免疫原性肽载体结合物及其生产方法

专利名称：免疫原性肽载体结合物及其生产方法
相关申请的交叉引用本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)在2003年12月17日提交的美国临时专利申请60/530,480的优先权，其在此整体引入作为参考。
背景技术：
适应性免疫的实质是生物体对存在对外来物质作出反应和产生能够与宿主特异性相互作用并保护宿主免受侵害的组分(抗体和细胞)。“抗原“或“免疫原”是能引发此类免疫应答以及能够与致敏细胞和产生的针对该抗原的抗体相互作用的物质。
抗原或免疫原通常是包含被免疫系统的各种组分识别和与之相互作用的独特抗原性位点或“抗原表位”的大分子。它们可以作为单独的分子存在，所述分子由合成的有机化学产物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、RNA、DNA或多糖组成；或者可以是细胞结构(细菌或真菌)或病毒的部分(Harlow和泳道1988 a，b，c；Male等，1987)。
小分子样短肽，尽管通常能与免疫应答的产物相互作用，通常不能独自引起应答。这些肽免疫原或“半抗原”如它们的名称一样，实际上是不完全的抗原，并且，尽管不能够单独导致免疫原性或引发抗体产生，但是它们可以通过与合适的载体连接而产生免疫原性。载体通常是高分子量蛋白质抗原，当体内施用后能引起免疫应答。
在免疫应答中，抗体由B-淋巴细胞连同T-辅助(TH)细胞产生和分泌。在大多数半抗原载体系统中，B-细胞产生对半抗原和载体具有特异性的抗体。在这些情况下，所述T淋巴细胞具有对载体的特异性结合结构域，但是不能单独识别半抗原。以一种协同作用，B和T-细胞协作诱发半抗原特异性抗体应答。在发生这样的免疫应答后，如果宿主随后仅被所述半抗原攻击，通常其应答方式为从首次免疫后形成的记忆细胞产生半抗原特异性抗体。
模拟较大的大分子上一些关键的表位结构的合成半抗原通常结合到载体以产生对更大“母体”分子的免疫应答。例如，短肽片段可以从蛋白质的已知序列合成并连结到载体以诱导针对天然蛋白质的免疫原性。此类产生免疫原的合成方法已成为许多当前疫苗制造研究的基础。然而，在许多情况下，仅仅通过使用合成肽载体结合物产生B-细胞应答不能总是保证对于完整抗原的保护性免疫，尽管设计得非常好。通过来自较大的病毒颗粒或细菌细胞的短肽抗原表位产生的免疫应答可能只够产生B-细胞水平的记忆。在这些情况下，目前通常认为细胞毒性T-细胞应答是保护性免疫更重要的指示。设计具有用于B-细胞和T-细胞识别的合适表位结合位点的肽免疫原是当今免疫学最具挑战性的研究领域之一。
通过将较小或免疫原性差的分子结合到较大的“载体”分子以增加这些分子的免疫原性的方法已经成功使用了几十年(参见，例如Goebel等(1939)J.Exp.Med.6953)。例如，已经描述许多免疫原性组合物，其中纯化的荚膜聚合物与载体蛋白结合以通过利用这种“载体效应”产生更有效的免疫原性组合物，Schneerson等(1984)Infect.Immun.45582-591)。结合作用还显示规避通常用自由多糖免疫婴儿时观察到的较弱的抗体应答(Anderson等(1985)J.Pediatr.107346；Insel等(1986)J.Exp.Med.158294)。
使用各种交联/结合试剂比如同型双功能，异型双功能，或零长度交叉接头已经成功产生了半抗原-载体结合物。许多这样的方法目前可适用于糖类、蛋白质和肽与肽载体的结合。大多数的方法产生胺、酰胺、氨基甲酸乙酯、异硫脲或二硫键或有时产生硫醚。使用结合试剂的缺点是活性部位如果不被中和则自由地与任何不需要的分子体外(从而对结合物的功能或稳定性造成负面影响)或者体内(从而对用该制剂免疫的人或动物带来负面事件的潜在危险)反应，所述结合试剂向载体和/或半抗原分子上活性的氨基酸分子侧链引入活性部位。这种过量的活性部位可以利用各种已知的化学反应进行反应或“加帽”以使这些位点失活，但是这些反应可能破坏结合物的功能。当试图通过将活性部位引入载体分子中时可能特别成问题，因为其较大和更复杂的结构(相对于半抗原)可能使其对于化学处理的破坏性作用更敏感。事实上，还没有通过如下方法制备结合物的已知实例首先活化载体，然后在结合反应中与半抗原反应，最后对剩余的活性部位“加帽”，同时保留所得到的结合物作为具有所需的“载体效应”性质的免疫原性组合物的能力。
发明概述本发明涉及生产肽免疫原与蛋白质/多肽载体的免疫原性结合物的方法，其中所述肽免疫原通过载体氨基酸残基比如赖氨酸残基的衍生官能团结合到载体，其中氨基酸残基任何未结合的衍生的官能团通过加帽而失活以阻止它们与其它的分子，包括蛋白质/多肽的反应从而保留载体的功能，使其维持其引发针对肽免疫原的所需的免疫应答，没有载体则不会产生该免疫应答。此外，本发明还涉及通过上述方法制备的结合物和含有这种结合物的免疫原性组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于通过肽免疫原的氨基酸残基的活性基团将肽免疫原与具有一种或者多种官能团的蛋白质/多肽载体结合的第一种方法，所述方法包括以下步骤(a)衍生蛋白质/多肽载体的一个或者多个官能团以产生具有活性位点的衍生化分子；(b)使步骤(a)的衍生化的蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸残基的活性基团在满足以下情况的反应条件下反应使肽免疫原与衍生的蛋白质/多肽载体经官能团结合；和(c)进一步将结合物与加帽试剂反应以使活化的蛋白质/多肽载体上的自由活性官能团失活，从而保留载体针对肽免疫原的官能度，没有载体则不会产生这一官能度。
在一个实施方案中，所述蛋白质/多肽载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PAN-DR结合肽(PADRE多肽)，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎B表面抗原(HBsAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，CalmetteGuerin(BCG)，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ORF 1224，化脓链球菌ORF 1664，化脓链球菌ORF 2452，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)ORF T367，肺炎衣原体ORF T858，破伤风类毒素，HIV gp 120 T1，识别粘性基质分子的微生物表面组分(MSCRAMMS)，生长因子/激素，细胞因子和趋化因子。
在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体包含T-细胞抗原表位。
