一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法
【专利摘要】本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤：工程菌发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组人血管内皮抑素的变性纯化、变性重组人血管内皮抑素的复性、复性重组人血管内皮抑素的放置、重组人血管内皮抑素的层析分离。本发明的方法，工程菌发酵过程中可实现在较高菌体浓度下达到高效诱导表达，并在变性重组人血管内皮抑素复性过程中达到较高的复性率，由此实现了重组人血管内皮抑素大规模生产。
【专利说明】一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于重组蛋白的提取纯化领域，具体涉及一种重组人内皮抑素的提取纯化方法。
【背景技术】
[0002]人血管内皮抑素，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。实验表明，内皮抑素对血管内皮细胞、生长的血管可产生抑制作用，可对肿瘤的生长和转移起到较好的抑制作用。从其作用机理来讲，人血管内皮抑素是通过抑制人体内肿瘤组织的血液供应使肿瘤缺乏营养物质和氧气而停止生长、进而逐步萎缩直至死亡的，相较于目前临床普遍使用的化疗药物，具有无明显毒副作用的优点，因而受到了医学界的广泛关注。
[0003]目前，人血管内皮抑素主要是先通过基因重组技术获得携带人血管内皮抑素基因的工程菌，再将工程菌表达目标蛋白经提取纯化而制备得到的。在重组人血管内皮抑素的提取纯化过程中，由于重组人血管内皮抑素工程菌的特性以及人血管内皮抑素结构的特殊性，在重组人血管内皮抑素的工业生产上，普遍存在目标产物得率低的问题。
[0004]具体而言，造成重组人血管内皮抑素产量低的原因主要有以下两方面:(I)为使工程菌表达重组人血管内皮抑素蛋白，需在工程菌发酵时，加入诱导剂进行诱导表达的操作。而现有的诱导表达技术在进行大规模工业生产时，为保证较高的诱导表达量，通常需要耗费大量的培养基、培养液，以保持菌液的菌体浓度处于较低水平，而提高菌体浓度，并同步提高诱导剂用量时，则不仅会由于重组人血管内皮抑素的工程菌对诱导剂的耐受性迅速上升、敏感性显著下降，进而不可避免的出现诱导重组人血管内皮抑素蛋白的表达量下降的现象，无法获得较高的诱导表达量，同时，高浓度的菌体浓度下，也需要浓度较高的培养基、培养液，而菌体在这种环境下必然生长较快，养分易过早耗尽，进而造成菌体过早衰老而自溶，无法获得理想的表达量。无论哪一种情况，均意味着大规模生产中重组人血管内皮抑素的生产效率极低，会造成大量的原料耗费，因而造成最终的目标蛋白收率较低；(2)由于工程菌表达的重组人血管内皮抑素蛋白以包涵体形式存在，所以通常需经过复性才能变成有生物活性的内皮抑素。在复性过程中，重组人血管内皮抑素的二硫键重新形成，其伸展的多肽肽链会由二级结构折叠成三级结构的天然构象，从而使生物活性得以恢复。然而，由于人血管内皮抑素的自然折叠率低，大部分二硫键均需要在复性的过程中形成，而人血管内皮抑素又具有两对二硫键，两对二硫键均需正确配对，才能复性为有生物活性的内皮抑素，加之蛋白质二级结构本身具有可变性，形成正确的二硫键并不容易，错误折叠和聚合往往会造成复性收率较低，因此,实现高的复性收率具有较大的难度。同时，内皮抑素本身呈偏酸性，在中性和碱性环境下活性和溶解性均不稳定、易失活，对环境的敏感性也在一定程度上增加了重组人血管内皮抑素的实现高复性收率的难度，使重组人血管内皮抑素目标产物收率较低。
【发明内容】
[0005]为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种可适用于重组人血管内皮抑素大规模生产，工程菌发酵过程中可实现在较高菌体浓度下达到高效诱导表达、在变性重组人血管内皮抑素复性过程中达到较高的复性收率的重组人血管内皮抑素提取纯化方法。
[0006]本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0007](I)工程菌发酵:将工程菌发酵至发酵液OD6tltl值为10-15，加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37°C下，对工程菌培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养 3-5h ；
[0008]需要说明的是，所述碳源与氮源物质，其选择并不唯一，可提供菌体发酵过程中所需的碳、氮的物质均可。本发明中，优选的，所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。进一步优选的，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L ;所述酵母提取物的浓度为4-6g/L ;所述胰蛋白胨的浓度为10_20g/L ;所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。
[0009]所述工程菌的发酵还包括:取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5-8%接种量，接种至发酵培养基中，再发酵至0D_值10-15。其中，所述LB培养基包括:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L。
[0010](2)工程菌破碎:对步骤I)中得到的发酵液进行洗涤、离心，留沉淀物，向发酵液中加入溶菌酶，在2-8°C下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；[0011 ] 洗涤细菌采用的洗涤液可以是缓冲液，具体的，可以是pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液。
[0012]破碎可采用匀质机在压力200-500pa下破碎，也可采用超声波进行破碎。破碎后，可采用镜检检测细菌破碎率。
[0013](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心，留沉淀物，将沉淀物用含有缓冲剂的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；
[0014]所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸。缓冲液的pH值优选为8.0。
[0015](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:采用变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液；
[0016]优选的，所述步骤(4)重组人血管内皮抑素的变性纯化具体包括，
[0017](4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，稀释所述第一变性缓冲液，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；
[0018](4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。所述第一次变性纯化，以盐酸胍作为变性剂，采用的所述第一变性缓冲液为采用盐酸胍浓度为5-7mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液；所述第二次变性纯化，以尿素作为变性剂，采用的所述第二变性缓冲液为尿素浓度为6-8mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液。
