专利名称：包含用于治疗自身免疫疾病的基因的重组肽载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含用于治疗自身免疫疾病的基因的重组肽载体。更具体地，本发明涉及一种重组肽载体(图1)，该载体包含前导肽、接头DNA和DNA构建体，该构建体是通过将表达控制序列与编码融合蛋白的治疗性基因可操作性地连接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域与免疫球蛋白的Fc片段相结合，其中所述前导肽通过所述接头DNA连接到所述DNA构建体的两个末端。另外，本发明还涉及所述重组肽载体的制备方法，以及用于治疗自身免疫疾病，尤其是系统性红斑狼疮的组合物，该组合物包含药学有效量的所述重组载体和药学可接受的载体。
背景技术：
系统性红斑狼疮(或狼疮)是一种自身免疫疾病，其可引起非腐蚀性多关节炎、肾小球性肾病、溶血性贫血、血小板减少症、中性粒细胞减少症、多肌炎、持续性/阵发性发热和面部/粘膜与皮肤的皮炎等症状。
狼疮在不同的患者会表现出不同症状并且显示出从轻微到严重的各种症状，因此，应该根据其症状而进行适当的治疗。对于皮肤症状或关节炎，通常使用抗疟制剂，并且当需要抗炎症作用时，有时会使用少量的肾上腺皮质激素。对于肾病或诸如严重的血小板减少症或中风等严重症状的治疗，要使用高剂量的肾上腺皮质激素或免疫抑制剂。最近，除了所述现有的常规疗法之外，还尝试使用利用能够抑制免疫应答的天然或人工构建的基因的基因疗法。
对于所述的基因疗法，主要使用病毒载体来将具有治疗作用的基因转到细胞中。然而直到目前为止，虽然已经开发了各种病毒载体，并已经对所述载体进行了临床试验，但是由于病毒特性而使所述病毒的使用受到限制。病毒结合到细胞膜中的特定配体，从而进入细胞中。因此，能够被感染的细胞由于病毒能够结合的配体的种类而受到限制。因此，可应用病毒载体来防治的疾病不可避免地受到了限制。
病毒载体使用受限的另一个重要原因是当病毒进入活体时，所有病毒都会引起宿主的免疫反应(在急性情况中的炎症反应和慢性情况中的针对载体的抗体的产生)，尽管在反应程度上有所不同。因此，会造成因免疫应答所引起的病毒的大量损失并产生针对载体的抗体，因而使载体在二次接种中具有缺陷性(再次施用它们时没有效果)。另外，根据病毒的种类，还存在诸如毒性、治疗性基因的大小、体内持续时间以及整合到宿主细胞的染色体中等问题。由于这些原因，尽管从病毒因子被证明可用于基因疗法起已过去了20年，但是病毒载体在临床使用中还非常有限。
因此，本发明人此前已经开发了克服上述所有问题的非病毒性肽载体(专利申请韩国10-2001-6587；美国10/071,476；日本2002-032708；中国02104729.4和欧洲02002623)，并将该载体用来转移特定的治疗性基因。
同时，自身免疫疾病涉及T细胞的激活。作为用于自身免疫疾病的治疗性基因，可以考虑能够基本抑制T细胞的激活的基因。
对于T细胞的激活，通常需要两种由抗原呈递细胞(APC)提供的信号。第一种信号通过T细胞受体/CD3复合体和由APC的主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的抗原所介导。所述信号诱导能识别MHC/抗原复合体的特定T细胞的激活。第二种信号也称为共刺激信号并诱导T细胞的增殖。该信号通过APC的B7所介导。B7是具有在T淋巴细胞上表达的两个配体CD28和CTLA-4的反受体。称为CD28的第一个配体在T细胞膜上组成性表达，并在与B7结合后，诱导IL-2分泌和T细胞的增殖。称为CTLA4的第二个配体与CD28同源，并在T细胞激活之后表达。B7对CTLA4的亲和性比对CD28的亲和性高20倍，因而CTLA4抑制T细胞的激活。因此，CTLA4蛋白可以是抑制B7:CD28共刺激途径的最有效物质。
发明内容
因此，为了使用CTLA4作为治疗性基因，本发明人构建了这样的治疗性基因，其中CTLA4的胞外域(B7结合域)结合到免疫球蛋白的一部分，使CTLA4进行二聚，同时延长了该蛋白在体内施用后的半衰期。本发明人还发现，使用含有所构建基因的本发明肽载体，表现出抗自身免疫疾病的治疗效果，并完成了本发明。
因此，一方面，本发明提供一种重组肽载体，该载体包含前导肽、接头DNA和DNA构建体，该构建体是通过将表达控制序列与编码融合蛋白的治疗性基因可操作性地连接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域与免疫球蛋白的Fc片段相结合，其中所述前导肽通过所述接头DNA连接到所述DNA构建体的两个末端。
另一方面，本发明提供制备重组肽载体的方法，该方法包括以下步骤(1)将编码CTLA4的胞外域的基因与编码免疫球蛋白的Fc片段的基因连接，从而制备治疗性基因；(2)可操作性地连接所述治疗性基因和表达控制序列，从而制备DNA构建体；(3)合成前导肽和接头DNA，然后将前导肽和接头DNA连接在一起，从而制备肽载体；和(4)通过接头DNA将步骤(2)中得到的DNA构建体的两个末端与所述前导肽连接。
另一个方面，本发明提供用于治疗自身免疫疾病的组合物，该组合物包含药学有效量的所述重组肽载体和药学可接受的载体。
本文使用的术语“自身免疫疾病”是指因对机体内自身抗原产生免疫应答而引起的疾病。自身免疫疾病是在人体整个系统中发生的疾病，其例子包括诸如牛皮癣、特应性皮炎、溃疡性口炎和系统性红斑狼疮等皮肤病；I型糖尿病(也称为儿童糖尿病)；诸如慢性甲状腺炎等内分泌系统疾病；诸如再生障碍性疾病等造血性系统疾病；诸如肝炎、原发性肝硬化、溃疡性结肠炎或克罗恩病等消化系统疾病；诸如哮喘、硅肺病或石棉沉着病等呼吸系统疾病；和诸如免疫球蛋白肾病或球菌感染后肾小球肾炎等肾病。此外，以后认为是自身免疫疾病的所有疾病均包括在本发明治疗的疾病对象中。
I.治疗性基因和肽载体本文使用的术语“治疗性基因”是指为自身免疫疾病的彻底恢复、抑制和减轻而施用的基因。具体地，术语“治疗性基因”是指编码通过将CTLA4的胞外域结合到免疫球蛋白Fc片段的铰链上而形成的融合蛋白(也称为CTLA4-Ig)的基因。
本文使用的术语“胞外域”是指相对于跨膜域暴露在细胞外的区域，所述跨膜域由定位于磷脂组成的细胞膜中的膜蛋白中的疏水氨基酸组成。所述胞外域主要含有亲水氨基酸，并折向蛋白表面，因而可溶于水溶液。在大多数的细胞表面受体蛋白中，胞外域具有结合配体的功能，而胞内域具有胞内信号转导的功能。
本文使用的术语“免疫球蛋白”是指由B细胞产生的蛋白分子，其起到B细胞的抗原受体的作用而特异性识别各种抗原。该分子具有Y型结构，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。轻链和重链均含有可变区和恒定区。四条链由位于重链的柔性铰链区的二硫键结合在一起。轻链和重链中的可变区相互结合，而形成两个相同的抗原结合域。根据免疫球蛋白的重链恒定区可将它们分为五类A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。所述五类称为同型，并具有独特结构特性和不同的生物学性质。例如，IgG在Fc结构上与其它同型稍有不同。此外，IgG和IgA被分为许多亚型。例如，人类IgG同型被分为四个亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它们分别具有γ1、γ2、γ3和γ4重链。免疫球蛋白分子的功能，例如补体激活、与吞噬细胞-Fc受体的结合以及抗原依赖性细胞毒性均由重链的Fc片段中存在的结构决定簇介导。重链的该Fc片段用作本发明的重组肽载体的组分，并且可以来自所有上述类型或亚型的免疫球蛋白。
本文使用的术语“免疫球蛋白Fc片段”是指功能性划分的免疫球蛋白片段中的片段，该片段不具有抗原结合能力，但是容易进行结晶，并通过使铰链区与CH2和CH3结构域结合而形成，是在抗体中涉及与有效物质和细胞结合的部分。与本发明有关提到的所述Fc片段可能不同于一些文献所述的片段，而是包含铰链区，该术语的使用只是为了便于描述本发明，参照本发明的说明书及所附附图，该术语会得到本领域技术人员的充分理解。