在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体是细菌类毒素，比如上述的破伤风类毒素，霍乱毒素或霍乱菌毒素突变体。在优选实施方案中，所述蛋白质/多肽载体是CRM197。
在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体可以是流感血凝素，PADRE多肽，疟疾CS蛋白，乙型肝炎表面抗原(HSBAg19-28)，热休克蛋白65(HSP 65)，或来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(BCG)的多肽。
在优选实施方案中，所述蛋白质/多肽载体选自链球菌的rC5a肽酶，化脓链球菌ORF 1224，化脓链球菌ORF 1664或化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORF T367和肺炎衣原体ORF T858。
在一个实施方案中，蛋白质/多肽载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答，并选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
在一个实施方案中，所述肽免疫原选自细菌蛋白，病毒蛋白，和真核生物蛋白。
在另一实施方案中，所述肽免疫原源自于来自肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphlylococcusepidermidis)，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，大肠杆菌(Esherichia coli)，克雷伯肠杆菌(Klebsiella enterobacter)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，产气夹膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)，肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)，假单孢菌类(Pseudomonas)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，包氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysentriae)，耳炎差异球菌(Alloiococcus otitidis)和B类链球菌(streptococci)的细菌蛋白抗原。
在另一实施方案中，所述肽免疫原源自于来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)的蛋白质抗原。
在另一实施方案中，所述肽免疫原源自于来自念珠菌(Candida)，隐球菌(Cryptococcus)，球孢菌(Coccidioides)，组织浆菌(Histoplasma)和曲霉(Aspergillus)真菌的蛋白质抗原。
在另一实施方案中，所述肽免疫原源自于来自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫的寄生动物的蛋白质抗原。
在另一实施方案中，所述肽免疫原源自于真核生物的蛋白质抗原。在优选实施方案中，所述真核生物是人。
在另一优选实施方案中，所述来自人的肽免疫原来源于恶性肿瘤。在更优选的实施方案中，所述肽免疫原来自于肾细胞癌，乳癌，黑素瘤和前列腺癌的肿瘤抗原。在另一优选的实施方案中，所述肽抗原源自于肿瘤抗原，癌胚抗原(CEA)。
在一方面，本发明提供了肽免疫原，包括引发针对Aβ内某些抗原表位的免疫原性应答的Aβ肽或其片段或其类似物。本发明的免疫原性肽包括免疫原性的异源肽。在一些免疫原性肽中，Aβ片段与载体连接形成免疫原性的异源肽，然后使用本发明的方法将这个异源肽与载体连接形成结合物。
在本发明的另一方面，所述肽免疫原多肽包含至少Aβ1-5位残基的N-末端片段，Aβ的第一个残基是多肽的N-末端残基，其中多肽没有Aβ的C-末端片段。在本发明的另一方面，肽免疫原是包含AβN-末端片段的多肽，该片段起始于Aβ的1-3位残基并终止于7-11位残基。在本发明的一些方面，肽免疫原是一种因子，其诱导针对AβN-末端片段的免疫原性应答，所述片段开始于Aβ的1-3位残基并终止于Aβ的7-11残基，而不诱导针对Aβ43的12-43位残基内的抗原表位的免疫原性应答。在本发明的另一个方面，肽免疫原是异源多肽，包含连接到异源氨基酸序列的Aβ片段，其诱导针对所述异源氨基酸序列的T辅助细胞的应答并从而诱导针对N-末端片段的B-细胞应答。
在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其C-末端连接到异源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端连接到异源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端和C-末端连接到第一和第二异源多肽。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段在其N-末端连接到异源多肽，而其C-末端连接到至少一种N-末端片段的另外的拷贝。在一些肽免疫原中，从N-末端到C-末端，所述多肽包括Aβ的N-末端片段，N-末端片段多个另外的拷贝，和异源氨基酸片段。
在一些上述肽免疫原中，所述多肽还包含N-末端片段至少另外一个拷贝。在一些上述肽免疫原中，所述片段缺少Aβ43中的至少5个C-末端氨基酸。
在上述肽免疫原的一些方面，所述片段最多包含来自Aβ的10个连续的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了肽免疫原，包含引发针对Aβ内某些抗原表位的免疫原性应答的Aβ肽或Aβ的片段或其类似物，这些肽免疫原可以处于称为多抗原肽(MAP)构象的构象。
在本发明一些上述方面，所述肽免疫原来自Aβ的N-末端部分。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是Aβ片段，选自Aβ1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，1-12，1-16，3-6和3-7。在本发明一些上述方面，所述肽免疫原来自Aβ的内部区域。在本发明一些上述方面，所述肽免疫原是选自Aβ13-28，15-24，17-28和25-35的Aβ片段。在本发明一些上述方面，所述肽免疫原来自Aβ的C-末端。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ33-42，35-40和35-42的Aβ片段。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，1-12，1-16，1-28，3-6，3-7，13-28，15-24，17-28，25-35，33-42，35-40和35-42的Aβ片段。在本发明的一些方面，所述肽免疫原选自Aβ1-5，Aβ1-7，Aβ1-9和Aβ1-12的Aβ片段。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ1-5-L，Aβ1-7-L，Aβ1-9-L和Aβ1-12-L的Aβ片段，其中L是接头。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ1-5-L-C，Aβ1-7-L-C，Aβ31-9-L-C和Aβ1-12-L-C的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸残基。
