包含免疫球蛋白Fc片段的长效人内皮抑素的制作方法

专利名称：包含免疫球蛋白Fc片段的长效人内皮抑素的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品制药技术领域，涉及一种长效重组人内皮抑素的制备方法。
背景技术：
自Folkman于1971年提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”[Folkman J.N Engl J Med 1971 ；285 =1182-1186]的观点以来，人们就把抑制肿瘤血管生成作为一种研究对象。血管内皮抑素(Endostatin)由美国O' Reilly等人于1997年首先发现。O' Reilly等人在试验中发现体外培养的鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的细胞培养液能抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖，他们从这种培养液中提纯出了一种新的蛋白质，并命名为内皮抑素(Endostatin，ES)。经鉴定表明鼠内皮抑素由胶原蛋白XVIII C末端区内184个氨基酸片段构成[O’Reily M S.et al.US 005854205A]。我国徐根兴等人也于当年在研究内皮抑素工作中发现了人的血管内皮抑素，并从人肝脏cDNA文库中筛选克隆得到人体血管内皮抑素基因[徐根兴等，CN1177005A]。内皮抑素的直接作用是通过抑制血管生长而起到抗肿瘤作用，并且不会导致抗药性产生。恩度(Endostar)是我国自主研发的重组人血管内皮抑素(Recombinant HumanEndostatin, rhES),于2005年上市,用于非小细胞肺癌的治疗。它与天然的血管内皮抑素相比，在N端添加了 9个氨基酸序列，提高了生物活性和稳定性。恩度与化疗药物长春瑞宾和顺钼(NP化疗方案)联用有一定的协同作用，可延缓患者的肿瘤进展。但是内皮抑素作为小分子蛋白，性质很不稳定，易于发生酶促降解并被清除，因此在体内的半衰期较短。而且，目前恩度临床用药量很大，在联合NP化疗方案用于治疗初治或复治的III/IV期非小细胞肺癌患者时，注射剂量为7.5mg/m2，每天静脉滴注3_4小时，连续给药14天为一周期。因此，提高rhES的体内半衰期，从而减少治疗剂量，降低患者痛苦以提高患者依从性成为一个急需解决的问题。为了稳定蛋白质、预防酶促降解和被肾脏清除，可以使用诸如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等具有高溶解性的聚合物来化学修饰蛋白质药物的表面。PEG分子具有两亲性，既可以溶于水，又可以溶于大多数的有机溶剂，无毒、无免疫原性，是可用于药物制备的高分子之一。通过与靶蛋白质的特定区域或各种区域结合，PEG能够提高血浆半衰期，增强生物利用度，减低蛋白质免疫原性、提高药物疗效及安全性等。另外，可通过在PEG两端连接同样的蛋白质药物来制备二倍体，以提高蛋白药物的活性。也可以将两种不同的蛋白质药物连接于PEG的两端，得到具有两种活性的药物组合物。
改善蛋白药物的体内半衰期还可以通过用基因重组技术，将药物蛋白的基因与编码具高血清稳定性的蛋白质基因相融合，从而生产融合蛋白药物。例如将蛋白质药物与白蛋白或其片段融合，或者与免疫球蛋白Fe片段融合。研究表明，药物与免疫球蛋白Fe片段融合，可以明显改善药物的体内半衰期。不过，尽管PEG能增强蛋白质的稳定性，PEG偶联也存在一些问题，如降低蛋白生物学活性。此外，随着PEG分子量的提高，其产量也会有所降低等等。通过基因重组产生融合蛋白也具有一些缺点。例如，其导致所产生的融合蛋白的活性显著降低。蛋白质作为生理学功能性物质的活性是由蛋白质的构象决定的。当多肽药物通过重组方法与免疫球蛋白Fe片段融合时，利用原核细胞进行表达，融合蛋白常常发生错误折叠并以包涵体的形式表达；而利用真核细胞表达，免疫球蛋白Fe片段通常会被糖基化，从而可能引起体内的不良免疫应答。融合的接头区也可能对蛋白水解酶的降解作用敏感等等。韩国韩美药品有限公司开发了一种新型长效重组蛋白或多肽药物的技术平台(W02005/047337)，其中公开了一种包含免疫球蛋白Fe片段作为载体的药物组合物可以延长蛋白或多肽药物的半衰期，并提高药物的体内生物利用率。然而，如WO 2005/047337中所记载，其所得重组蛋白或多肽药物最多仅保留约50%的体外细胞学活性。本领域还需要在提高人内皮抑素的稳定性和体内半衰期的同时保留其生物活性，从而提高其生物利用度，减少治疗剂量，并提高患者依从性的长效rhES制剂。

