一种调节性表达目的基因的载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于基因治疗的表达载体，属于可调控表达领域，具体涉及一种调节 性表达目的基因的载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 胆固醇是生物膜的重要组成成分之一，在许多生命过程中发挥着重要作用。但 血液中高水平的胆固醇会导致动脉粥样硬化、冠心病等严重疾病，早发动脉粥样硬化、冠 心病是家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH)的重要表现（Van Craeyveld E 等，Curr Pharm Des，17(24) :2575-2591 (2011))〇
[0003] 血液中70%的胆固醇由低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL)和极低 密度脂蛋白（very low-density lipoprotein, VLDL)携带（张锐，国外医学，老年医学分 册，30(1) :29-33(2009))。血液中的LDL的含量对血液中胆固醇的代谢有重要影响。
[0004] 肝细胞是代谢LDL的主要细胞，也是唯一能够排泄胆固醇的细胞。肝脏内 的低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor, LDLr)的活性对血楽中 LDL水平起到最主要的调节作用，LDLR基因的转录受固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory element binding protein, SREBP)通路调节（柳童斐等，中国细胞生物学学 报，35(4) :401-409, (2013))。
[0005] SREBP是一种属于基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链 (basic-helix-loop-helix-leucine zipper, bHLHZ-ip)家方矣的转录因子（Yokoyama et al.，Cell 75:187-197(1993))，在哺乳动物细胞内有 3 个成员：SREBP-la、SREBP-lc 和 SREBP-2。它们对不同的靶基因有不同的选择性，其中主要激活LDL基因的是SREBP-2。
[0006] SREBP通路的机理是：当细胞内质网膜的胆固醇处于高水平时，内质网膜蛋白 SREBP裂解激活蛋白（SREBP cleavage activating protein, SCAP)的固醇敏感结构域 (sterol sensing domain, SSD)将会结合胆固醇，导致SCAP构象发生改变，SCAP会结合内 质网膜蛋白胰岛素诱导的基因 （insulin induced gene, Insig)，形成SREBP-2/SCAP/Insig 复合物并保留在内质网膜，导致胆固醇的合成和代谢被阻断，血浆中的低密度脂蛋白不会 被代谢；当内质网膜的胆固醇处于低水平时，SCAP从Insig解离，SREBP-2/SCAP从内质网 膜迁移到高尔基体，细胞核中的核SREBP-2 (SREBP-2n)增加，SREBP-2n特异性结合LDLR基 因启动子中的胆固醇调节元件（sterol regulatory element, SRE)，从而促进LDLR基因的 转录，进而促使血楽中的低密度脂蛋白通过LDLr路径进行代谢（Kassim SH等，Hum Gene Ther，24 (1):19-26 (2013) ;Sudhof TC 等，J Biol Chem，262(22):10773-10779(1987); Kong WJ 等，J Mol Med(Berl)，84(l):29_36(2006) ;RadhakrishnanA 等，Proc Natl Acad Sci U S A, 104(16):6511-6518(2007) ;Sun LP 等，Proc Natl Acad Sci U S A,104 (16):6519-6526(2007))〇
[0007] SREBP除了通过SREBP通路对LDLr的表达进行调节，还能对其他胆固醇或脂肪酸 合成途径中的酶进行调节。研究表明，在转录水平上，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (3-hydroxy-3_methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)mRNA 含量主要受到 SREBP 的调控。HMGCR是胆固醇合成的限速酶，SREBP通路与HMGCR降解通路是胆固醇代谢的两个 主要负反馈调控机制（柳童斐等，中国细胞生物学学报，35(4) :401-409, (2013))。SREBP 对HMGCR的调节也与胆固醇调节元件SRE有关，SRE为基因启动子上一个约10bp的顺式 作用元件，SRE不仅存在于LDLR基因启动子中，在某些编码胆固醇或脂肪酸合成途径中酶 的基因启动子中，比如HMGCR基因和乙酰辅酶A合成酶基因的启动子中也有SRE的存在。 SREBP通过SRE调节LDLR基因的转录或其他酶基因的转录，进而调节胆固醇或脂肪酸的代 谢（Rawson et al.，Mol. Cell. Biol. 4:631-640(2003))。
[0008] 目前，针对HMGCR降解通路的药物有HMGCR抑制剂（如他汀类药物statins)，这 种药物治疗虽然能有效降低血浆中50%的胆固醇，但必须终身服用以维持治疗效果（Van Craeyveld E 等，Curr Pharm Des, 2011，17(24) :2575-2591 ;Rahalkar A R等，Mol Genet Metab，2008, 93 (3) : 282-294 ;Kassim SH 等，Hum Gene Ther，24 (1) : 19-26 (2013)) 〇
[0009] 另一方面，有报道从基因水平上针对SREBP通路进行了研究，Chen et al. (2000)采用AAV载体、CMV增强子、actin启动子表达LDLR基因 （Chen SJ等，Mol Ther，2(3) :256-261 (2000))，降低了 40 %的胆固醇的含量。然而，这种非肝特异性表达对其 他细胞造成了杀伤。