同时，如本领域所公知的，为了提高治疗性基因在导入重组肽载体的细胞(或靶细胞)中的表达水平，治疗性基因必须可操作性地连接到在靶细胞中具有功能的转录和翻译表达控制序列上。特别是由于特征性地用于本发明的肽载体没有包含独立的控制序列，因此优选将治疗性基因可操作性地连接到表达控制序列上以形成“DNA构建体”，然后该DNA构建体被导入到肽载体中来制备。在另一个实施方式中，本发明的重组肽载体还可以通过将表达控制序列与肽载体连接，然后将治疗性基因导入所得的肽载体结构中。本文使用的术语“DNA构建体”是指通过将表达控制序列可操作性地连接到本发明的治疗性基因上而形成的DNA产物。
本文使用的术语“表达控制序列”是指对本发明的治疗性基因的表达必要或有益的核苷酸序列。各表达控制序列相对于编码融合蛋白的核苷酸序列可以内源的也可以是外源的。所述表达控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游激活序列、信号肽序列和转录终止子。在本发明中，表达控制序列优选包括启动子、信号肽序列和聚腺苷酸化序列。也可以选择性地包括其它控制序列，以进一步提高本发明的治疗性基因的表达水平。
对于本发明的治疗性基因的表达，只要适合于指导在哺乳动物细胞中的表达，任意表达控制序列都可以使用。所述控制序列的例子包括SV40和腺病毒的早期启动子和后期启动子(例如腺病毒主要后期启动子)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子、人巨细胞病毒(CMV)早期基因、人延长因子1α(EF-1α)、果蝇小热激蛋白70启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子、人泛素C(UbC)启动子、人生长激素转录终止子、腺病毒Elb区聚腺苷酸化序列和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列。
本文使用的术语“信号肽序列”是指诱导表达后的蛋白运输到细胞膜外的氨基酸序列。通常，运输到细胞膜外的表面蛋白或分泌蛋白具有被细胞膜中的信号肽酶切割的N末端序列。作为本发明中的信号肽序列，适合于指导哺乳动物细胞中的分泌的任何序列都可以使用。优选来自同种或相关种的分泌蛋白的信号肽序列。可以使用但不限于hG-CGF、鼠免疫球蛋白κ轻链或人制瘤素M的信号肽序列。
本文使用的术语“可操作性地连接”是指将核酸与另外的核酸序列置于在功能上具有关系的状态。这可以是相互连接的基因和控制序列以这样的方式，使得当适当的分子(例如转录激活子蛋白)被结合到控制序列时，该基因的表达变得可行。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么该启动子将可操作性地与该序列结合。通常，术语“可操作性地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中，是相邻的且在阅读框内。所述序列的连接是通过在适当的限制酶位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
同时，本文使用的术语“载体”是指能够将治疗性基因稳定地携带入靶细胞中的载体。术语“肽载体”包括由本发明人提交、公开的公布号为10-2001-0053621(名称为“肽载体”)的韩国专利中公开的载体并由肽和DNA的复合体组成。“重组肽载体”是指包含通过可操作性地连接表达控制序列和治疗性基因而形成DNA构建体的肽载体，使得该治疗性基因可以在靶细胞中表达。
在本发明中，用以将治疗性基因携带到细胞中的肽载体通常由(1)前导肽和(2)接头DNA构成。
前导肽起到通过细胞膜进入细胞的作用。具体地，前导肽可以具有附着到N末端胺基团的乙酰基，以消除与其它分子的活性，并在C末端可以具有Cys，以通过二硫键结合接头DNA。
根据本发明，肽载体可以包含由16个氨基酸构成的前导肽。由16个氨基酸构成的本发明的前导肽可以以不同的实施方式提供。第1位氨基酸至第4位氨基酸起到易于渗透到细胞膜的磷脂中的作用，并可以选自带有非极性脂肪族侧链的氨基酸，例如Gly、Als、Val、Leu和Ile。第5位氨基酸和第6位氨基酸可以起到支持所述4个氨基酸在渗透到细胞膜中时保持处于稳定的渗透状态的作用，并可以选自带有非离子极性侧链的氨基酸，例如Asn、Gln、Ser和Tyr。第7位氨基酸可以起到上述6个氨基酸和随后9个氨基酸的间隔子的作用，并且它虽然可以是除了酸性氨基酸(Asp和Glu)以外的任意氨基酸，但是特别优选为Gly。第8位氨基酸至第12位氨基酸起到提供吸引力的作用，即它们可以通过与细胞膜内的负电荷的相互作用而被驱动到细胞中，并且它们可以选自带有碱性侧链的氨基酸，例如Lys、Arg和His。考虑到细胞膜的间隔，第13位氨基酸起到间隔子的作用，因此可以是除了酸性氨基酸之外的任意氨基酸，但是Gly是优选的。第14位氨基酸和第15位氨基酸可以是任意氨基酸。
在一个优选的实施方式中，前导肽可以具有以下氨基酸序列AC-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO21)对应于SEQ ID NO21的氨基酸序列，前导肽序列包括以下所有的氨基酸序列其中(1)第2位的Leu被Ile取代，(2)第4位的Ile被Leu取代，(3)第10位的Lys被Arg取代，(4)第11位的Arg被Ile取代，或(5)第13位的Gly被Leu、Ile、Arg或Gln取代。
接头DNA起到将前导肽连接到本发明的DNA构建体的中介体的作用，其可以由15～18个核苷酸组成，并可以具有不同的碱基序列。在一个优选的实施方式中，接头DNA可以具有以下碱基序列接头-1DNA5’-Cys-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(SEQ ID NO22)接头-2DNA3’-GAT-TAT-GCT-GAG-TGA-T- -5’(SEQ ID NO23)肽载体的形成，即前导肽与接头DNA的连接，可以通过前导肽的C末端Cys与接头-1DNA的5’末端的Cys之间的二硫键来实现。在这种情况中，接头-2DNA和前导肽没有通过任何共价键相互连接，但是因为接头-2DNA和接头-1DNA由于互补碱基序列退火在一起，因此前导肽和接头DNA(接头-1DNA和接头-2DNA)可以相互连接。在这样的连接状态中，前导肽和接头-2DNA之间存在缺口。
随后，重组肽载体的形成，尤其是肽载体与5’末端磷酸基团已经去除了的本发明DNA构建体的连接，可以通过肽载体的接头-2DNA的5’末端的磷酸基团 和DNA构建体的3’末端的羟基(OH)之间的磷酸二酯键来实现。在这方面，接头-2DNA和前导肽虽然没有任何共价键连接，但是由于接头-2DNA和接头-1DNA通过互补碱基序列退火在一起，因此前导肽和接头DNA(接头-1DNA和接头-2DNA)可以相互连接。在这样的连接状态中，前导肽和接头-2DNA之间存在缺口。此外，由于在DNA构建体的两个末端都形成磷酸二酯键，因此最终完成其中前导肽通过接头DNA连接到所述DNA构建体两个末端的重组肽载体。
通过这种特异性连接制备的重组肽载体允许本发明的DNA构建体在被导入细胞核中时易于与肽载体分离。
II.制备方法在另一方面，本发明提供制备重组肽载体的方法，该方法包括以下步骤(1)将编码CTLA4的胞外域的基因与编码免疫球蛋白的Fc片段的基因连接，从而制备治疗性基因；(2)可操作性地连接所述治疗性基因和表达控制序列，从而制备DNA构建体；(3)合成前导肽和接头DNA，然后将前导肽和接头DNA连接在一起，从而制备肽载体；和(4)通过接头DNA将步骤(2)得到的DNA构建体的两个末端与所述前导肽连接。
在本发明的制备方法中，步骤(1)、(2)和(3)可以以任意顺序独立进行。此外，如上所述，所述制备还可以通过将表达控制序列与肽载体连接，然后将治疗性基因与所得的肽载体结构进行连接而实施。
下文将对制备重组肽载体的各步骤进行描述。
(1)制备治疗性基因的步骤治疗性基因可以通过以下步骤制备(a)制备编码CTLA4的胞外域的各基因和编码免疫球蛋白的Fc片段的基因，(b)通过PCR，将相同的限制酶识别序列插入到所制备的编码CTLA4的胞外域的基因和所制备的编码免疫球蛋白的Fc片段的基因中，(c)用与限制酶识别序列相对应的限制酶切割CTLA4的胞外域编码基因和免疫球蛋白的Fc片段编码基因的限制酶识别序列；和(d)通过连接酶将两条DNA的切割部分连接在一起，从而制备其中CTLA4的胞外域连接到免疫球蛋白的Fc片段上的治疗性基因。
在一个实施方式中，编码CTLA4的胞外域的基因和编码免疫球蛋白的Fc片段的基因可以通过使用编码CTLA4胞外域编码基因或免疫球蛋白Fc片段编码基因的两个末端的寡核苷酸作为引物，在从欲处理的物种(优选单个体的)的细胞中分离的模板mRNA上进行RT-PCR而容易地获得。
在一个实施方式中，所述基因还可以通过本领域已知的任意标准方法，例如使用自动DNA合成仪(从Biosearch，Applied Biosystems等商购获得)来合成。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein等(Nucl.Acids Res.163209(1988))所描述的方法合成。膦酸甲酯寡核苷酸可以通过使用可控孔度玻璃聚合物支持物来制备(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451(1988))。
(2)本发明DNA构建体的制备步骤在本发明中，优选将所制备的治疗性基因可操作性地连接到表达控制序列上而形成DNA构建体，并将该DNA构建体导入到肽载体中。这些序列的连接通过在适当的限制酶切位点上进行连接而实施。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡核苷酸衔接子或接头。为了可操作性地进行连接，期望以特定的顺序和方向来对DNA片段进行连接。
DNA可以用某些限制酶在适当的缓冲液中进行切割。通常，在20μl的缓冲溶液中，使用约0.2μg～1μg的DNA片段和1～2单位的相应限制酶。适当的缓冲液、DNA浓度、培养时间和温度可以由限制酶制造商规定。通常适合于在37℃培养约1小时～2小时，但有些酶需要较高的温度。培养后，通过用酚和氯仿的混合物对消化溶液进行提取来去除酶和其它杂质，且经消化的DNA用乙醇沉淀，并从水层中收集。
通过电泳按照大小来分离和选择切割的DNA片段。DNA可以在琼脂糖或聚丙烯酰胺基质上电泳。基质的选择取决于所要分离的DNA片段的大小。电泳后，DNA通过电洗脱从基质中提取，或者当使用低熔点的琼脂糖时，可以融化琼脂糖，从中提取DNA。
将欲连接在一起的DNA片段以等摩尔量加到溶液中。所述溶液通常含有ATP、连接酶缓冲液和连接酶，例如T4连接酶(每0.5μg的DNA约10个单位)。为了将DNA片段连接到载体上，该载体可以通过用适当的限制酶切断以进行线性化，然后用碱性磷酸酶和牛小肠水解酶进行处理。所述磷酸酶处理可以防止载体在连接过程中发生自连接。
在本发明DNA构建体的制备方法的一个实施方式中，本发明的治疗性基因被可操作性地连接到表达载体的表达控制序列上，所述表达载体已知在哺乳动物中有效地指导表达。然后，以这样的方式用适当的限制酶切割经连接的基因结构体，使得切割片段含有治疗性基因和可操作性地连接到治疗性基因上的表达控制序列。用这种方式，可以容易地获得本发明的DNA构建体。
(3)肽载体的制备步骤前导肽(本发明的肽载体的组分)可以通过生物化学领域技术人员公知的化学合成方法容易地制备(Creighton，ProteinsStructures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY(1983))。典型的方法包括但不限于液相或固相合成、片段缩合和F-MOC或T-BOC化学法(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，Williams等编著，CRC Press，Boca Raton Florida，(1997)；A Practical Approach，Atherton和Sheppard编著，IRL Press，Oxford，英格兰，(1989))。
根据常规的固相法，本发明的前导肽可以以C末端、第1位氨基酸、第2位氨基酸、第3位氨基酸等的顺序在经保护的氨基酸之间进行缩合反应来合成。在缩合反应之后，可以通过已知方法，如酸解或氨解除去保护基团和连接到C末端氨基酸的载体。上述肽合成方法在文献中有描述(Gross和Meienhofer的The Peptides，第2卷，Academic Press(1980))。
可用于本发明肽的合成的固相载体为生物化学领域中的常用载体，其典型的例子包括但不限于取代苄基型的聚苯乙烯树脂、羟基甲基苯基乙酰胺型的聚苯乙烯树脂、取代的二苯甲基聚苯乙烯树脂和具有能够结合到肽上的官能团的聚丙烯酰胺树脂等。
在常规的肽合成中使用最初的经保护的氨基酸的保护基团，并且容易地将其通过常规方法，例如酸解、还原或氨解予以去除。氨基保护基团的具体例子包括甲酰基；三氟乙酰基；苄氧基羰基；取代的苄氧基羰基，例如邻氯苄氧基羰基或对氯苄氧基羰基和邻溴苄氧基羰基或对溴苄氧基羰基；以及脂肪族氧羰基，例如叔丁氧羰基和叔戊氧羰基。氨基酸的羧基可以通过转换成酯基进行保护。所述酯基包括苄基酯；取代的苄基酯，如甲氧基苄基酯；以及烷基酯，如环己基酯、环庚基酯或叔丁基酯。胍基不需要保护基团，但是可以用硝基、甲苯磺酰基或诸如甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基等芳基磺酰基进行保护。咪唑的保护基团包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基等。色氨酸的吲哚基不需要保护基团，但是可以用诸如甲酰基等保护基团进行保护。
肽与保护基团和载体的分离可以在各种清除剂存在的情况下通过无水氢氟化物来实现。清除剂的例子包括苯甲醚、邻甲酚、间甲酚和对甲酚、二甲基硫化物、硫代甲酚、乙二醇和巯基吡啶，这些物质常用在肽合成中。
作为本发明肽载体的其它部分的接头DNA，可以通过本领域已知的任意标准方法，例如使用自动DNA合成仪(从Biosearch，AppliedBiosystems等商购获得)来合成。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein等(Nucl.Acids Res.163209(1988))所描述的方法合成。膦酸甲酯寡核苷酸可以通过使用可控孔度玻璃聚合物支持物来制备(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451(1988))。
如此制备的前导肽和接头DNA可以通过以下方法相互连接通过二硫键将前导肽连接到接头-1DNA上，将接头-2DNA加到所连接的结构上，并通过碱基配对使接头-1DNA和接头-2DNA退火。在这种情况中，前导肽和接头DNA之间的二硫键可以在pH约为10的碱性条件下形成，其中优选加有诸如DTT(二硫苏糖醇)等抗氧化剂。这是因为抗氧化剂起到防止蛋白氧化、保护酶等的活性的作用并可以保护所形成的二硫键和在随后连接时维持酶的活性。然后，接头-1DNA和接头-2DNA之间的退火可以通过使它们保持在50℃(适合于退火的温度)来实现。
(4)连接本发明DNA构建体与肽载体的步骤在将步骤(1)中制备的本发明的DNA构建体与步骤(2)中制备的肽载体连接前，优选用磷酸酶处理DNA构建体，以去除5’末端的磷酸基团。这使DNA构建体不能与接头-1DNA的3’末端的羟基反应或结合。当去除了磷酸基团的DNA构建体与肽载体混合时，向该混合物中加入适当的连接酶，DNA构建体与接头DNA将通过接头-2DNA的5’末端的磷酸基团和DNA构建体的3’末端的羟基之间的磷酸二酯键连接在一起。在这种情况中，由于3’末端的羟基位于DNA构建体的两个末端，前导肽将最终通过接头DNA连接到所述DNA构建体的两个末端。
III.药物组合物本发明提供用于治疗自身免疫疾病的组合物，该组合物包含治疗有效量的重组肽载体和药学可接受的载体。
包含在本发明组合物中的药学可接受的载体常用于制剂中，其例子包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。本发明的组合物可以另外包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等。
本发明的药物组合物可以通过基因疗法中常用的途径施用。该药物组合物优选通过肠胃外途径施用，例如静脉内、腹内、肌肉内、皮下或局部施用途径施用。
本发明的药物组合物的适当剂量根据许多因素而变化，所述因素如配制方法，施用方式，患者的年龄、体重、性别、疾病的严重程度、饮食、排泻和反应敏感性，以及施用时间和施用途径。普通技术医师可以容易地确定和规定对所需治疗有效的剂量。例如，本发明的药物组合物中的重组肽载体可以以1μg/kg/天～100μg/kg/天的剂量施用。
包含本发明的重组肽载体的药物组合物可以按照本发明技术领域的技术人员能够容易地完成的方法，用药学可接受的载体和/或赋形剂配制成单剂量形式或者多剂量包装中的产品。所得制剂可以是在油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液，以及提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊等形式，并可以另外包含分散剂或稳定剂。
为了提高在室温的稳定性、减少对昂贵的低温贮藏的需要并延长保存期，可以对包含本发明的重组肽载体的药物组合物进行冷冻干燥。冷冻干燥过程可以包括以下连续步骤冷冻、一次干燥和二次干燥。冷冻干燥组合物后的二次干燥步骤包括降压和加热以使蒸汽升华。进行第二步是为了从经干燥的物质中蒸发余留的吸收水分。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物的冷冻干燥按以下顺序进行(1)通过使用冷冻干燥显微镜测定制剂的坍塌温度(collapsetemperature)(Pikal，M.J等，Int.J.Pharm.，1990，第62卷，第165页)；(2)在室温将小瓶放在冷冻干燥机架子上，然后在-1℃平衡约30分钟；(3)将架子冷却至-55℃，并保持在该温度2小时；(4)在约-32℃或比坍塌温度低5℃的产品温度进行二次干燥；(5)在35℃进行二次干燥。室压控制在55mmHg～120mmHg，然后结束干燥；(6)在冷冻干燥机的真空下塞住小瓶，并将冷冻干燥小瓶用钳口盖密封(crimp-sealed)，并贮藏在2℃～8℃。
冻干制剂可以包含赋形剂和冻干保护剂。赋形剂包括但不限于含有0.9％NaCl和10mM磷酸钠(pH 7.0)或10mM柠檬酸钠(pH 7.0)的缓冲液。冻干保护剂在冷冻和干燥步骤中起到保护生物分子并为最终产品提供机械支持的作用，其例子包括PBS(pH 7.0)、PBS/4％、12％或15％的海藻糖等。
图1是本发明的重组肽载体的示意图。CMV巨细胞病毒启动子；SP制瘤素M的信号肽序列；VCTLA4的胞外域；H、CH2和CH3IgA的Fc片段；BGH牛生长激素聚腺苷酸化序列；以及图底部的字母IgA的铰链(H)区的氨基酸序列，其中符号*表示半胱氨酸被取代为丝氨酸。
图2(a)显示，为了检测治疗性基因是否在宿主中表达，对从施用本发明重组肽载体的试验组的大鼠和未施用本发明的重组肽载体的对照组的大鼠的各组织中提取的RNA进行RT-PCR和电泳的结果。M100bp梯度；泳道1和6肝；泳道2和7肾；泳道3和8脾；泳道4和9肺；泳道5和10肌肉；以及泳道11和12施用蒸馏水的阴性对照组。图2(b)显示对从施用本发明重组肽载体的试验组的狗和未施用本发明的重组肽载体的对照组的狗的血中提取的RNA进行RT-PCR和电泳的结果。泳道N施用蒸馏水的阴性对照的狗；泳道C未施用重组肽载体的阴性对照的狗；泳道0、1、3、7、11、15、19、26和30分别为于施用重组肽载体后0、1、3、7、11、15、19、26和30天的施用重组肽载体的狗的结果；泳道21和168分别为于施用重组肽载体后21和168天的施用重组肽载体的其它狗的结果。
图3图示在施用重组肽载体的试验组的狗(狗1和狗2)和未施用重组肽载体的对照组的狗中测定针对重组肽载体的抗体的结果，其中抗体测定在基因治疗后0、3、7、15和30天进行，以检测是否产生针对重组肽载体的抗体。
图4是显示在用本发明的重组肽载体进行基因治疗之前以及之后的脱毛情况的图。(a)、(c)、(e)和(g)基因治疗前；和(b)、(d)、(f)和(h)基因治疗后。
图5显示为检测用本发明的重组肽载体进行基因治疗之前和之后皮肤组织的状态而进行的H&E染色的结果。(a)和(b)分别为用本发明的重组肽载体进行基因治疗之前和之后渗透到上皮层中的淋巴细胞和浆细胞的量；(c)和(d)分别为基因治疗之前和之后毛囊的情况；(d)和(e)分别为基因治疗之前和之后沉积在真皮-表皮交界处的免疫球蛋白的量。
具体实施例方式
下文将通过以下实施例对本发明进行更为详细的描述。但是对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的范围并没有限于这些实施例，也不受到这些实施例的限制。
实施例1
(1)狗CTLA4的编码序列的扩增将1.4ml作为抗凝血剂的CPDA(柠檬酸磷酸葡萄糖酸)加到10ml取自健康狗的静脉血中，然后进行Ficoll-Plaque梯度离心以分离外周血单核细胞(PBMC)。经分离的PBMC用PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤2次，在完全没有内毒素的培养基RPMI 1640(含有10％胎牛血清、50μl/ml庆大霉素、10μl/ml伴刀豆球蛋白A)中调至1×106细胞/ml，并在5％CO2于37℃培养4小时。培养后，PBMC通过离心收集并冷冻在液氮中。用Trizol试剂从经分离的PBMC中分离总RNA，用75％乙醇洗涤，并将RNA沉淀溶解在DEPC处理水中。将2μg经纯化的mRNA和1μloligo(dT)30引物混合，在70℃加热2分钟，并通过加冰进行冷却。向该混合物中加入200U M-Mulv反转录酶、5μl的5倍缓冲液、1μl的dNTP，并用DEPC处理水加至50μl的总体积。让该混合物在42℃反应1小时，以合成第一链cDNA。
用以下引物对对上述获得的第一链cDNA模板进行PCR，以扩增758bp的CTLA4。具体地，在加入3μl第一链cDNA、2U Pfu DNA聚合酶、10μl的10倍缓冲液、1％Triton X-100、1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、3μl的CTLA4正向引物(10μM)、3μl的CTLA4反向引物(10μM)、2μl的dNTP(各为10mM)，并用三重蒸馏水加至100μl的总体积之后进行PCR反应。而且PCR反应由以下步骤组成3分钟，95℃；30个循环(30秒，95℃；1分钟，52℃和1分钟30秒，72℃)；以及10分钟，72℃。PCR产物具有完全的平末端。
CTLA4正向引物5’-AAGACCTGAACACTGCTCCA-3’(SEQ IDNO1)CTLA4反向引物5’-TTGAAATTGCCTCAGCTCCT-3’(SEQ ID NO2)(2)狗免疫球蛋白(IgA)Fc片段的编码序列的扩增为了扩增IgA的Fc片段(H-CH2-CH3区)，用5μl/ml LPS激活以上获得的PBMC，然后以与以上(1)部分相同的方式从该细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR。所得第一链cDNA模板用以下引物对进行PCR，于是扩增到726bp的IgA Fc片段。
IgA正向引物5’-GATAACAGTCATCCGTGTCA-3’(SEQ ID NO3)IgA反向引物5’-GTAGCAGATGCCGTCCACCT-3’(SEQ ID NO4)。
实施例2CTLA4的胞外域与IgA Fc片段的连接为了在实施例1中扩增的CTLA4的胞外域与IgA Fc片段之间进行连接，设计正向引物(含有HindIII限制酶识别序列)和反向引物(含有EcoRI限制酶识别序列)，以扩增CTLA4的胞外域，同样，设计与实施例1(2)相同的正向引物(含有EcoRI限制酶识别序列)和反向引物(含有XbaI限制酶识别序列)，以扩增IgA Fc片段。然后，用所述引物进行PCR。