发明内容
本发明的目的是提供一种长效血管内皮抑素制剂，从而增强血管内皮抑素在体内的稳定性，提高其有效血药浓度和生物利用度，并延长半衰期。本发明还提供了制备、分离和纯化长效血管内皮抑素制剂的方法，以及所述长效血管内皮抑素制剂在制备用于治疗癌症的药物中的应用。第一方面，本发明提供了一种长效血管内皮抑素制剂，所述长效重组人内皮抑素是通过聚乙二醇与免疫球蛋白Fe片段共价连接的人内皮抑素分子。本发明中的长效rhES制剂以免疫球蛋白Fe片段作为载体。免疫球蛋白Fe片段是在体内可新陈代谢的生物可降解多肽，因此，将其作为药物载体是安全的。本文中所述的“免疫球蛋白Fe片段”具有本领域技术人员通常理解的含义。具体地，所述的“免疫球蛋白Fe片段”是指包含免疫球蛋白重链恒定区2 (Ch2)和重链恒定区3(Ch3)且不含免疫球蛋白重链和轻链可变区的蛋白质。免疫球蛋白Fe片段可进一步包含位于重链恒定区的铰链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fe片段还可包含重链恒定区I (ChI)和/或轻链恒定区I(Ql)的一部分或全部，只要它具有与天然蛋白基本相似或更好的生理学功能。由于免疫球蛋白Fe片段不包含在抗体亚型之间具有高度非同源性的Fab片段，因此其抗原性大大降低。本发明的免疫球蛋白Fe片段可来自人类或其它动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠，优选来自人类。本发明的免疫球蛋白Fe片段可以是从人类或其它动物分离的天然形式或其衍生物。在本文中，可以通过从人或动物体中分离完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理，从而从天然免疫球蛋白获得Fe片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶处理分离的天然免疫球蛋白，从而获得Fab片段和Fe片段，并对这些片段进行纯化，从而分离出Fe片段。此外，如果需要，也可以 对Fe片段进行衍生化，从而获得Fe衍生物。本文中所述的“Fe片段衍生物”是指具有与本发明Fe片段相同或更高的性能，例如结构稳定性(包括耐热性、PH稳定性)等的衍生物。由Fe片段获得Fe片段衍生物的方法是本领域已知的。例如可以通过化学方式,如磷酸化、甲基化、乙酰化等,或者生物方式,例如突变或重组等方式获得Fe片段的衍生物。由Fe片段获得的Fe片段衍生物也包含在本发明的范围之内。本发明的免疫球蛋白Fe片段还可以由转化的细胞，例如动物细胞或微生物细胞表达而获得。例如，本发明的免疫球蛋白Fe片段可以是得自于微生物的重组人源免疫球蛋白Fe片段。本发明的免疫球蛋白Fe片段可以是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或减少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fe糖链的增加、减少或去除可以通过本领域的常规方法完成，诸如化学法、酶促法和利用微生物的遗传工程方法等，但不限于此。去除免疫球蛋白Fe片段的糖基可导致它与第一补体成分Cl的Clq部分的结合亲和力明显降低，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的降低或丧失，从而不会在体内引起不必要的免疫应答反应。因此，在本发明中优选使用去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fe片段。本文中的术语“去糖基化”或“非糖基化”是指从免疫球蛋白Fe片段除去了糖基部分或以没有糖基化的形式产生的免疫球蛋白Fe片段。此外，免疫球蛋白Fe片段可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe片段，或者通过它们的组合或杂合制备而来的Fe片段。优选的Fe片段来自IgG或IgM，它们是人类血液中最丰富的蛋白质之一。考虑到IgG能延长配体结合蛋白质的半衰期,最优选来自IgG的Fe片段。本文中的术语“组合”是指编码同一来源的单链免疫球蛋白Fe片段的多肽与不同来源的单链多肽连接形成的二聚体或多聚体。例如由IgGlFC、IgG2Fc、IgG3Fc和IgG4Fc片段中的两种或多种片段所形成的免疫球蛋白Fe片段。

本文中的术语“杂合”是指编码不同来源的两种或多种免疫球蛋白Fe片段的序列存在于单链免疫球蛋白Fe片段中。各种类型的杂合体包含在本发明的范围之内。在一个实施方式中，本发明的免疫球蛋白Fe片段可以包含选自CH1，Ch2，Ch3，Ch4结构域中的1_4个结构域。例如，所述免疫球蛋白Fe片段可以包含免疫球蛋白Fe片段的CH1，Ch2，Ch3，和Ch4中的一种或四种结构域。此外，所述免疫球蛋白Fe片段还可以包含铰链区。另一方面，IgG被划分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚型。因此，本发明所述的免疫球蛋白Fe片段可以选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fe片段及其组合和杂合体组成的组。其中，在本发明中优选IgG2和IgG4亚型，最优选IgG4的Fe片段。它几乎不具有诸如CDC等效应器功能。S卩，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fe片段是人IgG4来源的非糖基化Fe片段。本发明中所述的人内皮抑素分子是指由183个氨基酸构成的胶原蛋白XVIIIC末端区片段(氨基酸序列如图1SEQ ID NO:1所示)，基于该片段的重组蛋白或生物活性片段。基于所述人内皮抑素分子的重组蛋白是本领域公知的，例如本发明中使用的人内皮抑素分子可以是含有His-tag的重组人内皮抑素分子。在本发明中，优选使用的人内皮抑素分子可具有如图2所示氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的重组人内皮抑素(rhES)。所述rhES可以由大肠杆菌表达，在这种情况下，其N末端的Met可任选地被删除。就人内皮抑素而言，本发明所述的“生物活性片段”是指由SEQ ID NO:1所示人内皮抑素分子衍生出的任何蛋白片段，前提是该片段保留了 SEQ IDNO:1所示人内皮抑素分子70%以上，优选90%以上的抑制血管生长的活性。本发明中所述的PEG是指聚乙二醇，例如分子量2_5kDa的聚乙二醇。优选使用两端具有醛基功能团的3.4kDa PEG(ALD-PEG-ALD)进行连接，将Fe片段与人内皮抑素组合。更优选地，一个rhES分子与一个Fe片段通过一分子PEG进行连接，两者与PEG的连接位点均为N端。第二方面，本发明提供了所述长效人内皮抑素制剂的制备和纯化方法，所述方法包括以下步骤:首先，通过PEG与人内皮抑素N端α氨基的共价结合和层析纯化，制备单PEG化的人内皮抑素(rhES-PEG)。对于rhES-PEG的制备，可以在反应缓冲液中，将人内皮抑素与PEG混合，并向反应混合物中还原剂氰基硼氢化钠进行反应。反应结束后将产物稀释，经层析纯化获得N末端单PEG化的rhES。具体地，可以在一定pH值(如ρΗ3.5，ρΗ5.5，ρΗ6.5)的醋酸钠反应缓冲液下，将rhES与PEG按一定的摩尔比例(如1: 5，1: 10，1: 15)混合；并向反应混合物中加入终浓度20mM的还原剂氰基硼氢化钠；不同的时长进行反应，如lh，2h，4h，20h。优选地，使摩尔比为1: 15的rhES和PEG，在pH5.5，4°C的条件下反应lh。反应结束后将产物用醋酸钠缓冲液稀释，经Source S层析纯化获得N末端单PEG化的rhES。其次，通过与PEG共价结合，将Fe片段与PEG化的人内皮抑素进一步偶联，再经过层析纯化，制备所述长效人内皮抑素。在获得rhES-PEG后，可以将其与Fe片段在缓冲液中混合，加入还原剂氰基硼氢化钠进行反应。反应结束后将产物稀释，经层析纯化获得经PEG连接的rhES与Fe片段。具体地，在ρΗ3.5，ρΗ5.5或ρΗ6.5的醋酸钠缓冲液中，将rhES-PEG与Fe片段按1: 5，1: 10或1: 15的摩尔比例混合，加入终浓度20mM的还原剂氰基硼氢化钠，并在温和搅拌下4V反应8h，16h或24h。优选地，使摩尔比为1: 15的rhES-PEG与Fe片段，在pH5.5，4°C的条件下反应16h。反应结束后将产物用醋酸钠缓冲液稀释，经Source S层析纯化获得经PEG连接的rhES与Fe片段。经SDS-PAGE和HPLC对产物进行分析鉴定，该聚合物纯度可达97 %以上，为rhES-PEG-Fc产物。因此，本发明成功得到了含有免疫球蛋白Fe片段作为载体的重组人内皮抑素聚合物。第三方面，本发明还提供了所述长效人内皮抑素制剂在制备用于治疗癌症的药物中的应用。本发明的第四方面涉及使用所述长效人内皮抑素制剂治疗癌症的方法。由本发明所述的长效人内皮抑素制剂延长了人内皮抑素的半衰期、提高了人内皮抑素的稳定性和生物利用度，因此，可用于人内皮抑素治疗的各种癌症，包括但不限于乳腺癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、食管癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、膀胱癌、皮肤癌、头颈部癌、支气管肺癌、大肠癌和白血病。优选地，所述癌症为肺癌，最优选非小细胞肺癌。可将本发明的药物组合物与药学 可接受的载体组合配制成各种剂型，包括适于胃肠道或非胃肠道给药的各种剂型。