在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ16-22，Aβ16-23，Aβ17-23，Aβ1 7-24，Aβ18-24和Aβ18-25的Aβ片段。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自Aβ16-22-C，Aβ16-23-C，Aβ17-23-C，Aβ17-24-C，Aβ18-24-C和Aβ18-25-C的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸残基。在本发明的一些方面，所述肽免疫原是选自C-Aβ16-22，C-Aβ16-23，C-Aβ17-23，C-Aβ17-24，C-Aβ18-24和C-Aβ18-25的Aβ片段，其中C是半胱氨酸氨基酸残基。
在一些上述肽免疫原中，所述异源多肽选自具有T-细胞表位，B-细胞表位及其组合的肽。
在一个实施方案中，使用交联试剂衍生所述蛋白质/多肽载体或任选连接的多肽接头的一个或者多个氨基酸分子的官能团。在另一个实施方案中，所述衍生试剂是零长度交联试剂。在另一个实施方案中，所述衍生试剂是同型双功能交联试剂。在另一个实施方案中，所述衍生试剂是异型双功能交联试剂。
在优选的实施方案中，所述异型双功能试剂是与蛋白质/多肽载体的一个或者多个氨基酸分子的伯胺或ε-胺官能团反应，或与肽免疫原的一个或者多个氨基酸分子的侧基巯基反应的试剂。在一个实施方案中，所述异型双功能试剂是N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯。
在另一个实施方案，所述伯胺或ε-胺官能团是赖氨酸。在另外的实施方案中，用N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯衍生蛋白质/多肽载体的赖氨酸的伯胺或ε胺官能团导致蛋白质/多肽载体上赖氨酸分子的伯胺或ε胺残基的溴乙酸化。在更优选实施方案中，侧基巯基是肽免疫原的胞嘧啶残基，其可以定位在肽免疫原的氨基末端，肽免疫原的羧基末端或肽免疫原内部。
在另一个实施方案中，所述侧基巯基通过巯基化试剂比如N-乙酰同型半胱氨酸巯基内酯，Traut氏试剂(2-亚胺基四氢噻吩)SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯)，SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基2-吡啶基二硫代甲苯)，硫代LC SPDP(硫代琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酰氨基己酸酯)，SPDP(琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯)。在优选实施方案中，所述用于使活化的/多肽载体上的自由活性官能团失活的加帽试剂选自半胱胺，N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
在特别优选的实施方案中，所述用于使活化的蛋白质/多肽载体上的自由活性官能团失活的加帽试剂选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢铵和氨。
在一个实施方案中，所述肽免疫原的氨基酸残基的活性基团是自由巯基。
在另一个实施方案中，一个或者多个官能团位于任选连接到所述蛋白质/多肽载体的接头上。在优选实施方案中，所述接头是肽接头。在更优选的实施方案中，所述肽接头是聚赖氨酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于将蛋白质/多肽的肽免疫原与具有以下结构的蛋白质/多肽载体结合的第二方法 其中，C是蛋白质/多肽载体，X是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的可衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的可衍生官能团，其中m是大于0但是小于等于85的整数，所述方法包括下列步骤(a)衍生蛋白质/多肽载体或任选连接的接头分子的一个或者多个官能团以产生具有活性位点的衍生化分子；(b)将步骤(a)的衍生化蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸残基的活性基团反应形成共价结合的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物；和(C)另外将上述结合物与加帽试剂反应以使活化的蛋白质/多肽载体上自由活性官能团失活，从而使加帽的基团不与其它的分子，包括蛋白质/多肽自由地反应从而维持载体的官能度，使其维持引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时不会发生，从而产生具有以下通式的加帽的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物 其中，C是蛋白质/多肽载体，Xd是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体氨基酸残基上的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头氨基酸残基上的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体氨基酸残基上的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头氨基酸残基上的衍生官能团，n是大于0但是小于等于85的整数，P是大于0但是小于85的整数。
上述第一方法的详细实施方案还可以用于根据第二方法的描述制备的结合物。
在一个实施方案中，本发明涉及肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物，其中的蛋白质/多肽载体具有如下通式