[0019](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:将蛋白浓度为8-10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液加入复性液中，混合均匀，2-8°C下静置至少10h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0020]优选的，每IL的所述复性液包括以下组分:盐酸胍l-2mol ;还原型谷胱甘肽2-3mmol ;氧化型谷胱甘肽0.2-0.3mmol ;络合剂2-8mmol ;所述复性液的pH值为4.0-5.0。
[0021]需要说明的是，在上述组方中，本领域技术人员根据实际情况，还可选择性的添加三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、二硫苏糖醇(DTT)等成分。
[0022]进一步的,每IL所述复性液还包括pH调节剂10_20mmol ;优选的,每IL所述复性液中，包括pH调节剂IOmmol。
[0023]所述络合剂为EDTA ;所述pH调节剂为HAc-NaAc ;当然，本领域技术人员可根据实际情况，适宜性的选择其他络合剂，以达到使蛋白溶液中的金属离子形成络合离子的目的；同样的，所述PH调节剂也不限于HAc-NaAc，还可以是其他弱酸及其盐形成的pH缓冲体系。
[0024]进一步优选的，所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1。
[0025]使用时，所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的体积比为I:(100~200)为宜。
[0026](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23-27 °C下放置5-8天；
[0027]上述放置条件进一步优选的，在所述步骤(6)中，温度为25°C，放置时间为6天。
[0028](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤6)中的复性重组人血管内皮抑素层析洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0029]所述的重组人血管内皮抑素的层析分离可采用离子交换层析与分子筛层析结合的方式。具体为:将复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子层析后得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素的蛋白峰，即得。
[0030]本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点:
[0031](I)本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括工程菌发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组人血管内皮抑素的变性纯化、变性重组人血管内皮抑素的复性、复性重组人血管内皮抑素的放置、重组人血管内皮抑素的层析分离的步骤；
[0032]其中，在工程菌发酵的步骤中，本发明所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，在工程菌发酵至OD6tltl值10-15后，加入诱导剂IPTG，在30-37°C下，培养2.5-3.5h后，再加入诱导剂IPTG。将现有技术中的诱导剂一次性添加改为了分两次添加，可有效的避免由于菌体对诱导剂耐受性上升、敏感性下降而造成的重组人血管内皮抑素的表达量下降。尤其是，IPTG诱导剂在上述两个时机分别以0.2-0.4mmol/L发酵液以及0.1-0.3mmol/L发酵液的用量加入，有效地改善了其诱导效果，同时，结合在第一次加入诱导剂后加入碳源物质及氮源物质，可避免在发酵初期采用高浓度培养基、培养液而造成的菌体过早衰老，也及时补充了菌体所需的养分，保证了两次的诱导剂加入均能实现良好的诱导效果。经实验表明，采用上述方法，可在0D_ 值为10-15的高菌体密度下，实现诱导重组人血管内皮抑素的总表达量达30%以上，满足了重组人血管内皮抑素的大规模生产要求。
[0033]在复性重组人血管内皮抑素的放置的步骤中，将复性后的重组人血管内皮抑素在温度23-27°C下放置5-8天，可更好的使重组人血管内皮抑素形成正确的二硫键，使分子折叠还原为天然正常的空间构象的几率大大提高，大大增加了层析分离后蛋白的获取量；[0034]采用上述方法，可实现毫克级别的重组人血管内皮抑素蛋白的大规模生产，实验表明，本发明的方法可在350L发酵液的规模下，制备得到34g以上的重组人血管内皮抑素，实现90mg/L以上的重组人血管内皮抑素的产量。
[0035](2)本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，在变性重组人血管内皮抑素的复性过程中,采用的复性液为:每IL所述复性液，包括l-2mol的盐酸胍、2-3mmol的还原型谷胱甘肽、0.2-0.3mmol的氧化型谷胱甘肽、2-8mmol的络合剂、10-20mmol的pH调节剂，其PH值为4.0-5.0。在上述组分中，对于盐酸胍的含量控制最为严格，盐酸胍为强变性剂，通常认为不应加入复性液中，而盐酸胍含量过高，会导致复性液功能上趋近于变性液，待复性的重组人血管内皮抑素在其中即使复性，也仅能以极为微量的速度复性。本发明创造性的在复性液中加入了盐酸胍，反向利用了盐酸胍在l-2mol/L的用量下，可起到维持及稳定重组人血管内皮抑素蛋白的二级结构的作用，增大了内皮抑素的两个二硫键正确配对的机会，并且，可显著促进不溶于水的重组人血管内皮抑素的包涵体蛋白在复性液中的溶解，有助于加快复性的进度；与此同时，保证还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽在本发明的用量范围内，可较好的催化二硫键的形成，与盐酸胍的维持、稳定二级结构作用相配合，可较好的实现两对二硫键的正确配对，显著提高复性收率，可更好的保证重组人血管内皮抑素的大规模生产。
[0036]更为优选的，保证所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的用量比为8:1，其催化二硫键形成的效果更为理想。与盐酸胍及其他组分相互配合，可得到优越的复性效果。
【具体实施方式】
[0037]实施例1
[0038]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0039](I)工程菌发酵:取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD6tltl值为12.5，然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及5g/L的氮源物质酵母提取物，在30°C下，培养2.5h，再加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养4h。
[0040]其中，所述发酵培养基由10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、lg/LKH2P04、10g/L葡萄糖组成。