本发明使用的“药学可接受的载体”是指不干扰所述长效人内皮抑素的生理作用，且对包括人类在内的受试者没有毒性的任何物质。本发明所用药学可接受的载体为本领域技术人员已知的载体。本领域技术人员可以根据实际需要选择适合的载体，并通过本领域已知的方法配制本发明的制齐 。所述制剂包括但不限于片齐 、溶液、悬剂、油剂、乳剂、凝胶、气溶胶、吸入剂、喷雾、胶囊、丸剂、贴剂和栓剂等。本发明所述的长效人内皮抑素制剂在所述药物中的剂量可以在1.5-37.5mg/m2的范围。由于本发明所述的长效人内皮抑素制剂在体内具有很长的作用持续时间，所以可以大大降低所述药物的给药频率。本发明的长效人内皮抑素制剂可以每周给药一次，因此，提高了患者的依从性。对该产物rhES-PEG-Fc进行了体内和体外的生物学活性检测。体外细胞学活性实验结果表明，该聚合物rhES-PEG-Fc的抗内皮细胞迁移活性与未修饰的rhES的活性相近。Fe片段的连接基本没有影响rhES的体外细胞学活性。药物代谢动力学实验结果表明，该聚合物rhES-PEG-Fc的体内半衰期为62.4h，比未修饰的rhES的体内半衰期(2.4h)提高了 26倍。药物效应动力学实验结果表明，rhES-PEG-Fc每周给药1.3mg/kg和4mg/kg组,具有与每天给药4mg/kg的rhES相似的抗肿瘤活性。上述优点表明，rhES经PEG与Fe片段连接后，半衰期显著延长，且保持了抗内皮细胞迁移活性和抗肿瘤活性，从而能够减少给药剂量，降低给药频率。


图1:显示了人内皮抑素氨基酸序列SEQ ID NO:1。图2:显示了 N端添加 了 9个氨基酸的重组人内皮抑素的氨基酸序列SEQ ID NO:2。图3:显示了纯化后rhES-PEG-Fc的SDS-PAGE鉴定图。在图3中，泳道1:非还原的rhES-PEG ;泳道2:非还原的rhES-PEG-Fc ;泳道3:非还原的Fe片段；泳道4:非还原的rhES ;泳道5:非还原的Fe片段；泳道6:还原的rhES-PEG ;泳道7:还原的rhES-PEG-Fc ;泳道8:还原的Fe片段；泳道9:还原的rhES ;泳道10:蛋白分子量标准图4:显示了纯化后rhES-PEG-Fc的RP-HPLC纯度检测结果，其中以99.7%峰面积归一 O图5:显示了 rhES和rhES-PEG-Fc的体内药代动力学曲线。图6:显示了 rhES和rhES-PEG-Fc的体内抗肿瘤活性检测。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明保护范围的限制。实施例1.rhES-PEG的制备将两端具有醛基的3.4kDa聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)与重组人内皮抑素rhES (来自江苏先声麦得津生物制药有限公司，产品批号20100305，序列如图2所示)以15: I的摩尔比例溶于2M醋酸钠缓冲液中，向此混合物中加入终浓度20mM的还原剂氰基硼氢化钠，并在温和搅拌下于4V反应Ih，使PEG与rhES的N末端氨基连接。
采用Source S (购自 GE Healthcare, Source 15S，货号 17-0944-03)纯化反应终产物。将上述反应混合物用50mM，pH6.4的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液20倍稀释后上样。洗脱缓冲液为含有IM NaCl的50mM MES缓冲液，采用梯度浓度洗脱。梯度为在120min内洗脱缓冲液浓度由15%过渡到45%，流速为3ml/min，获得产物的浓度范围是30% -40%。使用分部收集器收集样品并经SDS-PAGE鉴定。结果表明所制得的rhES-PEG为单PEG化的rhES片段。实施例2.rhES-PEG-Fc 的制备将上述实施例1纯化获得的单PEG化rhES与免疫球蛋白Fe片段的N末端做进一步偶联。将Fe片段(由大肠杆菌BL21 (DE3)表达的非糖基化人IgG4Fc片段，NCBI GeneID:3503。