[0010] Jacobs et al. (2008)采用AAV载体肝特异性启动子antitrypsin以及apo E增 强子表达 LDLR 基因 （Kassim SH 等，Hum Gene Ther, 24 (1):19-26 (2013))，降低了 40-60 % 的胆固醇的含量。虽然使用了组织特异性启动子，但这种不带胆固醇调节元件SRE的表达 方式，对胆固醇的含量高低的反馈调节不明显，目的基因的表达较为恒定，不能起到调节胆 固醇代谢的作用，难以达到长期治疗的效果。
[0011] 因此，有必要提供一种肝脏特异地、调节性地表达目的基因的载体及其制备方法 和应用。
【发明内容】
[0012] 为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种调节性表达目的基因的载体，所述 调节性表达目的基因的载体包含目的基因表达盒，所述目的基因表达盒包含：肝特异性启 动子、胆固醇调节元件和目的基因，所述胆固醇调节元件、肝特异性启动子与目的基因可操 作地连接。
[0013] 优选地，所述目的基因为蛋白质的编码基因或小分子RNA的编码基因。
[0014] 优选地，所述肝特异性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α -I-抗胰蛋白 酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α -甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II 启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结 合球蛋白启动子、HCR-ApOCII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的 增强子元件结合的AAT启动子、载脂蛋白E启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动 子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白Η启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素 运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及0_纤维蛋白原的启动子、α-Ι-抗糜蛋白酶启动子、 a -2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、 补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α-I-酸性糖蛋白启动子。
[0015] 优选地，所述胆固醇调节元件为基因的启动子中的顺式作用元件，所述基因包括 胆固醇合成途径中或脂肪酸合成途径中酶的编码基因或受体蛋白的编码基因。
[0016] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体还包含Kozak序列和肝特异性定位控制 元件中的至少一种。
[0017] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体不含标准质粒的骨架DNA序列。
[0018] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为微环DNA。
[0019] 本发明第二方面提供了一种调节性表达目的基因的载体的制备方法，包括：
[0020] 将肝特异性启动子、胆固醇调节元件和目的基因插入载体的多克隆位点，得到所 述调节性表达目的基因的载体，所述调节性表达目的基因的载体包含目的基因表达盒，所 述目的基因表达盒包含：肝特异性启动子、胆固醇调节元件和目的基因，所述胆固醇调节元 件、肝特异性启动子与目的基因可操作地连接。
[0021] 优选地，所述载体为病毒载体、原核质粒载体或真核质粒载体。
[0022] 优选地，所述载体为微环DNA空质粒，所述调节性表达目的基因的载体为微环DNA 母质粒，所述微环DNA母质粒经过位点特异性重组后得到不含标准质粒的骨架DNA序列的 调节性表达目的基因的载体，所得不含标准质粒的骨架DNA序列的调节性表达目的基因的 载体包含目的基因表达盒，所述目的基因表达盒包含：肝特异性启动子、胆固醇调节元件和 目的基因，所述胆固醇调节元件、肝特异性启动子与目的基因可操作地连接。
[0023] 优选地，所述不含标准质粒的骨架DNA序列的调节性表达目的基因的载体为微环 DNA。
[0024] 优选地，所述目的基因为蛋白质的编码基因或小分子RNA的编码基因。
[0025] 优选地，所述肝特异性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α -I-抗胰蛋白 酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α -甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II 启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结 合球蛋白启动子、HCR-ApOCII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的 增强子元件结合的AAT启动子、载脂蛋白E启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动 子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白Η启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素 运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及0_纤维蛋白原的启动子、α-Ι-抗糜蛋白酶启动子、 a -2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、 补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及a-ι-酸性糖蛋白启动子。