其中，C是蛋白质/多肽载体，X是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的可衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基上的可衍生官能团，其中m是大于0但是小于等于85的整数，其中加帽的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物具有如下通式 其中，C是蛋白质/多肽载体；Xd是蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生的官能团，以及，其中P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头氨基酸残基上的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，由此维持载体的官能度，从而维持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时不会发生；n是大于0但是小于等于85的整数，p是大于0但是小于85的整数。
所述第一和第二方法的详细实施方案也可用于上面所述的结合物。
在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明第二方法产生的具有以下通式的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物 其中，C是蛋白质/多肽载体，Xd是蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，以及，其中P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体氨基酸残基上的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基上的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，从而保持载体的官能度，以便维持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时不会发生，n是大于0但是小于等于85的整数，p是大于0但是小于85的整数。
所述第二方法的详细实施方案也可用于根据第二方法产生的结合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含通过本发明第二方法产生的肽免疫原与蛋白质/多肽载体的结合物，加上一种或者多种药用赋形剂、稀释剂和佐剂。
所述第二方法和通过这种方法产生的结合物的详细实施方案也可用于含有这些结合物的上述免疫原性组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及诱导哺乳动物受试者免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。
可用于含有本发明结合物的免疫原性组合物的详细实施方案也可用于涉及这些免疫原性组合物的应用方法的本发明的实施方案。


图1显示了用于将Aβ肽片段与蛋白质/多肽载体CRM197结合形成Aβ/CRM197结合物的化学过程的流程图。
图2显示了用于定量测定S-羧基甲基半胱氨酸和S-羧基甲基半胱胺作为肽免疫原-蛋白质/多肽结合物例如Aβ/CRM197结合物的结合程度的评价的流程图。
图3该图显示了Aβ肽/CRM结合反应的pH依赖性。
图4该图显示了Aβ-肽/CRM结合对肽CRM比例的依赖性。
图5Aβ1-7/CRM结合的加帽过程的验证。反应的pH为9.15。与肽的反应时间为16hr，用N-乙酰半胱胺加帽为8hr。
图6与不同的肽以不同的CRM肽比例进行结合和加帽。反应的pH为9.0。与肽的反应时间为16hr，用N-乙酰半胱胺加帽的时间为8hr。
图7用Aβ肽结合物与不同的佐剂免疫灵长类动物后第36天的灵长类动物血清的效价。
图8用Aβ肽结合物与不同的佐剂免疫灵长类动物后第64天的灵长类动物的血清效价。
图9按天数和处理组的灵长类动物的效价。灵长类动物用Aβ1-7或Aβ1-5CRM197结合物与明矾或529作为佐剂免疫，在第29、36、57和54天测量抗Aβ抗体的效价。
图10利用tris-tricine预制凝胶使用SDS-PAGE Western印迹表征确定肽蛋白结合物。泳道排列如下分子量标记(泳道1)；L-2837524/01(泳道2)；L-28375 24/02(泳道3)；L-28375 24/03(泳道4)；L-2837524/04(泳道5)；L-28375 24/05(泳道6)；L-28375 24/06(泳道7)；L-28375 24/07(泳道8)；L-28375 24/08(泳道9)；L-28375 24/09(模拟物)(泳道10)和BrAcCRM197(泳道11)。
序列的简述



发明详述本发明涉及产生肽免疫原结合物的方法，其中的载体上在活化过程中产生的未反应的活性官能团通过使用加帽试剂比如N-乙酰半胱胺失活以阻止它们进一步反应。本发明还涉及通过那些方法产生的加帽的载体-肽免疫原结合物，并涉及包含上述结合物的免疫原性组合物。
通过结合作用提高小分子或免疫原性较差的分子比如糖类的免疫原性的方法已经成功地使用了几十年(参见，例如Goebel等(1939)J.Exp.Med.6953)，许多免疫原性组合物已经被描述，其中纯化的荚膜聚合物已经结合到载体蛋白以通过利用“载体效应”产生更有效的免疫原性组合物。例如，Schneerson等(J.Exp.Med.152361-376，1980)描述了产生对由该生物引起的侵袭性疾病的免疫力的流感嗜血杆菌(Haemophilus influetizae)b多糖蛋白质结合物。PRP(聚核糖基核糖醇磷酸酯，流感嗜血杆菌b的荚膜聚合物)已经被证明比仅基于多糖的免疫原性组合物更有效(Chu等，(1983)Infect.Immun.40245；Schneerson等(1984)，Infect.Immun.45582-591)。结合作用还显示规避了通常当用自由多糖免疫婴儿时观察到的较弱的抗体应答(Anderson等(1985)JPediatr.107346；Insel等(1986)J.Exp.Med.158294)。
使用细菌毒素或类毒素作为蛋白质载体另外的优点是在针对与荚膜聚合物有关的病原体的免疫的同时诱导了对毒素或类毒素的所需的免疫力，其中针对上述毒素或类毒素的人常规免疫接种(例如，破伤风或白喉)是标准操作。
抗原决定簇/半抗原-载体结合物还用于产生高度特异性的单克隆抗体，该抗体可识别结合的半抗原上不连续的化学表位。所得到的单克隆抗体通常用来研究表位的结构和天然蛋白质之间的相互作用。在许多情况下，所述用于产生这些单克隆抗体的抗原决定簇/半抗原是代表较大的蛋白质表面上重要的抗原性位点的小肽片段。用于产生抗原决定簇/半抗原-载体结合物的成功的载体的标准是潜在的免疫原性，存在用于与抗原决定簇/半抗原结合的合适的官能团，在衍生后合理的溶解性能和没有体内毒性。
通过本发明的方法产生的结合物符合这些标准。结合物可以是使用此处描述的结合方法产生的任何稳定的肽免疫原-载体结合物。使用本发明的方法产生了所述结合物，其中具有以下结构的蛋白质/多肽载体 被共价连接到蛋白质/多肽载体，其中C是蛋白质/多肽载体，X是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的可衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的可衍生官能团，其中m是大于0但是小于等于85的整数，被共价连接到肽免疫原，其中的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物具有如下通式 其中，C是蛋白质/多肽载体；，Xd是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，p是肽免疫原，其共价连接到蛋白质/多肽载体上的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头上氨基酸残基的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体氨基酸残基上的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基上的衍生官能团，从而保持载体的官能度，以便维持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时不会发生，n是大于0但是小于等于85的整数，P是大于0但是小于85的整数。
载体的选择一些肽免疫原包含合适的表位用于诱导免疫应答，但是太小而没有免疫原性。在这个情况下，所述肽免疫原连接到合适的载体以帮助引发免疫应答。在上述通过本发明方法产生的肽免疫原-载体结合物的示意中，C是蛋白质/多肽载体，肽免疫原通过载体自身的氨基酸残基上的衍生的官能团直线结合到上述载体上，或通过共价连接到载体的肽接头上的衍生的官能团间接结合到载体上。合适的蛋白质/多肽载体包括，但是不限于，白蛋白(包括人血清白蛋白)，匙孔-血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，破伤风类毒素或来自其它的病原菌的减毒类毒素，包括突变体，比如白喉，E.coli，霍乱，或幽门螺杆菌(H.pylori)，或减毒的毒素衍生物。一种这样的载体是与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白(SEQ ID NO.40)。
其它的载体包括结合到多个MHC等位基因的T-细胞表位，如至少全部的人MHC等位基因的75％。这样的载体有时在本领域称作“通用的T-细胞表位”。具有通用的T-细胞表位示例的载体包括流感嗜血杆菌HA307-319PKYVKQNTLKLAT(SEQ.ID NO.11)PAN-DR肽(PADRE肽) AKXVAAWTLKAAA(SEQ.ID NO.12)疟疾CST3表位EKKIAKMEKASSVFNV(SEQ.ID NO.13)乙肝表面抗原HBAg19-28FELLTRILTI(SEQ.ID NO.14)热休克蛋白65hsp65153-171QSIGDLIAEAMDKVGNEG
(SEQ.ID NO.15)Calmette-Guerin杆菌(BCG)QVHFQPLPPAVVKL(SEQ.ID NO.16)破伤风类毒素TT830-844QYIKANSKFIGITEL(SEQ.ID NO.17)破伤风类毒素TT947-967NNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ.ID NO.18)HIVgp120T1KQIINMWQEVGKAMY(SEQ.ID NO.19)CRM197参见“序列简述”(SEQ IDNO.40)白蛋白片段 ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO41)用于刺激或增强免疫应答并可以与肽免疫原或半抗原结合的其它载体包括细胞因子，比如IL-1，IL-1α和β肽，IL-2，γINF，IL-10，GM-CSF和趋化因子，比如MIP1α和β以及RANTES。免疫原性肽还可以连接到增强透过组织的运输的蛋白质/肽载体，如O′Mahony，WO97/17163和WO 97/17614的描述，其在此全文引作所有目的的参考。
另外的载体包括重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌ORFs 1224，1664和2452，肺炎衣原体ORFs T367和T858，生长因子和激素。
在本发明的一个优选实施方案中，载体蛋白是CRM197，初级序列具有一个氨基酸改变的白喉毒素无毒性突变体。由于单个核酸密码子的改变，所述分子52位的氨基酸甘氨酸被谷氨酸取代。由于这个改变，所述蛋白质缺乏ADP-核糖基转移酶活性并变成无毒性的。其分子量为58,408Da。根据美国专利5,614,382的描述，通过重组表达产生大量的CRM197，上述专利在此引入作为参考。通过经过赖氨酸残基ε氨基连接进行糖类以及肽与CRM197的结合反应。通过数种商品可以确认CRM197是B-细胞表位出色且安全的载体。
免疫原性肽此处使用的术语“肽免疫原”或“半抗原”是在其给药到哺乳动物后可以引发、促进或被诱导产生免疫应答的任一蛋白质或亚单位结构/片段/类似物。尤其是，所述术语用来指来自任何来源(细菌/病毒或真核细胞)的多肽抗原决定簇，其可以使用此处公开的方法被结合到载体。这种多肽免疫原/抗原决定簇可以是病毒来源、细菌来源或真核细胞来源的决定簇。
来自细菌细胞的肽免疫原包括那些来源于细菌细胞表面或分泌性蛋白质的肽免疫原，其可被用于基于蛋白质的免疫原性组合物中。示例的菌株包括肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，克雷伯氏菌，假单孢菌，沙门氏菌，志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
来自病毒的示例性肽免疫原包括作为例子的来源于人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，爱泼斯坦-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)的那些肽免疫原。
示例性真菌肽免疫原包括那些来源于白假丝酵母(Candidaalbicaiis)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，组织浆菌和曲霉的肽免疫原。寄生虫的抗原包括那些来源于疟原虫，锥虫，血吸虫，利什曼原虫等的肽抗原。
可以结合到载体用作预防、治疗、防疫或改善各种人类疾病的免疫治疗剂的示例性的真核生物肽免疫原包括以下的免疫原与肿瘤细胞有关的、来源于Aβ的39-43个氨基酸的肽，优选42个氨基酸，所述Aβ是阿尔茨海默病(AD)特有的斑的主要成份(参见US 4,666,829；Glenner & Wong(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.1201131，Hardy(1984)TINS 201131；Hardy(1977)TINS 20154)，那些来源于糊精的淀粉样蛋白肽，参与II型糖尿病的胰岛细胞产生的多肽物质，来源于低密度脂蛋白基因产物的肽，其已知与动脉粥样硬化有关和来源于炎性细胞因子和生长因子比如白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和GDF-8的抗原性肽。这样的真核生物肽免疫原可以包括T-细胞(CTL)或B-细胞表位。
“CTL表位”是一种来源于潜在的靶抗原所选定的表位区域的表位，比如肿瘤相关抗原包括但不限于肾细胞癌，乳癌，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原，和前列腺癌特异性抗原比如前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺干细胞抗原(PSCA)，丙型肝炎抗原，Aβ，也称作β淀粉样肽或A4肽(参见，US4,666,829；Glenner &Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.，120，1131(1984))是39-43个氨基酸的肽，其是阿尔茨海默病特有的斑的主要成份。通过用两种称作β和γ分泌酶(secretases)(参见Hardy，TINS 20，154(1997))的酶加工较大的蛋白ABP而产生Aβ。APP中已知与阿尔茨海默病有关的突变发生在β或γ分泌酶位点附近或发生在Aβ内。例如，717位点在γ分泌酶切割APP加工为Aβ的位点附近，670/671位点在β分泌酶切割位点附近。据信突变通过与形成Aβ的切割反应相互作用以致产生42/43氨基酸形式的Aβ的增加而导致AD。
Aβ具有固定和活化经典和旁路补体级联反应独特特性。尤其是，其结合到Clq并最终结合C3bi。这种关联促进与导致B-细胞活化的巨噬细胞的结合。此外，C3bi外降解然后以T-细胞依赖的方式结合到B-细胞上的CR2，导致这些细胞的活化增加10,000倍。这种机制促使Aβ产生免疫应答超过其它抗原产生的免疫应答。
Aβ具有数个天然存在的形式。人的Aβ形式涉及Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42和Aβ43。这些肽的序列和其与APP前体的关系如Hardy等，TINS 20，155-158(1997)的图1所示。例如Aβ42具有如下序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH(SEQ ID NO.21)。
Aβ41，Aβ40和Aβ39与Aβ42的区别在于从C-末端分别缺失了Ala，Ala-Ile和Ala-Ile-Val。Aβ43与Aβ42的区别在于C-末端存在苏氨酸残基。
Aβ片段肽免疫原相对于完整的分子在用于本发明方法时出于数个原因是有利的。首先，因为只有Aβ内部的某些表位诱导用于治疗阿尔茨海默病有用的免疫原性应答，含有这种表位的相等剂量片段比完整Aβ的剂量提供更大摩尔浓度的有用的免疫原性表位。其次，Aβ的某些肽免疫原产生针对淀粉状沉积的免疫原性应答，而不产生针对作为Aβ起源的APP蛋白质的显著的免疫原性应答。第三，Aβ的肽免疫原比完整的Aβ制造更简单，因为其长度较短。第四，Aβ的肽免疫原不以与完整的Aβ相同的方式聚集，简化了具有载体的结合物的制备。
一些Aβ肽免疫原具有来自天然肽的至少2，3，5，6，10或20个连续的氨基酸序列。一些肽免疫原只有来自Aβ的不超过10，9，8，7，5或3个连续的残基。在优选实施方案中，来自Aβ的N-末端部分的肽免疫原被用于制备结合物。优选的肽免疫原包括Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-11，3-7，1-3和1-4。例如Aβ1-5的命名指包含Aβ的1-5位残基的N-末端片段。在N-末端开始而终止于Aβ的7-11位之内的残基的Aβ片段是特别优选的。Aβ1-12片段也可以使用但是较不优选。在一些方法中，所述片段是Aβ1-10以外的N-末端片段。其它的优选片段包括Aβ13-28，15-24，1-28，25-35，35-40，35-42及其他内部片段和C-末端片段。
本发明的一些Aβ肽是免疫原性肽，将其给药到人患者或动物后产生特异性结合到Aβ16和25位残基之间的一种或者多种表位的抗体。优选的片段包括Aβ16-22，16-23，17-23，17-24，18-24和18-25。特异性结合到16和25位残基之间的表位的抗体特异性结合到可溶的Aβ而不结合到Aβ的斑。这些类型的抗体可以特异性结合到在患者或动物模型的循环循环系统的可溶性Aβ，而不特异性结合到患者或模型脑中的Aβ沉积的斑。抗体与可溶性Aβ的特异性结合抑制Aβ被引入到斑中，从而或者抑制患者斑的发展，或者如果这种斑在给药治疗之前已经发展的话，则抑制斑的尺寸或频率的进一步增加。
优选地，给药的Aβ片段缺乏产生针对该片段的T-细胞应答的表位。通常，T-细胞表位大于10个连续氨基酸。因此，优选的Aβ片段大小为5-10或优选7-10个连续氨基酸，或最优选7个连续的氨基酸；即足以产生抗体应答而不产生T-细胞应答的长度。缺少T-细胞表位是优选的，因为这些表位不是片段的免疫原性活性所需的，并可能在一部分患者中导致不希望的炎性应答(Anderson等，(2002)J.Immunol.168，3697-3701；Senior(2002)Lancet Neurol.1，3)。
片段Aβ15-25和其7-8个连续氨基酸的子片段是优选的，因为这些肽一致性地产生针对Aβ肽的高度免疫原性应答。这些片段包括Aβ16-22，Aβ16-23，Aβ16-24，Aβ17-23，Aβ17-24，Aβ18-24和Aβ18-25。特别优选的Aβ15-25亚片段长度为7个连续氨基酸。例如Aβ15-21的名称表示包含Aβ的15-21位残基并缺乏Aβ的其它残基的片段。并优选7-10个连续的氨基酸。这些片段可以产生包含末端特异性抗体的抗体应答。
Aβ的肽免疫原需要筛选清除或阻止类淀粉物沉积的活性(参见WO 00/72880，其在此处全文引作所有目的的参考)。Aβ的N-末端片段的给药在体内和在体外诱导识别Aβ沉积的抗体的产生。缺乏存在于天然形式Aβ的至少1个，和有时至少5或10个C-末端氨基酸的片段被用于一些方法中。例如，缺乏Aβ43 C-末端的5个氨基酸的片段包含来自Aβ的N-末端的最初38个氨基酸。
除非另有陈述，所指的Aβ包含上述指明的天然的人氨基酸序列以及包括等位基因、物种的和诱发突变体的类似物。类似物通常和天然存在的肽由于保守性取代在一个、两个或几个位点存在差异。类似物通常显示出与天然的肽至少80或90％的序列同一性。一些类似物还包括非天然氨基酸或N-或C-末端氨基酸在一个、两个、或几个位置的修饰。例如，Aβ的位点1和/或7的天然的天冬氨酸残基可被异天冬氨酸取代。