[0041](2)工程菌破碎:将步骤I)中得到的菌液用pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液洗涤，离心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同时加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值为8.0的缓冲液，于温度4°C下搅拌，用匀质机在压力500pa下破碎至镜检细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0042](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用含有20mmol三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；
[0043]在本实施例中，采用该洗涤缓冲液进行搅拌洗涤的具体方法为:采用组分为20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA, pH 值为 8.0 的缓冲液，组分为 20mmol/L Tris-HCl,IOmmoI/L EDTA、2mmoI/L2-ME ( 二巯基乙醇)、0.5v % 的曲通 X-100、pH 值为 8.0 的缓冲液，组分为 2mol/L 尿素、20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、pH 值为 8.0 的缓冲液，组分为 70v%的异丙醇、20mmol/L Tris-HCl, pH值为8.0的缓冲液，组分为20mmol/LTris-HCl、pH值为8.0的缓冲液，分别对沉淀物进行充分搅拌洗涤；
[0044](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:按照以下组分配制第一变性缓冲液、第二变性缓冲液以及稀释缓冲液，备用；
[0045]所述第一变性缓冲液:由6mol/L盐酸胍、10mmol/L 二硫苏糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA, IOmmoI/L Tris-HCl 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0046]所述第二变性缓冲液:由7mol/L尿素、100mmol/L 二巯基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0047]所述稀释缓冲液:由10mmol/L 二硫苏糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 组成，其pH值为8.0 ；
[0048](4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，向其中加入所述稀释缓冲液，稀释至变性剂盐酸胍浓度为2-3mol/L，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；
[0049](4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。
[0050](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制15L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由1.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 组成，pH 值为 5.0。
[0051]将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加所述入复性液中，混合均匀，于4°C下静置18h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0052](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度27 °C下放置5天；
[0053](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤(6)中的复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子交换得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0054]实施例2
[0055]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0056](I)工程菌发酵:首先取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至0D_值为10，然后，加入2.49g的诱导剂IPTG、15g/L的碳源物质葡萄糖、以及6g/L的氮源物质酵母提取物，在34°C下，培养3h，再加入3.75g的诱导剂IPTG，继续培养3h。
[0057]其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、20g/L 葡萄糖组成。
[0058](2)工程菌破碎:将步骤I)中得到的菌液用pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液洗涤，离心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同时加入50mmol/L Tris-HCl、pH值为8.0的缓冲液，于温度2°C下搅拌，用超声波破碎至镜检细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0059](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用含有20mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；[0060]在本实施例中，采用该洗涤缓冲液进行搅拌洗涤的具体方法为:采用组分为20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA, pH值为8.0的缓冲液，对沉淀物进行充分搅拌洗涤；
[0061](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:按照以下组分配制第一变性缓冲液、第二变性缓冲液以及稀释缓冲液，备用；
[0062]所述第一变性缓冲液:由5mol/L盐酸胍、10mmol/L 二硫苏糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA, IOmmoI/L Tris-HCl 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0063]所述第二变性缓冲液:由8mol/L尿素、100mmol/L 二巯基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0064]所述稀释缓冲液:由lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 组成，其 pH 值为 8.0 ；
[0065](4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，向其中加入所述稀释缓冲液，稀释至变性剂盐酸胍浓度为2-3mol/L，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；
[0066](4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。
[0067](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制12.5L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由1.5mol盐酸胍、3mmol还原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 组成，pH 值为 5.0。
[0068]将蛋白浓度为10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液125ml以8ml/min的速度加入12.5L的复性液中，混合均匀，于8°C下静置24h，采用超滤平衡除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素。
[0069](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23 °C下放置8天；
[0070](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤(6)中的复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子交换得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0071]实施例3
[0072]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0073](I)工程菌发酵:取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的8%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD6tltl值为15，然后，向其中加入4.99g的诱导剂IPTG、12g/L碳源物质葡萄糖、以及4g/L氮源物质酵母提取物，在37°C下，培养3.5h，再加入1.25g的诱导剂IPTG，继续培养5h，即可。
[0074]其中，所述发酵培养基由15g/L胰蛋白胨、15g/L酵母提取物、17.5g/L水解酶蛋白、5g/LKH2P04、15g/L葡萄糖组成。
[0075](2)工程菌破碎:将步骤I)中得到的菌液用pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液洗涤，离心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同时加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值为8.0的缓冲液，用匀质机在压力200pa下破碎至镜检细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0076](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用含有20mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；[0077]在本实施例中，采用该洗涤缓冲液进行搅拌洗涤的具体方法为:采用组分为20mmol/L Tris-HCl、IOmmoI/L EDTA、2mmol/L2_ME (二巯基乙醇)、0.5v% 曲通 X-100、pH 值为8.0的缓冲液，对沉淀物进行充分搅拌洗涤；
[0078](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:按照以下组分配制第一变性缓冲液、第二变性缓冲液以及稀释缓冲液，备用；
[0079]所述第一变性缓冲液:由8mol/L盐酸胍、10mmol/L 二硫苏糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、IOmmoI/L Tris-HCl 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0080]所述第二变性缓冲液:由6mol/L尿素、100mmol/L 二巯基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0081]所述稀释缓冲液:由10mmol/L 二硫苏糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 组成，其pH值为8.0 ；
[0082](4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，向其中加入所述稀释缓冲液，稀释至变性剂盐酸胍浓度为2-3mol/L，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；
[0083](4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为9mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。
[0084](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制15L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由1.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 组成，pH 值为 5.0。
[0085]将蛋白浓度为9mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加入15L的复性液中，混合均匀，于5°C下静置100h，采用pH值为4.0的浓度10mmol/L的NaAc溶液为缓冲液，透析除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0086](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度25 °C下放置6天；
[0087](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤(6)中的复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子交换得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0088]实施例4
[0089]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0090](I)工程菌发酵:首先取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵至OD6c?值为12.5，然后，向其中加入诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及15g/L的氮源物质胰蛋白胨，使发酵液中IPTG的浓度为0.3mmol/L，在33°C下，培养2.5h，再加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为
0.2mmol/L,继续培养5h，即可。
[0091]其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、18g/L 葡萄糖组成。
[0092](2)工程菌破碎:将步骤I)中得到的菌液用pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、2mmol/L EDTA溶液洗涤，离心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同时加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值为8.0的缓冲液，于温度4°C下搅拌，用匀质机在压力350pa下破碎至镜检细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0093](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用含有20mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；
[0094]在本实施例中，采用该洗涤缓冲液进行搅拌洗涤的具体方法为:采用组分为2mol/L尿素、20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、pH值为8.0的缓冲液，对沉淀物进行充分搅拌洗涤；
[0095](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:按照以下组分配制第一变性缓冲液、第二变性缓冲液以及稀释缓冲液，备用；
[0096]所述第一变性缓冲液:由6mol/L盐酸胍、10mmol/L 二硫苏糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、20mmol/L NaAc 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0097]所述第二变性缓冲液:由7mol/L尿素、100mmol/L 二巯基乙醇、lmmol/L EDTA、IOmmoI/L Tris-HCl 组成，其 pH 值为 7.0 ；
[0098]所述稀释缓冲液:由12mmol/L 二硫苏糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 组成，其pH值为8.0 ；
[0099](4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，向其中加入所述稀释缓冲液，稀释至变性剂盐酸胍浓度为3mol/L，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；
[0100](4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为9mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。
[0101](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制20L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由1.2mol盐酸胍、3mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、15mmol HAc-NaAc 组成，pH 值为 4.5。
[0102]将蛋白浓度为9mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加入20L的复性液中，混合均匀，再于2°C下静置160h，采用超滤平衡除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0103](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度25 °C下放置7天；
[0104](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤(6)中的复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子交换得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0105]实施例5
[0106]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0107](I)工程菌发酵:取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵至0D_值为12.5，然后，向其中加入诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及20g/L的氮源物质水解酪蛋白，使发酵液中IPTG的浓度为0.2mmol/L,在33°C下，培养2.5h，再加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为
0.lmmol/L，继续培养 5h。
[0108]其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、18g/L 葡萄糖组成。
[0109](2)工程菌破碎:将步骤I)中得到的菌液用pH值为8.0的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、lmmol/L EDTA溶液洗涤，离心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同时加入50mmol/L Tris-HCl、pH值为8.0的缓冲液，于温度4°C下搅拌，用匀质机在压力500pa下破碎至镜检细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0110](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用20mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；
[0111](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:采用含6mol/L盐酸胍、10mmol/L Tris-HCl的第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，向其中加入含2 Ommo I /LTris-HCl的稀释缓冲液，稀释至变性剂盐酸胍浓度为2mol/L，离心，取沉淀物；将得到的沉淀物采用含8mol/L尿素、lOOmmol/L 二巯基乙醇的第二变性缓冲液溶解，离心，除去不溶物，取上清液，调整至蛋白浓度为8mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液；
[0112](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制12.5L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由2mol盐酸胍、2.5mmol还原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、8mmol EDTA、20mmol HAc-NaAc 组成，pH 值为 4.0。
[0113]将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液125ml以8ml/min的速度加入12.5L的复性液中，混合均匀，再于8°C下静置24h，采用超滤平衡除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0114](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23 °C下放置5天；
[0115](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤(6)中的复性重组人血管内皮抑素采用阳离子交换层析柱梯度洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白；然后，采用凝胶层析柱对离子交换得到的重组人血管内皮抑素蛋白洗脱，收集重组人血管内皮抑素的蛋白峰，即得。
[0116]实施例6
[0117]本实施的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤:
[0118](I)工程菌发酵:首先将工程菌在培养基中发酵至0D_值为12.5，然后，向其中加入诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及4g/L的氮源物质酵母提取物、20g/L的氮源物质胰蛋白胨和10g/L的氮源物质水解酪蛋白，使发酵液中IPTG的浓度为0.4mmol/L，在30°C下，培养2.5h，再加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度0.2mmol/L,继续培养5h ；
[0119](2)工程菌破碎将步骤I)中得到的菌液洗涤、离心，留沉淀物，加入溶菌酶，于温度4°C下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0120](3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心后，留沉淀物，将沉淀物用20mmol三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；
[0121](4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:配制变性缓冲液,待用，该变性缓冲液由6mol/L 盐酸狐、10mmol/L 二硫苏糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl 组成，其 pH值为7.0 ;
[0122]采用变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液；[0123](5)变性重组人血管内皮抑素的复性:配制30L复性液待用，该复性液的组成，以IL计，由Imol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、2mmol EDTA、IOmmol HAc-NaAcUOmmol DTT 组成，pH 值为 5.0。
[0124]将蛋白浓度为8mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液100mL加入上述复性液中，混合均匀，5°C下静置12h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；
[0125](6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度27 °C下放置8天；
[0126](7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤6)中的复性重组人血管内皮抑素层析洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
[0127]对比例I
[0128]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(1)为:首先取工程菌在LB培养基中扩增后,按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至0D_值为12.5，然后，然后，一次性向其中加入6.15g诱导剂IPTG，在30°C下，培养5h。所述发酵培养基包括:20g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、23g/L葡萄糖。
[0129]步骤(2)-(7)均与实施例1相同。
[0130]对比例2
[0131]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(1)为:首先取工程菌在LB培养基中扩增后,按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至0D_值为12.5，然后，一次性加入6.15g诱导剂IPTG，13g/L的碳源物质葡萄糖、以及5g/L的氮源物质酵母提取物，在30°C下，培养5h。所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。
[0132]步骤(2)-(7)均与实施例1相同。
[0133]对比例3
[0134]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(1)为:先取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至0D_值为12.5，然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG，在30°C下，培养2.5h，再加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养5h。所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。
[0135]步骤(2)-(7)均与实施例1相同。
[0136]对比例4
[0137]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(1)为:首先取工程菌在LB培养基中扩增后,按发酵体积的6%接种量，接种至规格为50L的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD6tltl值为12.5，然后，加入3.75g的诱导剂IPTG，在30°C下，培养1.5h,加入13g/L的 葡萄糖作为碳源物质、以及5g/L的酵母提取物作为氮源物质,培养Ih,再加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养5h。所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例I相同。
[0138]步骤(2)-(7)均与实施例1相同。[0139]对比例5
[0140]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(5)中，采用的所述复性液，以IL计，由Immol还原型谷胱甘肽、0.1mmol氧化型谷胱甘肽、lmmol EDTA、20mmolHAc-NaAc组成，pH值为5.0。其余均与实施例1相同。
[0141]对比例6
[0142]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(5)中，采用的所述复性液，以IL计，由2mmol还原型谷胱甘肽、0.33mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA>IOmmolHAc-NaAc组成，pH值为5.0。其余均与实施例1相同。
[0143]对比例7
[0144]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(5)中，采用的所述复性液，以IL计，由2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA>IOmmolHAc-NaAc组成，pH值为5.0。以重量记，还原型谷胱甘肽0.61g、氧化型谷胱甘肽0.15g、EDTA1.85g。其余均与实施例1相同。