在这种情况中，由于CTLA4的信号肽还没有得到确定，所以将人制瘤素M的信号肽附着到所扩增的CTLA4的5’末端，以用于胞外分泌。这通过两步的重叠PCR来实现。第一步PCR用以下正向引物和反向引物进行，所述正向引物和反向引物经合成使它们具有来自制瘤素M的信号肽的15个氨基酸和来自CTLA4的N末端的7个氨基酸。
SP-CTLA4正向引物5’-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGTCCAAAGGGATGCATGTGGCT-3’(SEQ ID NO5)SP-CTLA4(EcoRI)反向引物5’-GAATTCGTCAGAATCTGGGCAAGGTTC-3’(SEQ ID NO6)第二步PCR通过纯化第一步PCR的PCR产物，然后用以下在制瘤素M的N末端含有HindIII限制酶识别序列的正向引物和上述SP-CTLA4(EcoRI)反向引物扩增经纯化的产物来进行。
SP-CTLA4(HindIII)正向引物5’-AAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3’(SEQ ID NO7)IgA Fc片段用以下引物扩增
IgA(EcoRI)正向引物5’-GAATTCGATAACAGTCATCCGTCTCAT-3’(SEQ ID NO8)IgA(XbaI)反向引物5’-TCTAGAGTAGCAGATGCCGTCCAC-3’(SEQ ID NO9)使用这些引物组，获得了472bp(CTLA4胞外域)PCR产物和741bp(IgA Fc片段)PCR产物。在这一过程中，IgA铰链区的4个半胱氨酸中的3个半胱氨酸被丝氨酸取代以在链间形成一个二硫键。将各扩增的PCR产物克隆到pCR2.1载体中，从而制备pCR2.1-CTLA4和pCR2.1-IgA。用这些载体转化E.coli(大肠杆菌)TOP10，选取阳性克隆，并将其培养在液体培养基中。培养后，用相应的限制酶对提取的质粒(HindIII和EcoRI用于pCR2.1-CTLA4，而EcoRI和XbaI用于pCR2.1-IGHAC)进行处理，然后，在琼脂糖凝胶上分离所期望的条带，并使其相互连接。再次对连接产物进行PCR扩增，然后将其克隆到pCR2.1载体中。
实施例3治疗性CTLA4-Ig基因与pcDNA 3.1(+)的连接用HindIII和XbaI分别处理实施例2中获得的治疗性CTLA4-Ig基因和pcDNA 3.1(+)载体。然后，在琼脂糖凝胶上对该治疗性基因和载体进行分离和纯化并进行连接。用该重组载体转化E.coli TOP10菌株，并进行选择性培养。
实施例4治疗性基因的PCR为了制备用于最终用途的可操作性地连接到表达控制序列的治疗性基因(DNA构建体)，将以下正向引物置于pcDNA3.1(+)的CMV启动子之前，将以下反向引物置于BGH的Poly(A)信号之后CMV-正向引物5’-GCCAGATATACGCGTTGACAT-3’(SEQ ID NO10)BGH-反向引物5’-GCTTAATGCGCCGCTACA-3’(SEQ ID NO11)使用这些引物进行PCR而获得治疗性基因可操作性地连接到表达控制序列上的2213bp的DNA构建体。该DNA构建体的碱基序列如SEQ IDNO12所示。
实施例5来自人类的治疗性CTLA4-Ig基因同时，为了制备可用于人类的治疗性CTLA4-Ig基因，使用来自人类的CTLA4基因和免疫球蛋白基因，所有制备步骤以与实施例1～4相同的方式进行。在各步骤中使用的引物对的碱基序列如下所示，所得的具有可操作性地连接到表达控制序列上的治疗性基因的DNA构建体具有如SEQ ID NO20所示的碱基序列。
hCTLA4正向引物5’-AAGACCTGAACACCGCTCCC-3’(SEQ IDNO13)hCTLA4反向引物5’-GTTAGAATTGCCTCAGCTCTT-3’(SEQ IDNO14)hIgG正向引物5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’(SEQ IDNO15)hIgG反向引物5’-AGCATCCTCGTGCGACCGCG-3’(SEQ ID NO16)hSP-CTLA4正向引物5’-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3’(SEQ ID NO17)hSP-CTLA4(EcoRI)反向引物与SP-CTLA4(EcoRI)反向引物相同hSP-CTLA4(HindIII)正向引物与SP-CTLA4(HindIII)正向引物相同hIgA(EcoRI)正向引物5’-GAATTCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO18)hIgA(XbaI)反向引物5’-TCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC-3’(SEQ ID NO19)实施例6肽载体的合成在本发明中，用以将治疗性基因转导入细胞中的肽载体由前导肽和接头DNA组成。
前导肽具有以下氨基酸序列，由Fmoc固相法合成，包含附着于N末端的乙酰基团(Ac)(Peptron Inc.)。
Ac-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO21)接头序列接头-1DNA5’-Cys-OO-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(SEQ IDNO22)，其中-OO-表示酯键。
接头-2DNA3’-GAT TAT GCT GAG TGA-T-5’(SEQ ID NO23)。
在接头序列中，将半胱氨酸结合到接头-1DNA的5’末端，以与前导肽连接，并通过T4聚合激酶(polykinase，Perkin Elmer)将磷酸基团附着于接头-2DNA的5’末端，以与治疗性基因连接。
在缓冲液(含有50mM Tris、0.1mM EDTA和10mM DTT，pH 10.5)中，将2纳摩尔(nmol)的前导肽和2纳摩尔的接头-1DNA于37℃反应1小时，从而通过S-S键将它们连接在一起。然后，为了使接头-1DNA与在5’末端具有磷酸基团的接头-2DNA杂交，加入2nmol的接头-2DNA，并在60℃反应30分钟。随后，每次分装10pmol(20pmol/μl)，然后保藏在-20℃以下。
实施例7DNA构建体与肽载体的连接用二氧化硅在琼脂糖凝胶片段上纯化实施例5中通过PCR扩增的DNA构建体，然后用T4连接酶将其连接到载体上。连接后，通过琼脂糖凝胶上的条带迁移来确认连接产物，然后施用于患病模型动物。图1显示本发明的重组肽载体和DNA构建体的示意图。
实施例8(1)将治疗性基因递送于大鼠的检测为了检测肽载体是否能够将治疗性基因递送到各种组织中，对大鼠施用重组肽载体，并从大鼠的各种组织中提取治疗性基因的RNA和进行RT-PCR。结果如图2所示。
图2a显示对从施用重组肽载体的试验组的大鼠和未施用重组肽载体的对照组的大鼠的各种组织中提取的RNA进行RT-PCR和电泳的结果(M100bp梯度；泳道1和6肝；泳道2和7肾；泳道3和8脾；泳道4和9肺；泳道5和10肌肉；以及泳道11和12施用蒸馏水的阴性对照组)。从图2a中的结果可以看出，插入到重组肽载体中的治疗性基因被递送到各种组织如肝、肾、脾、肺和肌肉中，并在所述组织中表达。
(2)将治疗性基因递送于狗的检测为了检测治疗性基因是否在狗中充分表达，设计在正常狗中没有发现的能够扩增治疗性基因(CTLA4和IgA)的结合位点的引物对，用所设计的引物对，对取自狗的外周血单核细胞的RNA进行RT-PCR。结果如图2b所示。