得自于北京韩美药品有限 公司)与所述rhES-PEG以15:1的摩尔比例溶于50mM,pH5.5醋酸钠缓冲液中，向此混合物中加入终浓度20mM的还原剂氰基硼氢化钠，并在温和搅拌下在4V反应16h，使所述rhES-PEG与Fe片段的N末端偶联。采用Source S (购自 GE Healthcare, Source 15S，货号 17-0944-03)纯化反应终产物。将上述反应混合物用50mM，pH5.5的醋酸钠缓冲液20倍稀释后上样。洗脱缓冲液为含有IM NaCl的50mM醋酸钠缓冲液。采用梯度浓度洗脱。梯度为在200min内洗脱缓冲液浓度由20%过渡到50%，流速为3ml/min，获得产物的浓度范围是35% -45%。使用分部收集器收集样品，从而分离得到高纯度的rhES-PEG-Fc蛋白质组合物。所得产物用SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。rhES_PEG_Fc的理论分子量约为74kD。Fe片段的分子量约为49kD (泳道3和泳道5)，由两条相同的肽链通过二硫键连接形成。在所述rhES-PEG-Fc还原型电泳中，将Fe片段内的二硫键被打开后应显示两个条带:其中一个条带为连接了 rhES-PEG的单链Fe条带，分子量约为49kD，另一条为单链Fe约25kD的条带(参见泳道7)。图3中显示了所述rhES-PEG-Fc在非还原型电泳中表现为分子量约74kD的单个条带(参见泳道2)。因此，本发明成功制备了 rhES-PEG-Fc。此外，还对所得rhES-PEG-Fc终产物进行了反相HPLC分析，所用仪器为安捷伦1200型，配备C4色谱柱(Vydac 214TP)，梯度为在50min内由5%水/95%乙腈过渡到95%水/5%乙腈，流速为lml/min，柱温设为60°C。所得典型HPLC谱图如图4所示，主峰峰面积占97 %以上，表明所得rhES_PEG_Fc具有很高的纯度。实施例3.rhES-PEG-Fc的体外抗血管内皮细胞迁移活性的测定本实施例中检测了本发明所述的rhES-PEG-Fc对人微血管内皮细胞(HMVEC)的抗迁移活性。将处于对数生长期的HMVEC细胞(购自ATCC，货号CRL-4025)饥饿过夜后，接种8 XlO4个细胞于检测细胞迁移的培养皿Transwell(购自Corning公司，货号为3422)中。Transwell培养皿是一种带有通透性支持物的培养小室，小室底层为一张有通透性的膜，即通透性支持物。本实施例中采用的是带有孔径8.0 μ m的PC膜的Transwell培养皿。分别设阴性对照组(N.C.组，无血清培养基DMEM)，阳性对照组(P.C.组，添加2%胎牛血清FBS和10ng/ml血管内皮生长因子VEGF)和两组加药组(在阳性对照组的基础上分别添加rhES或按照本发明实施例2制备的rhES-PEG-Fc，加药浓度为2.5,5,10，20，40，80，160 μ g/ml。rhES-PEG-Fc组按其所含rhES的量进行计算)。将各组的细胞在37°C孵育4h。随后，取出培养皿，用4%聚甲醛固定细胞15min，刮掉Transwell膜上层的未迁移细胞，用结晶紫对下层细胞染色。最后利用显微镜在相同大小视野下计数细胞，计算半数抑制浓度ED5tlt5计算结果显示，rhES的 ED50 为 36.7 μ g/ml, rhES-PEG-Fc 的 ED50 为 37.3 μ g/ml。因此，本发明的rhES-PEG-Fc保持了 rhES的98.4%的抗内皮细胞迁移活性。实施例4.rhES-PEG-Fc的药代动力学研究 本实施例检测了本发明的rhES-PEG-Fc在大鼠体内的半衰期。将10只雄性SD大鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司，6-8周，180_220g/只)随机分成2组，按4.5mg/kg体重皮下给药。A组为rhES，B组为按照本发明实施例2制备的 rhES-PEG-Fc。在给药后5min、15min、0.5h、lh、l.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、192h、288h取血，血样以肝素抗凝，3000rpm离心15min，得到血浆样品冻存于_80°C，待测。