[0145]对比例8
[0146]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(5)中，采用的所述复性液，以IL计，由6mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.35mmol氧化型谷胱甘肽、5mmolEDTAUOmmol HAc-NaAc组成，pH值为5.0。其余均与实施例1相同。
[0147]对比例9
[0148]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(5)中，采用的所述复性液，以IL计，由0.5mol盐酸胍、2mmol还原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmolEDTAUOmmol HAc-NaAc组成，pH值为5.0。其余均与实施例1相同。
[0149]对比例10
[0150]本对比例的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，步骤(6)具体为:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度4°C下放置7天。其余均与实施例1相同。
[0151]效果实验例
[0152]为说明本发明的技术效果，在采用实施例1-6及对比例1-10中的方法进行操作的过程中，对以下指标进行测定:
[0153]1、发酵诱导表达效果的测定
[0154]1.1实验方法:
[0155]采用实施例1-6以及对比例1-4中的方法进行重组人血管内皮抑素的提取纯化，通过观察发酵过程中菌体量随发酵时间变化情况，评价菌体生长情况，并在发酵表达结束后，采用2010版中国药典中的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定诱导表达后的发酵液中目标蛋白重组人血管内皮抑素占总蛋白的量，记为发酵表达量。
[0156]1.2实验结果:
[0157]表1实施例1-6及对比例1-4的诱导表达测试结果
【权利要求】
1.一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，包括以下 步骤: (1)工程菌发酵:将工程菌发酵至发酵液OD6c?值为10-15，加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37°C下，对工程菌培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h ； (2)工程菌破碎:对步骤I)中得到的发酵液进行洗涤、离心，留沉淀物，向发酵液中加入溶菌酶，在2-8°C下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液； (3)包涵体洗涤:将破碎后的菌液离心，留沉淀物，将沉淀物用含有缓冲剂的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤； (4)重组人血管内皮抑素的变性纯化:采用变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液； (5)变性重组人血管内皮抑素的复性:将蛋白浓度为8-10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋 白溶液加入复性液中，混合均匀，2_8°C下静置至少10h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素； (6)复性重组人血管内皮抑素的放置:将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23-27 °C下放置5-8天； (7)重组人血管内皮抑素的层析分离:将步骤6)中的复性重组人血管内皮抑素层析洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。
2.根据权利要求1所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为12_15g/L;所述酵母提取物的浓度为4-6g/L;所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L ;所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸。
5.根据权利要求4所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)重组人血管内皮抑素的变性纯化具体包括， (4a)第一次变性纯化:采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，稀释所述第一变性缓冲液，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物； (4b)第二次变性纯化:将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。
6.根据权利要求1-5中任一所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述第一变性缓冲液为盐酸胍浓度为5-7mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液；所述第二变性缓冲液为尿素浓度为6-8mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液。
7.根据权利要求6所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，每IL的所述复性液包括以下组分: 盐酸胍l_2mol ； 还原型谷胱甘肽2-3mmol ； 氧化型谷胱甘肽0.2-0.3mmol ； 络合剂2-8mmol ； 所述复性液的PH值为4.0-5.0。
8.根据权利要求7所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，每IL的所述复性液还包括pH调节剂10-20mmol。
9.根据权利要求7或8所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述复性液中，所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1。
10.根据权利要求7-9任一所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于:在所述步骤(5)中，所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的体积比为 I:(100 ~200)。
11.根据权利要求1-10任一所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于:在所述步骤(6)中，温度为25°C，放置时间为6天。
【文档编号】C07K1/14GK103993058SQ201410234509
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】荣志刚, 姚建林, 赵唯一, 黄佩华, 朱浩文, 陈卫, 崔志远, 徐霞 申请人:江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