图2(b)显示对从施用本发明重组肽载体的试验组的狗和未施用本发明的重组肽载体的对照组的狗的各种组织中提取的RNA进行RT-PCR和电泳的结果(泳道N施用蒸馏水的阴性对照的狗；泳道C未施用重组肽载体的阴性对照的狗；泳道0、1、3、7、11、15、19、26和30分别为在施用重组肽载体的狗中，在施用重组肽载体后0、1、3、7、11、15、19、26和30天的试验结果；泳道21和168分别为在施用重组肽载体的另外的狗中，在施用重组肽载体后21和168天的试验结果。如图2b所示，可以观察到对应于治疗性基因(CTLA4和IgA)的结合域的394bp的特异条带，并且治疗性基因在施用本发明的重组肽载体后至少表达了168天。
检验例1尿蛋白与肌酸的比例的检测在上午10点到下午2点，用导尿管收集经硫酸乙酰肝素免疫引起SLE的狗的尿。通过Lott JA等(Clin.Chem.1983，第29卷(11)，第1946页)描述的方法测定尿蛋白，而尿肌酸则在用蒸馏水以1∶100稀释后通过改进的Jaffe反应来测定。尿蛋白与肌酸的比例小于0.6可以评价为正常，尿蛋白与肌酸的比例大于1可以评价为严重肾小球疾病(Sodikoff CH.Urine tests.In Sodikoff CH(编)，Laboratory profiles of small animal diseasesA guide to laboratory diagnosis.第2版，St.LouisMosby，199550)。可以看出，在用本发明重组肽载体处理前尿蛋白与肌酸的比例显示高的狗，在用肽载体处理后显示出正常的尿蛋白与肌酸的比例。这表明根据本发明制备的治疗性基因缓解了肾小球疾病(表1)。
表1
检验例2针对肽载体的抗体的ELISA检测为了检测本发明使用的肽载体在宿主中是否产生抗体而进行了竞争ELISA。
在基因治疗后0、3、7、15和30天，从未用本发明的肽载体处理的对照组的狗和用本发明的肽载体处理的试验组的狗采血，并从该血中分离血清。将12.5μg/孔的肽载体稀释在PBS中，然后在4℃包被过夜。为了封闭余留的结合位点，用PBS中的1％BSA溶液作为封闭缓冲液。在检测中，狗血清以1∶200的稀释度使用，作为特异性结合到肽载体上的抗体，用过氧化物酶偶联的兔抗狗IgG作为二抗，并使用二盐酸邻苯二二胺(Sigma p9187)作为底物。用3M HCl作为终止液来终止反应，并测定492nm处的吸光度。结果如图3所示。
图3中的柱状图显示与重组肽载体结合的特异性抗体的量在施用重组肽载体的检验组的狗(狗1和狗2)和未施用肽载体的对照组的狗之间的比较，其中抗体量的测定在基因疗法后0、3、7、15和30天进行。从图3的结果可以看出，在试验组的狗的血中并没有产生针对肽载体的抗体。
检验例3组织学检测对狗施用硫酸乙酰肝素(HS)，以引起系统性红斑狼疮，在12周后取狗的皮肤组织。在用本发明的重组肽载体处理的狗的情况中，在处理后99天取其皮肤组织。对所取的皮肤组织进行H&E(苏木精和曙红)染色，并针对免疫球蛋白和C3进行免疫染色。以1∶200稀释重链特异性羊抗狗IgG、μ链特异性羊抗狗IgM和羊抗狗C3(benthyl laboratories，Montgomery，TX)并用作一抗，以1∶200稀释过氧化物酶抗羊IgG(H+L)并用作二抗。
在施用治疗性基因的情况中，目视检测的结果表明，与系统性红斑狼疮有关的皮肤病，如脱毛、红斑、疥、痂和脂溢性皮炎完全消失(图4a至4h)。
类似地，对基因疗法后99天所取的皮肤组织进行H&E染色的结果显示，已渗透到上皮层中的淋巴细胞和浆细胞的数目显著降低(图5a和5b)。而且，在已经处于休眠期且没有毛的毛囊中长出新毛，所述毛囊恢复到正常的毛发再生期(图5c和图5d)。对皮肤组织进行免疫染色后，免疫球蛋白(IgM)和补体(C3)向真皮-表皮结合处(也称为狼疮特异带，在红斑狼疮中特征性地显示)中的渗透消失(图5e和5f)。
检验例4HS免疫的狗和基因治疗的狗中的抗核抗体的检测采用以丙酮固定的Crandall-Reese猫肾(Crandall-Reese FelineKidney，CRFK)细胞作为基质，通过间接免疫荧光法检测针对细胞核的自身抗体(抗核抗体)。以1∶2至1∶128稀释狗血清并测定荧光。用异硫氰酸荧光素偶联的羊抗狗IgG(1∶16的稀释度)检测自身抗体的结合。用落射荧光显微镜观察荧光。在用HS免疫后3、7、11、18、25和27周以及基因疗法后7、32和99天取血清。
如果即使在高稀释比的血清中也检测到荧光(即血清表现为阳性)，那么这意味着该血清中存在着较多的抗核抗体。通常，正常狗的血清在稀释比至多为1∶10时会显示出荧光。在稀释比至多为1∶16时显示的荧光将认为是低滴度阳性，在稀释比为1∶64时显示的荧光将认为是高滴度阳性。在下表2中，在甚至大于1∶128时显示阳性的情况可以明确诊断为SLE，只在1∶2显示阳性的情况与正常动物的情况没有差异。因此，可以看出，重组肽载体有效地治疗了SLE。
表2
工业实用性如上所述，通过使用本发明的重组肽载体的基因疗法，可以将治疗性基因递送到所有细胞中，同时使针对该载体的抗体的产量最小。因此，本发明的重组肽载体可用于治疗在整个系统中出现的疾病，尤其是自身免疫疾病。
序列表<110>蔡莹镇崔恩华<120>包含用于治疗自身免疫疾病的基因的重组肽载体<130>FCI06KR1235<160>23<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aagacctgaa cactgctcca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ttgaaattgc ctcagctcct 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>3gataacagtc atccgtgtca 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtagcagatg ccgtccacct 20<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatgtccaa agggatgcat 60gtggct 66<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gaattcgtca gaatctgggc aaggttc 27<210>7
<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7aagcttcacc atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact 60c 61<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gaattcgata acagtcatcc gtctcat 27<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9tctagagtag cagatgccgt ccac 24<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>10gccagatata cgcgttgaca t21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11gcttaatgcg ccgctaca18<210>12<211>2213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>治疗性基因<400>12gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660ctggctagcg tttaaactta agcttcacca tgggtgtact gctcacacag aggacgctgc 720tcagtctggt ccttgcactc ctgtttccaa gcatggcgag catgtccaaa gggatgcatg 780tggctcagcc tgcagtggtt ctggccagca gccggggtgt tgctagcttc gtgtgtgaat 840atgggtcttc aggcaacgca gccgaggtcc