Pax6在胃癌发病机制中的作用
【技术领域】
[0001] 本文发明涉及基因表达在癌症发病机制中的作用，特别是涉及胃癌
【背景技术】
[0002] 胃癌是在全世界范围内高发的恶性肿瘤之一，预后较差，死亡率高居所有恶性肿 瘤中的第二位，大多数患者在确诊时已经失去了手术根治的机会，目前恶性肿瘤治疗常采 用手术、化疗、放疗、生物反应调节剂治疗相结合的综合治疗，但总体疗效仍不令人满意。因 此，人们在不断寻找新的治疗方法。随着新理论的确立和新技术的不断涌现，为恶性肿瘤新 疗法的出现打下基础。配对盒基因6(Paired box6，PAX6)在视网膜瘤、膜腺癌、乳腺癌中呈 现高表达，能促进恶性肿瘤增殖、抑制恶性肿瘤调亡，但是PAX6在胃癌中的研究，W及抑制 恶性肿瘤调亡的机制目前还未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明发现了 PAX6在胃癌中表达增高，具有促进增殖和抑制调亡的作用，并且发 明了两对siRNA，可化学合成，具有沉默PAX6表达效率高，对胃癌有潜在治疗作用。
[0004] 沉默PAX6表达的siRNA对胃癌细胞的促增殖及抑制调亡研究 [000引1细胞培养及转染
[000引 1. 1细胞培养
[0007] 细胞培养箱设置为37C，5% C〇2,饱和湿度条件下，人胃癌HGC27及MKN45细胞在 含10%胎牛血清的3?11-1640培养液中传代养。
[000引 1. 2细胞转染
[0009] 1. 2. 1转染前一天，将处于对数生长期的1. 5 X 1〇6个AGS细胞接种在6孔板上， 1. 5ml含10% FBS的RPMI-1640培养基培养，2化细胞密度达到30-50%。
[0010] 1. 2. 220化mol PAX6si-l用无血清化ti-MEM细胞培养基稀释成终体积18加1，轻 轻混匀。
[0011] 1.2. 3在24ul的无血清Opti-MEM细胞培养基中力日入脂质体 01igofectamineTM6ul，轻轻混匀室温下放置5min。
[0012] 1. 2. 4将稀释好的PAX6si-l和OligofectamineTM试剂混合，轻轻混匀室温放置 20min，W便形成复合物。
[0013] 1. 2. 5将215ul的复合物加入800ul无血清化ti-MEM细胞培养基的6孔板中，总 体积为101加1，siRNA的终浓度为l(K)pmol/ml，37°C，5% CA的培养箱内继续培养4-化。
[0014] 1. 2. 64-化后吸净6孔板内旧培养液，加入2ml含10% FBS的RPMI-1640新鲜培 养基，37°C，5% CA的培养箱，继续培养，分别于2化、4她、7化提RNA或蛋白。
[0015] 1. 2. 7PAX6si-2和阴性对照组转染NC操作同上，终浓度为l(K)pmol/ml ;空白对照 组Mock组加1ml无血清Opti-MEM细胞培养基（含6ul OligofectamineTM)，4-化后换成 2mll0% FBS 的 RPMI-1640 新鲜培养基。
[0016] 2.细胞的RNA抽提；采用Trizol试剂一步法提取胃癌细胞RNA。
[0017] 3. RT-PCR检测PAX6基因表达
[001引 实验步骤
[001引 3. 1逆转录反应
[0020] 3. 1. 1取薄壁离也管（RNase化ee)加入如下反应体系，70°C变性5min，立即4°C冷 却。
[0021]
【主权项】
1. 一种（共两对）沉默PAX6小干扰RNA，将它们分别命名为PAX6si-l和PAX6si-2。 其特点为： PAX6si-l ： 靶序列：GCTTCACCATGGCAAATAA 正义 5 'GCUUCACCAUGGCAAAUAA dTdT3 ' 反义 3 'dTdT CGAAGUGGUACCGUUUAUU5 '。 PAX6si-2 ： 靶序列：GCAGACGGCATGTATGATA 正义 5 'GCAGACGGCAUGUAUGAUA dTdT3 ' 反义 3 'dTdT CGUCUGCCGUACAUACUAU5 '。
2. 慢病毒：干扰序列为GCTTCACCATGGCAAATAA。 3. PAX6在胃癌中的促增殖作用 体外实验：在疆附5及邪027人胃癌细胞株当中，？4乂6被以1?嫩干扰后，3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)吸光度值显著降低，并且我们还进一步在细胞克 隆形成实验（Colony formation assay)中发现PAX6被siRNA干扰后，细胞克隆数显著降 低。 体内试验：将稳定干扰PAX6表达慢病毒转染入人胃癌细胞株（MKN45及HGC27)后，注 射进小鼠皮下，在6周后发现注射入稳定干扰PAX6表达细胞株的小鼠皮下瘤体积及重量均 显著低于注射对照组细胞株的小鼠。 4. PAX6在胃癌中的抑制凋亡作用 在MKN45及HGC27人胃癌细胞株当中，PAX6被siRNA干扰后，Caspase-3、PARP及Bcl-xl 的表达显著增加，而BAD的表达显著降低；同时，我们还发现将PAX6干扰后，线粒体膜电位 明显下降；并且我们发现PAX6抑制凋亡是通过Akt信号通路发挥作用，将PAX6干扰后，Akt 表达无差异，而PAkt的表达显著降低。
【专利摘要】一种在胃癌中高表达的潜在促癌基因(PAX6)，能够促进胃癌细胞的增殖以及抑制胃癌细胞的凋亡。并且发明了两对siRNA及慢病毒，可化学合成，具有沉默PAX6表达效率高，对胃癌有潜在治疗作用。
【IPC分类】C12N15-867, C12N15-113, A61P35-00
【公开号】CN104630218
【申请号】CN201310559735
【发明人】朱森林, 张译, 谢丹, 黄霖琳, 胡品津
【申请人】中山大学附属第一医院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月11日