包含POKEMON基因的siRNA的运输载体颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种W己型肝炎病毒核也蛋白作为载 体将P0KEM0N基因的siRNA包裹于其中的制备方法。
【背景技术】
[0002] 目前研究显示，哺乳动物己型肝炎病毒的核壳或核也含有由183或185个氨基酸 残基构成的序列。若干种嗜肝DNA病毒的己型肝炎核也蛋白单体可在受感染细胞中自组装 成被称为己型肝炎核也蛋白颗粒（皿C颗粒）的稳定聚集体。业已报导了皿C颗粒的两种 H维结构。第一种结构包括含有二聚体形式的90个拷贝的皿C亚基蛋白或180个独立单 体蛋白的小群体，第二种结构包括含有二聚体形式的120个拷贝的皿C亚基蛋白或240个 独立单体蛋白的大群体。该些颗粒分别被称为T = 3或T = 4颗粒，其中"T"为H角划分 数。该些人感染性病毒的皿C颗粒的直径分别为大约30或34nm。
[0003] P0KEM0N是P0K转录抑制因子家族成员之一，它包括一个氨基末端P0Z/BTB结构域 和駿基端Kr化pel型锋手指结构域，是T淋己细胞、B淋己细胞和红细胞系发育和成熟的重 要因子。P0KEM0N基因在乳腺癌、肝癌和淋己瘤等肿瘤的异常表达在癌基因转化和肿瘤的发 生过程中发挥重要的作用。P0KEM0N是一种新发现的致癌基因，它能够导致其它致癌基因发 作，最终促使肿瘤形成。P0KEM0N可W使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此被称为癌症 的"总开关"。重点是细胞内P0KEM0N基因的缺失不会对细胞的正常生长造成影响，该为设 计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。
[0004] RNA干扰技术被形象地称为基因敲低（knock-down)或基因沉默 (gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默 (post-transcriptional genesilencing, PTGS)，是一种快速、高效的抑制特异性基因表达 的方法，其最关键的效应分子就是具有21-2化t碱基的短片段双链RNA分子，称之为SiRNA， 能够W序列特异性地结合祀mRNA并使mRNA降解。由于RNA干扰具有高效、特异性，SiRNA 介导的转录后基因沉默是针对祀向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效 应，是一种转录后基因表达调控机制，且不诱导非特异性的干扰素激活途径，因而成为继反 义核巧酸、核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研究和基因治疗 开辟了新的道路，目前已广泛用于抑制特定基因的表达研究，特别是祀向恶性肿瘤中高度 表达基因的研究。使用SiRNA的基因治疗的关键在于W最小的副作用和最高的给药效率将 SiRNA传递到期望组织。然而，SiRNA具有低的细胞透性，并且因在生理环境下等对基因的 降解酶敏感而不能维持必要的浓度，从而易于分解，无法达到理想效果，导致SiRNA作为药 物使用受到限制。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，基因的载体变得尤为重要，本发明拟在研究一种可将SiRNA 包裹于其中，能有效地循环而不被活体中的免疫细胞移除或排出，保护SiRNA不被活体细 胞中的酶分解的运输载体。并且不会改变或降低siRNA抑制POKEMON基因表达的作用。
[0006] 本发明的目的在于提供4对针对人POKEMON基因的SiRNA序列，能抑制人POKEMON 基因表达的SiRNA用于肿瘤基因治疗，来抑制肿瘤细胞的生长。
[0007] 本发明首先提供了一种降低POKEMON基因表达的小分子干扰RNA (SiRNA)，包括正 义链和反义链，序列如下：
[0008] siRNAl 正义链；5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3，
[000引 反义链；3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5,
[0010] siRNA2 正义链；5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3'
[0011] 反义链；3 ' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5 '
[001引 siRNA3 正义链；5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3'
[0013] 反义链；3, -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5，
[0014] siRNA4 正义链；5, -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3，
[001 引 反义链；3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5,
[0016] 本发明所述小分子干扰RNA(siRNA)针对的POKEMON基因的祀序列如SEQ ID No. 1-4 所示。
[0017] 沈Q ID No. 1 ;AA CCCACCACAAACGTAGAAT CC
[0018] 沈Q ID No. 2 ;AA GACCTTAAATGATTTCTGT CT
[0019] 沈Q ID No. 3 ;TT CTGACGTGAAGAGGTCTTA GC
[0020] 沈Q ID No. 4 ;TT CTCTGTGACACACACATCT TC
[0021] 本发明提供了一种小分子干扰核糖核酸（SiRNA),其包含正义RNA片段和反义RNA 片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制人POKEMON 基因的表达。对于上述小分子干扰核糖核酸来说，所述正义RNA片段和反义RNA片段可W 存在于两条不同的RNA链上，也可W存在于同一条RNA链上。当正义RNA片段和反义RNA 片段存在于同一条RNA链上时，所述核糖核酸优选为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片 段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。对于上述任一项所述的小分子干扰 核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为21个核巧酸。对于任一项所述的小 分子干扰核糖核酸，其中双链RNA的互补区域至少有19个碱基对。
[0022] 本发明进一步提供一种可将POKEMON基因的SiRNA包裹于其中的运输载体，其中， 所述运输载体是己肝病毒的核也蛋白皿C。所述纳米颗粒的平均粒径为30-34nm。
[0023] 所述的SiRNA运输载体不会改变或降低SiRNA抑制POKEMON基因表达的作用。其 中，所述的SiRNA的运输载体在基因沉默中的用途。所述的SiRNA输送载体在制备癌症基 因治疗药物中的应用。
[0024] 本发明提供的SiRNA能特异性抑制POKEMON基因的表达，MIT分析实验结果表明 本SiRNA能抑制癌细胞的增殖。该SiRNA能够高效、特异地抑制人POKEMON基因的表达，同 时具有较低的毒副作用。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合表格对本发明作进 一步的详细描述。
[0026] 实施例1抑制人POKEMON基因表达的siRNA序列的合成
[0027] 从 Genebank 调取 POKEMON基因（NM_015898)信息，用 http://sirna. wi. mit. edu/ home, php的在线设计软件设计针对POKEMON基因可能有效的SiRNA祀点。再通过BLAST分 析，将候选SiRNA祀位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同POKEMON基因W外的其它 人类基因序列具有较高序列同源性（16个W上碱基）的序列，W确保候选SiRNA祀位点不 会对其它人类基因发生抑制作用，而仅对POKEMON基因具有特异的抑制作用。分析设计总 共得到20对SiRNA。
[0028] 实施例2RT-PCR法检测SiRNA对POKEMON基因的沉默效率
[0029] 使用Invitrogen的lipofectamine2000脂质体进行转染，所有操作均严格遵 守Invitrogen提供的操作规程。将处于对数生长期的化pG2细胞进行膜酶消化，制成细 胞息液（细胞数约为5X lOYml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40%即可用 于转染。将SiRNA干粉溶解于无RNA酶的无菌水中，配置终浓度为20pmol/L的SiRNA溶 液。转染时，分别取10 y L的上述一种SiRNA溶液和5 y L的lipofectamine2000分别稀释 于250 y L无血清培养液（Opti-MEM)中，并在室温下赔育5min，然后将上述SiRNA溶液和 lipofectamine2000溶液混合，复合物与室温下静置20min后，把500