根据厂商的说明，使用人内皮抑素Quantikine酶联免疫试剂盒(购自R&DSystems，货号DNST0)通过ELISA夹心法测定血浆中样品的rhES含量。结果见图5。rhES的半衰期T1/2为2.4h，浓度-时间曲线下面积AUC为8.61 μ g.Vml，达到最大浓度的时间Tmax为1.63h，最大浓度Cmax为2026.15ng/ml。与rhES相比，rhES-PEG-Fc的体内半衰期 T1/2 为 62.4h，AUC 为 894.05 μ g.h/ml，Tmax 为 24.00h, Cmax 为 6644.33ng/ml。由以上试验结果可见，与rhES相比，本发明rhES-PEG-Fc的体内半衰期提高了 26倍。并且，根据所测定的AUC数据，本发明rhES-PEG-Fc的生物利用度比rhES提高了 100倍以上。实施例5.rhES-PEG-Fc的体内抗肿瘤活性研究本实施例中测试了本发明的rhES-PEG-Fc对人肺癌细胞A549的体内抑制活性。实验材料选用雌性BALB/c裸鼠(购自北京大学医学部实验动物部，6_8周，18-25g/只)，分别接种2 X IO6个人肺癌细胞A549 (购自ATCC，货号CCL-185)于裸鼠左侧胸腔内。待瘤体积长至100-300mm3时，进行随机分组，8只/组，并开始给药。分别设定阴性对照组(醋酸钠缓冲液，NaAC)、阳性对照组(rhES 4mg/kg体重，每天给药，连续给药14天)、两组给药组(以按照本发明实施例2制备的rhES-PEG-Fc分别给药1.3mg/kg和4mg/kg体重,每周给药一次,连续给药两周。按rhES-PEG-Fc中所含rhES的量进行计算)。给药方式为皮下注射。自给药日起每天测量肿瘤体积直至第28天，计算公式为:肿瘤体积(mm3) = (aXb2)/2(a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径)。结果见图6。实验结果显不:rhES-PEG-Fc每周给药1.3mg/kg和4mg/kg组,具有与阳性对照组(每天给药rhES 4mg/kg)相似的抗肿瘤活性。本发明rhES-PEG-Fc的可大大降低用药剂量，同时保持同样的抗肿瘤效应。由此可见，本发明提供了完全保持了 rhES的抗内皮细胞迁移活性，并且具有更好稳定性和生物利用度和更长体内半衰期的rhES-PEG-Fc，从而大大降低用药剂量。以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方式
。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的， 均应落入本发明权利要求书的范围。
权利要求
1.一种长效人内皮抑素，其特征在于，所述长效人内皮抑素是通过聚乙二醇与免疫球蛋白Fe片段共价连接的人内皮抑素分子。
2.如权利要求1所述的长效人内皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是非糖基化的。
3.如权利要求1或2所述的长效人内皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是IgG4的Fe片段。
4.如权利要求1 3中任一项所述的长效人内皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为2 5kDa。
5.如权利要求1 4中任一项的长效人内皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子两端具有醛基功能基团。
6.如权利要求5中所 述的长效人内皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子是两端具有醛基功能团的3.4kDa聚乙二醇。
7.权利要求1-6中任一项所述的长效人内皮抑素，其特征在于:所述药物组合物是通过聚乙二醇将人内皮抑素的N端α氨基与免疫球蛋Fe片段的N端通过共价键连接。
8.权利要求1-7中任一项所述的长效人内皮抑素在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述癌症是肺癌。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
全文摘要
本发明涉及一种长效人内皮抑素。所述长效人内皮抑素是通过聚乙二醇与免疫球蛋白Fc片段共价连接的人内皮抑素分子。本发明还公开了所述长效人内皮抑素的制备和纯化方法，以及所述长效人内皮抑素在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
文档编号C07K17/08GK103172745SQ20111043322
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者张世奇, 刘家望, 杜伯雨, 马玉芬, 杨亚平, 李永平, 周筠, 连忠辉, 文圣焕 申请人:北京韩美药品有限公司