gggtgacagt gctgcggcag gctggcagcc 900agatgactga agtctgtgcc gcgacataca cagtggagga tgagttggcc ttcctggatg 960attctacctg cactggcacc tccagtggaa acaaagtgaa cctcaccatc caagggttga 1020gggccatgga cacggggctc tacatctgca aggtggagct catgtaccca ccaccctact 1080atgtaggcat gggaaatgga acccagattt atgtcatcga tcctgaacct tgcccagatt 1140ctgacgaatt cgataacagt catccgtctc atccatctcc ctcgtccaat gagccccgcc 1200tgtcactaca gaagccagcc ctcgaggatc tgcttttagg ctccaatgcc agcctcacat 1260gcacactgag tggcctgaaa gaccccaagg gtgccacctt cacctggaac ccctccaaag 1320ggaaggaacc catccagaag aatcctgagc gtgactcctg tggctgctac agtgtgtcca 1380gtgtcctacc aggctgtgct gatccatgga accatgggga caccttctcc tgcacagcca 1440cccaccctga atccaagagc ccgatcactg tcagcatcac caaaaccaca gagcacatcc 1500cgccccaggt ccacctgctg ccgccgccgt cggaagagct ggccctcaat gagctggtga 1560cactgacgtg cttggtgagg ggcttcaaac caaaagatgt gctcgtacga tggctgcaag 1620ggacccagga gctaccccaa gagaagtact tgacctggga gcccctgaag gagcctgacc 1680agaccaacat gtttgccgtg accagcatgc tgagggtgac agccgaagac tggaagcagg 1740gggagaagtt ctcctgcatg gtgggccacg aggctctgcc catgtccttc acccagaaga 1800ccatcgaccg cctggcgggt aaacccaccc acgtcaacgt gtctgtggtc atggcagagg 1860tggacggcat ctgctactaa tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 1920tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1980aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2040
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2100aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 2160ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agc2213<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13aagacctgaa caccgctccc 20<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14gttagaattg cctcagctct t 21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15gagcccaaat cttgtgacaa aac 23<210>16<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16agcatcctcg tgcgaccgcg 20<210>17<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60cagcc 65<210>18<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18gaattcgagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatccc caccgtcccc agcacctgaa 60ctcctg 66<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>19tctagaagca tcctcgtgcg accgcgagag c31<210>20<211>2446<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>治疗性基因<400>20gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660ctggctagcg tttaaactta agcttcacca tgggtgtact gctcacacag aggacgctgc 720tcagtctggt ccttgcactc ctgtttccaa gcatggcgag catggcaatg cacgtggccc 780agcctgctgt ggtactggcc agcagccgag gcatcgccag ctttgtgtgt gagtatgcat 840ctccaggcaa agccactgag gtccgggtga cagtgcttcg gcaggctgac agccaggtga 900ctgaagtctg tgcggcaacc tacatgatgg ggaatgagtt gaccttccta gatgattcca 960
tctgcacggg cacctccagt ggaaatcaag tgaacctcac tatccaagga ctgagggcca1020tggacacggg actctacatc tgcaaggtgg agctcatgta cccaccgcca tactacctgg1080gcataggcaa cggaacccag atttatgtaa ttgatccaga accgtgccca gattctgacg1140aattcgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag1200cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg1260gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc1320ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc138Ccggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag1440ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag1500cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg1560aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa1620accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg1680gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc tacagggcag1740ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag1800gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag1860agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc1920tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc1980ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc2040ctgtctccgg gtaaatgagt gcgacggccg gcaagccccg ctccccgggc tctcgcggtc2100gcacgaggat gcttctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc2160tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc2220cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg2280tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa2340tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg2400
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagc 2446<210>21<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端Gly被乙酰化；第二个氨基酸可被Ile替换；第4个氨基酸可被Leu替换；第10个氨基酸可被Arg替换；第11个氨基酸可被Lys替换；第13个氨基酸可被Leu、Ile、Arg、Gln、Asn和Ser中的一个替换。
<400>21Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gly Arg Arg Cys1 5 10 15<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接头-1DNAC的5’端与Cys形成酯键<400>22ctaatacgac tcactat 17<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接头-2DNA<400>23gattatgctg agtgat 1权利要求
1.一种重组肽载体，该重组肽载体包含前导肽、接头DNA和DNA构建体，该构建体是通过将表达控制序列与编码融合蛋白的治疗性基因可操作性地连接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域与免疫球蛋白的Fc片段相结合，其中所述前导肽通过所述接头DNA连接到所述DNA构建体的两个末端。
2.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述前导肽由16个氨基酸组成。
3.如权利要求2所述的重组肽载体，其中第1位至第4位的氨基酸为带有非极性脂肪族侧链的氨基酸。
4.如权利要求3所述的重组肽载体，其中所述带有非极性脂肪族侧链的氨基酸选自Gly、Ala、Val、Leu和Ile。
5.如权利要求2所述的重组肽载体，其中第5位和第6位的氨基酸为带有非离子极性侧链的氨基酸。
6.如权利要求5所述的重组肽载体，其中所述带有非离子极性侧链的氨基酸选自Asn、Gln、Ser和Thr。
7.如权利要求2所述的重组肽载体，其中第7位氨基酸为Gly。
9.如权利要求2所述的重组肽载体，其中第8位至第12位的氨基酸为带有碱性侧链的氨基酸。
10.如权利要求9所述的重组肽载体，其中所述带有碱性侧链的氨基酸为Lys或Arg。
11.如权利要求2所述的重组肽载体，其中第13位的氨基酸为Gly。
12.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述前导肽具有SEQ IDNO21的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述接头DNA具有通过将SEQ ID NO22的碱基序列与SEQ ID NO23的碱基序列退火而形成的碱基序列。
14.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述DNA构建体和一条接头DNA是通过该一条接头DNA的5’末端的磷酸基团和治疗性基因的3’末端的羟基之间的磷酸二酯键连接在一起的，所述前导肽和另一条接头DNA是通过前导肽的C端的Cys和所述另一条接头DNA的5’端的Cys之间的二硫键连接在一起的，并且所述两条接头DNA是退火在一起的，借此通过接头DNA将DNA构建体的两个末端与前导肽连接。
15.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述CTLA4和免疫球蛋白来自哺乳动物。
16.如权利要求15所述的重组肽载体，其中所述哺乳动物为人或狗。
17.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述表达控制序列包括启动子、信号肽序列和聚腺苷酸化序列。
18.如权利要求17所述的重组肽载体，其中所述启动子为来自巨细胞病毒的启动子。
19.如权利要求17所述的重组肽载体，其中所述信号肽序列为来自人制瘤素M的分泌序列。
20.如权利要求17所述的重组肽载体，其中所述聚腺苷酸化序列来自牛生长激素，即BGH。
21.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述DNA构建体为SEQID NO12或SEQ ID NO20所示的碱基序列。
22.如权利要求1所述的重组肽载体，其中所述免疫球蛋白为IgA或IgG。
23.一种制备重组肽载体的方法，该方法包括以下步骤(1)将编码CTLA4的胞外域的基因与编码免疫球蛋白的Fc片段的基因连接，从而制备治疗性基因；(2)将所述治疗性基因和表达控制序列可操作性地连接，从而制备DNA构建体；(3)合成前导肽和接头DNA，然后将所述前导肽和接头DNA连接在一起，从而制备肽载体；和(4)通过接头DNA将步骤(2)中得到的DNA构建体的两个末端与所述前导肽连接。
24.如权利要求23所述的方法，其中通过一条接头DNA的5’末端的磷酸基团和所述DNA构建体的3’末端的羟基之间的磷酸二酯键将所述DNA构建体和所述接头DNA之一连接在一起，通过所述前导肽C端的Cys和所述另一条接头DNA的5’端的Cys之间的二硫键将所述前导肽和另一条接头DNA连接在一起，并将所述两条接头DNA退火在一起，借此通过所述接头DNA将所述治疗性基因的两个末端与所述前导肽连接。
25.一种用于治疗自身免疫疾病的组合物，该组合物包含药学有效量的权利要求1～22任一项所述的重组肽载体和药学可接受的载体。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮。
全文摘要
本发明提供一种重组肽载体，该载体包含前导肽、接头DNA和DNA构建体，该构建体是通过将表达控制序列与编码融合蛋白的治疗性基因可操作性地连接而形成的，在所述融合蛋白中CTLA4的胞外域与免疫球蛋白的Fc片段相结合，其中所述前导肽通过所述接头DNA连接到所述DNA构建体的两个末端。此外，本发明还提供制备所述重组肽载体的方法，以及用于治疗自身免疫疾病的药物组合物，该组合物包含药学有效量的所述重组肽载体和药学可接受的载体。
文档编号A61K48/00GK1878867SQ200380110758
公开日2006年12月13日 申请日期2003年11月29日 优先权日2003年11月29日
发明者蔡莹镇, 崔恩华 申请人:蔡莹镇, 崔恩华