非天然氨基酸的例子是D，α，α二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，4-羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，氧-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-N-甲基精氨酸，β-丙氨酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，甲状腺素，γ-氨基丁酸，高丝氨酸，瓜氨酸和异天冬氨酸。免疫原性肽还包括Aβ类似物及其片段。本发明的一些治疗性剂是全-D肽，例如，全-DAβ，全-DAβ片段或全-DAβ或全-DAβ片段的类似物。可以与未经治疗的或安慰剂对照组比较，在转基因动物模型中筛选片段和类似物的预防或治疗效力，，如WO00/72880的描述。
肽免疫原还包括较长的多肽，其包括例如，连同其它氨基酸的免疫原性的Aβ肽。例如，优选的免疫原性肽包括包含连接到异源氨基酸序列的Aβ片段的融合蛋白，所述异源氨基酸序列诱导针对该异源氨基酸序列的辅助性T-细胞应答，并从而诱导针对Aβ片段的B-细胞应答。
可以与未经治疗的或安慰剂对照组比较，在动物模型中筛选这种多肽的预防或治疗效力，如WO 00/72880的描述。
Aβ肽，类似物，免疫原性片段或其它的多肽可以解聚或聚合的形式给药。解聚Aβ或其片段表示单体的肽单元。解聚Aβ或其片段通常是可溶的，并且能够自聚集以形成可溶的寡聚体，原纤维和ADDLs。Aβ和其片段的寡聚体通常是可溶的并主要以α-螺旋或无规卷曲的形式存在。聚集的Aβ或其片段指连接成不溶性的β折叠的Aβ或其片段的寡聚体。聚集的Aβ或其片段还表示原纤维聚合物。原纤维通常是不溶性的。一些抗体结合到可溶性Aβ或其片段或聚集的Aβ或其片段。免疫原性肽还包括单体免疫原性肽的多聚物。Aβ肽之外的免疫原性肽应该诱导针对一种或者多种上面列举的优选Aβ片段(例如，Aβ1-3，1-7，1-10和3-7)的免疫原性应答。
使用本发明方法将本发明的免疫原性肽与载体连接形成结合物。所述免疫原性肽可以在其氨基末端，其羧基末端，或以上两者连接到载体以形成结合物。任选地，结合物中可以存在免疫原性肽的多个重复。
Aβ的N-末端片段可以在其C-末端连接到载体肽以形成结合物。在这样的结合物中，Aβ片段的N-末端残基构成了结合物的N-末端残基。因此，这种结合物可有效诱导结合到要求AβN-末端残基处于自由形式的抗体。本发明的一些免疫原性肽包括在C-末端连接到一个或多个载体肽拷贝以形成结合物的Aβ的N-末端片段的多个重复。引入到这种结合物的AβN-末端片段有时在Aβ1-3开始并在Aβ7-11终止。Aβ1-7，1-3，1-4，1-5和3-7是优选的N-末端片段。一些结合物包括串连的不同Aβ的N-末端片段。例如，结合物可以包括后面跟着连接到载体的Aβ1-3的Aβ1-7。
一些结合物中，Aβ的N-末端片段在其N-末端连接到载体肽。同样多样的Aβ的N-末端片段可以与C-末端连接一样使用。一些结合物包括连接到N-末端片段的N-末端的载体肽，其反过来串连连接到一个或多个另外的AβN-末端片段。优选地，这样的免疫原性Aβ片段，一旦结合到合适的载体，诱导特异性针对Aβ片段而针对Aβ的其它片段的免疫原性应答。
本发明的免疫原性肽包括免疫原性的异源肽。在一些免疫原性肽中，Aβ片段连接到载体以形成免疫原性的异源肽。这种异源肽使用本发明的方法连接到载体形成结合物。一些免疫原性的异源肽包括连接到破伤风类毒素表位的Aβ片段，比如描述在US5,196,512，EP378,881和EP427,347。任选地，免疫原性的肽可以连接到一个或多个载体拷贝，例如在所述载体的N和C-末端形成免疫原性的异源肽。其它这些免疫原性异源肽包括连接到US5,736,142描述的载体肽的Aβ片段。例如，免疫原性的异源肽可以包括Aβ1-7，继之以Aβ1-3，紧接着载体。这种免疫原性异源肽的例子包括线性构象的Aβ1-7/破伤风类毒素 830-844+947-967DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SFQ ID NO.24)US5,736,142描述的肽(全为线性构象)PADRE/Aβ1-7AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD(SEQ ID NO.26)Aβ1-7x3/PADREDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ IDNO.27)PADRE/Aβ1-7x3AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.28)Aβ1-7/PADRE
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO.29)Aβ1-7/白蛋白片段DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.30)Aβ4-10/白蛋白片段FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.31)Aβ3-9/白蛋白片段EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.32)HA307-319/Aβ1-7x3PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.33)Aβ1-7/HA307-319/Aβ1-7DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD(SEQ ID NO.34)Aβ1-7x3/HA307-319DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQIDNO.35)Aβ1-7x2/HA307-319DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO.36)Aβ1-7/HA307-319/疟疾CS/TT830-844/TT947-967/Aβ1-7DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ IDNO.37)