[0026] 优选地，所述胆固醇调节元件为基因的启动子中的顺式作用元件，所述基因包括 胆固醇合成途径中或脂肪酸合成途径中酶的编码基因或受体蛋白的编码基因。
[0027] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体还包含Kozak序列和肝特异性定位控制 元件中的至少一种。
[0028] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体不含标准质粒的骨架DNA序列。
[0029] 本发明第三方面提供了一种调节性表达目的基因的载体在制备治疗胆固醇代谢 异常疾病的药物中的应用。
[0030] 本发明第四方面提供了一种采用调节性表达目的基因的载体治疗胆固醇代谢异 常疾病的方法，包括如下步骤：
[0031] S01)制备调节性表达目的基因的载体；
[0032] S02)将所述调节性表达目的基因的载体按下述任一步骤操作：
[0033] a)将所述调节性表达目的基因的载体单独用于基因治疗；
[0034] b)将所述调节性表达目的基因的载体与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中 的一种或几种联合用于基因治疗；
[0035] c)采用体内靶向投递的方式将所述调节性表达目的基因的载体直接投递到患者 体内进行治疗；
[0036] d)先通过体外转染技术将所述调节性表达目的基因的载体转染免疫效应细胞，然 后将所述转染有调节性表达目的基因的载体的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。
[0037] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为微环DNA载体。
[0038] 本发明提供了的调节性表达目的基因的载体及其制备方法和应用具有如下有益 效果：
[0039] 本发明提供的调节性表达目的基因的载体同时具有肝特异性启动子和胆固醇调 节元件SRE两种调控元件，由于肝脏是胆固醇代谢的重要器官，肝特异性启动子有利于调 节性表达目的基因的载体的组织特异性表达，提高基因治疗的靶向性；此外，本发明采用的 胆固醇调节元件SRE能充分利用细胞天然的胆固醇反馈调节机制，增强了细胞主动、合适 地对胆固醇的代谢进行调节的内在能力。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明实施例提供的ZY781. bpA空载体的质粒图谱；
[0041] 图2为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. PLDLR. LDLR. bpA的质粒图谱；
[0042] 图3为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA的质粒图 谱；
[0043] 图4为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. PLDLR. UTR. LDLR. bpA的质粒图谱；
[0044] 图5为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA的质粒图 谱；
[0045] 图6为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA的 质粒图谱；
[0046] 图7为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA的质粒图 谱；
[0047] 图8为本发明实施例提供的亲本质粒ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA的 质粒图谱；
[0048] ZY781. ApoE. bpA (本课题组构建保存）；
[0049] 图9~图25为本发明实施例提供的质粒的转染Η印G2细胞后LDLR基因的表达情 况（其中，图9~图16分别为ZY78L bpA空载体 Kozak. LDLR. bpA> MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA转染H印G2细胞后，对各组细胞中LDLR基因的mRNA进行RT-PCR结果，在图9~图16 中，每个图中柱-1为对照组，柱-2为胆固醇组，柱-3为他汀组，表示P〈0. 05, "**"表 示 Ρ〈0· 01 ;
[0050] 图17包括图a~图h，图a~图h分别为ZY781. bpA空载体、微环DNA MC. PLDLR. LDLR. bpA、MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA转染HepG2细胞后，米用突光显微镜观察各组细胞中 LDLr分布情况的结果；
[0051] 图 18 ~图 25 分别为 ZY781. bpA 空载体 Kozak. LDLR. bpA> MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA转染H印G2细胞后，各组细胞中荧光强度的相对值，在图18~图25中，每个图中柱-1 为对照组，柱-2为胆固醇组，柱-3为他汀组，表示P〈0. 05, 表示P〈0. 01 ;);
[0052] 图26~图34为本发明实施例提供的质粒的转染HepG2细胞后LDLR基因的表 达情况（其中，图26包括图a~图h，图a~图h分别为ZY781.bpA空载体、微环DNA MC. PLDLR. LDLR. bpA, MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA, MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA, MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE.