蛋白-1或纤维蛋白-2)的knob 结构域的一个或多个核苷酸序列（SEQIDNOs: 13-18)已被另一种病毒的序列取代。
[0012] 在第二方面，本发明的特征在于包括本发明的分离多核苷酸的重组载体，这些重 组载体包括与SEQIDN0s:34-51中任一个的全部或一部分至少90%-致（例如，至少 91%、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或 100%-致的核苷酸序列。在一些实施例中，该载体是包括SEQIDN0s:34-39中任一个的 全部或一部分的sAd4297腺病毒载体。在一些实施例中，该载体是包括SEQIDN0s:40-45 中任一个的全部或一部分的sAd4310A腺病毒载体。在一些实施例中，该载体是包括SEQ IDNOs: 46-51中任一个的全部或一部分的sAd4312腺病毒载体。在其他实施例中，SEQID N0s:34-51所示的多于一种（例如，2、3或4种）载体可以用于建立用于生成本发明的重组 腺病毒的质粒系统。
[0013] 在本发明的第一方面或第二方面的一个实施例中，分离多核苷酸和/或重组载体 用于生成重组腺病毒，其中该腺病毒的全部或一部分来源于SEQIDN0s:l-3中的任一个。 在一些实施例中，该重组腺病毒包括一种分离多核苷酸，该分离多核苷酸包括E1区（例如 sAd4287(SEQIDN0:1)的nt4了4 至nt3〇85;sAd4310A(SEQIDN0:2)的nt4了4 至nt 3088 ;sAd4312(SEQIDNO: 3)的nt487至nt3100)中的缺失或El区缺失。使得包括此缺 失的重组腺病毒载体为复制缺陷型的。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒还可以包括E3 区（例如sAd4287(SEQIDN0:1)的nt25973 至nt28596;sAd4310A(SEQIDN0:2)的nt 25915 至nt28496;和sAd4312(SEQIDN0:3)的nt25947 至nt28561)和 / 或E4 区（例 如，sAd4287(SEQIDN0:1)的nt31852 至nt34752;sAd4310A(SEQIDN0:2)的nt31750 至nt34048;sAd4312(SEQIDN0:3)的nt31818 至nt34116)中的缺失或E3 区和 / 或E4 区缺失。在其他实施例中，重组腺病毒包括E1、E3和/SE4区中的一个或多个并且是可复 制型的。
[0014] 根据一个优选实施例，重组腺病毒进一步包括编码感兴趣的抗原性或治疗性基因 产物或其片段的异源核苷酸序列。在一些实施例中，抗原性基因产物，或其片段，包括细菌、 病毒、寄生虫或真菌蛋白，或其片段。
[0015] 细菌蛋白或其片段可以来自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、微小分枝 杆菌、麻风分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球 菌、金黄色葡萄球菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼠疫杆菌、白 喉杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌或炭疽杆菌。来自分支杆菌菌株的优 选基因产物或其片段的实例包括10. 4、85A、85B、85C、CFP-10、Rv3871和ESAT-6基因产物或 其片段。
[0016] 病毒蛋白质或其片段可以来自：逆转录病毒科的病毒，包括人免疫缺陷病毒 (HIV;例如，1型和2型）和人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型（分别是HTLV-1和HTLV-2); 黄病毒科（例如，黄病毒、痕病毒和肝炎病毒属的成员），包括丙型肝炎病毒（HCV)、黄热病 毒；蜱传病毒，如加德格兹谷病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林疾病病毒、兰加特病毒、鄂木 斯克出血热病毒、玻瓦桑病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫 吉病毒、羊跳跃病病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒，如米班病毒、索马里兹礁病毒和秋列尼 病毒；蚊传播病毒，如阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、 日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病 毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑膜炎病毒、恩塔亚病毒、坦布 苏病毒、齐卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病 毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒；以及无已知的节肢动物载体的病毒，如恩 德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔 别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙太拿鼠耳蝠 脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒和细胞融合因子病毒；沙 粒病毒科，包括伊皮病毒、拉沙病毒（例如，约西亚（Josiah)、LP、或GA391株）、淋巴细胞性 脉络丛脑膜炎病毒（LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里 托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里 陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒和卢 约病毒；布尼亚病毒科（例如，汉坦病毒属、内罗病毒属、正本雅病毒属和白龄'病毒属的成 员），包括汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、 庞塔托鲁病毒（PTV)、加利福尼亚脑炎病毒、刚果出血热（CCHF)病毒；纤丝病毒科，包括埃 博拉病毒（例如，扎伊尔、苏丹、象牙海岸、雷斯顿和乌干达株）和马尔堡病毒（例如，安哥 拉、Ci67、莫索科（Musoke)、Popp、Ravn和维多利亚湖（LakeVictoria)株）；披膜病毒科 (例如，甲病毒属的成员），包括委内瑞拉马脑炎病毒（VEE)、东方马脑炎病毒（EEE)、西方 马脑炎病毒（WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒，巴马森林病 毒、奥奈氏病毒和基孔肯亚病毒；痘病毒科（例如，正痘病毒属的成员），包括天花病毒、猴 痘病毒和牛痘病毒；疱疹病毒科，包括单纯疱疹病毒（HSV;1型、2型和6型）、人疱疹病毒 (例如，7型和8型）、巨细胞病毒（CMV)、EB病毒（EBV)、水痘带状疱疹病毒和卡波希氏瘤 相关疱疹病毒（KSHV);正粘病毒科，包括流感病毒（A、B、和C)，如H5N1禽流感病毒或H1N1 猪流感；冠状病毒科，包括严重急性呼吸综合征（SARS)病毒；弹状病毒科，包括狂犬病毒和 水泡性口炎病毒（VSV);副粘病毒科，包括人呼吸道合胞病毒（RSV)、新城疫病毒、亨德拉病 毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒（例如，1、2、3、和 4)、鼻病毒和腮腺炎病毒；小核糖核酸病毒科，包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒（A、B、C、 和D)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；嗜肝脱氧核糖核酸病毒科，包括乙型肝炎病毒；乳头瘤 病毒科，包括人乳头瘤病毒；细小病毒科，包括腺相关病毒；星状病毒科，包括星状病毒；多 瘤病毒科，包括JC病毒、BK病毒和SV40病毒；杯状病毒科，包括诺沃克病毒；或呼肠孤病毒 科，包括轮状病毒。在一个优选实施例中，病毒蛋白或其片段来自人免疫缺陷病毒（HIV)、人 乳头瘤病毒（HPV)、甲型肝炎病毒（HepA)、乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、大天 花、小天花、猴痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒（VZV)、脊髓灰 质炎病毒、狂犬病病毒、日本脑炎病毒、单纯疱疹病毒（HSV)、巨细胞病毒（CMV)、轮状病毒、 流感、埃博拉病毒、黄热病毒或马尔堡病毒。在一个最优选实施例中，来自HIV的病毒蛋白 或其片段是Gag、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu。
[0017] 寄生虫蛋白或其片段可以来自刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原 虫、三日疟原虫、锥体虫属或军团菌属。可以克隆到本发明的载体中的特别优选的寄生虫 蛋白的实例包括那些来自恶性疟原虫的蛋白，如环子孢子（CS)蛋白和肝特异性抗原1或 3 (LSA-1 或LSA-3) 〇
[0018] 真菌蛋白或其片段可以来自曲霉属、皮炎芽生菌、假丝酵母属、粗球孢子菌、新型 隐球酵母、荚膜组织胞浆菌荚膜变种、巴西副球孢子菌、申克孢子丝菌、接合菌属、伞枝梨 头霉、微小根毛霉或少根根霉。真菌基因产物或其片段的实例包括任何细胞壁甘露糖蛋白 (例如，烟曲霉的Afmpl)或表面表达的糖蛋白（例如，粗球孢子菌的SOWgp)。
[0019] 治疗性基因产物或其片段因此可以是干扰素（IFN)蛋白、因子VIII、因子IX、促红 细胞生成素、a-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、生长激素、低密度脂蛋白（LDL)、受 体IL-2受体及其拮抗剂、胰岛素、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白介素、胰岛素样生长因 子、超氧化物歧化酶、免疫应答调节剂、甲状旁腺激素和干扰素、神经生长因子、组织纤溶酶 原激活剂、和/或集落刺激因子，或其片段。
[0020] 本发明的第三方面的特征在于一种通过向患有疾病（例如，HIV或癌症）的受试者 (例如，人类）给予本发明的第二方面的重组sAd腺病毒载体来治疗受试者的方法。在一个 优选实施例中，本发明的重组sAd腺病毒包括抗原性基因产物或其片段，其促进在有暴露 于一种感染物的风险或暴露于感染物的受试者中针对该感染物的免疫反应。在一些实施例 中，感染物是细菌、病毒、寄生虫或真菌，如以上描述的那些。在一个非限制性实例中，向HIV 阳性受试者或患有获得性免疫缺陷综合征（AIDS)的受试者给予本发明的表达HIVGag蛋 白的sAd腺病毒可以在该受试者中刺激针对HIV的免疫反应，从而治疗该受试者。在另一个 实施例中，本发明的重组sAd腺病毒包括一种治疗性基因产物或其片段，如干扰素（IFN)蛋 白或其片段，其通过在患有由非感染物导致的疾病（如癌症）的受试者中刺激针对瘤形成 的有利免疫反应和/或通过提供基因治疗来向该受试者提供治疗，从而治疗该受试者。可 治疗疾病的其他非限制性实例包括任何人类健康疾病，如结核病、麻风病、伤寒症、肺炎、脑 膜炎，葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征（SSSS)、里特病、土拉菌病（兔热病）、布鲁氏菌病、鼻 疽病、腺鼠疫、败血性鼠疫、肺鼠疫、白喉、疫咳（百日咳）、破伤风、炭疽、肝炎、天花、猴痘、 麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、小儿麻痹症、狂犬病、日本脑炎、疱疹、单核细胞增多症、流感、埃 博拉病毒病、出血热、黄热病、马尔堡病毒病、弓形体病、疱疾、锥虫病、军团菌病、曲霉病、芽 生菌病、念珠菌病（鹅口疮）、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