Aβ1-7x3/TT830-844/C/TT947-967DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.38)Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.39)Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967/Aβ1-7DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ ID NO.20)一些免疫原性的异源肽包括通式2x代表的免疫原性肽的多聚体，其中x是1-5的整数。优选x是1，2或3，2为最优选的。当x为2时，这种多聚体具有四个免疫原性肽连接为称作MAP4的优选构象(参见US 5,229,490)。然后使用本发明方法将这样的免疫原性肽与载体连接以形成结合物。
MAP4构象显示如下，其中通过引发N-末端以及赖氨酸的侧链胺的肽合成产生分支结构。根据赖氨酸被引入到序列中的次数和产生分支，所得到的结构将呈现多个N-末端。在这个例子中，在分支的含有赖氨酸的核心已经产生了四个相同的N-末端。这种多重性大大增强了同源B-细胞的反应性。

这种免疫原性异源肽的例子包括MAP4构象的Aβ1-7/破伤风类毒素830-844DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.22)MAP4构象的Aβ1-7/破伤风类毒素947-967DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.23)MAP4构象的Aβ3-9/破伤风类毒素830-844EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.25)2分支树脂上的DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL Aβ肽，类似物，活性片段或其它的多肽可以连接的或多聚形式或以解聚形式给药。治疗剂还包括单体免疫原性剂的多聚体。Aβ肽以外的试剂应该诱导针对上面列举的一种或者多种优选Aβ片段的免疫原性应答(例如1-10，1-7，1-3和3-7)，还可以使用本发明的方法结合到载体。优选这种试剂一旦结合到合适的载体，就诱导特异性针对这些片段之一的免疫原性应答而不涉及其它的Aβ片段。为促进肽免疫原与载体的结合作用，可以向抗原决定簇的末端添加另外的氨基酸。所述另外的残基还可以用于修饰所述肽免疫原的物理或化学特性。氨基酸比如酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天冬氨酸等可以被引入到所述肽免疫原的C-或N-末端。另外，还可以引入含有氨基酸比如甘氨酸和丙氨酸的肽接头。此外，抗原决定簇可以通过末端NH2-基团酰化修饰与天然的序列相区别，例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代乙醇酰乙酰化，末端羧基酰胺化，例如氨，甲胺，等等。在一些情况下，这些修饰可以提供连接到支持物或其它分子的位点。
用于使用此处公开的方法产生本发明的结合物的肽免疫原可以通过连接形成聚合物(多聚体)，或可以不连接而配制在免疫原性组合物中作为掺合物而进行组合。其中肽连接到相同的肽，从而形成同聚体，存在多个重复表位单位。例如，多抗原肽(MAP)技术用来构成含有CTL和/或抗体肽和肽的聚合物。当所述肽不同时，提供了例如代表不同病毒亚型，同一亚型的不同表位，不同的HLA限制特异性，或包含T辅助细胞表位的肽，具有重复单元的异聚物的混合物。除共价键之外，还预期包括可以形成分子间和结构内键的非共价连接。
这样的肽免疫原和它们的类似物通过固相肽合成或重组表达合成，或来自天然来源。自动肽合成仪是可以从许多的厂商，比如AppliedBiosystems，Foster City，California购买到的。
重组表达可以在细菌(比如大肠杆菌)，酵母，昆虫细胞或哺乳动物细胞中进行。用于重组表达的方法参见Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，NY，第2版，1989)的描述。一些免疫原性肽是可以商业购得(例如，American PeptidesCompany，Inc.，Sunnyvale，CA，和California Peptide Research，Inc.，Napa，CA)。
还可以筛选肽或其它化合物的随机库中作为肽免疫原的适合性。可以产生许多类型化合物的组合库，其可以通过逐步的方式合成。这种化合物包括多肽，β-折叠模拟物，激素，寡聚的N-取代的甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯等等。化合物的较大组合库可以通过WO 95/12608，WO 93/06121，WO 94/08051，WO 95/35503和WO 95/30642(各自在此处引作所有目的的参考)描述的编码合成库(ESL)的方法进行构建。肽库还可以通过噬菌体展示法产生(参见，如，Devlin，WO 91/18980)。
免疫原性肽的衍生以及与蛋白质载体的结合肽免疫原与蛋白质/多肽载体的连接位点和用于将肽免疫原连接到载体的交联剂的性质对于得到的针对其的抗体的特异性来说都是重要的。为了正确识别，肽免疫原必须以合适的定向与载体连接。为了抗体识别随后没有载体的自由肽免疫原，肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物必须以暴露且可接近的形式呈递肽免疫原。常常通过将交联反应引导到肽免疫原上的特异性位点实现最佳的定向。用肽免疫原获得这种定向的一种方法是通过在肽合成过程中连接末端半胱氨酸残基。这在肽的一端提供了用于结合载体的巯基。通过这个基团的交联提供了肽免疫原仅仅在一端的连接，从而保证了一致的定向。
在肽免疫原-载体结合作用中，目标不是保持载体的天然状态或稳定性，而是以最可能的方式将半抗原递呈到免疫系统。在实现这一目标的过程中，结合化学物质的选择可以控制得到的针对半抗原产生的抗体的效价、亲合性和特异性。有时选择含有足以不受限制的方式呈递抗原的长间隔臂的交联剂是很重要的。控制载体表面上肽免疫原的密度可能也是重要的。太少的肽免疫原取代可能导致很少或没有反应。肽免疫原密度过高实际上可能导致免疫抑制和降低应答。此外，交叉接头本身可能产生不希望的免疫应答。在选择合适的交联试剂以及合适的蛋白质/多肽载体和肽免疫原的比例时均需要考虑到这些问题。
将蛋白质/肽载体连接到肽免疫原的多种方法是可能的。可以通过末端或通过赖氨酸的ε-氨基实现离子相互作用。残基的侧基和肽免疫原之间的氢键也是可能的。最后，蛋白质/肽载体和免疫原性肽之间的构象相互作用可能产生稳定的连接。
已经使用多种交联剂比如零长度，同型双功能或异型双功能交联剂成功产生了肽免疫原-载体结合物。用于生物结合的最小的有效试剂系统是所谓的零长度交叉接头。这些化合物介导通过形成不含有另外的原子的键而介导两个分子的结合作用。因此，分子的一个原子是间隔臂。在许多结合方案中，最终的复合物通过向被交联的物质添加外来结构的化学成分而彼此结合。在一些应用中，这些插入接头的存在可能目的用途是有害的。例如，在制备肽免疫原-载体结合物时，以产生对所连接的半抗原的免疫应答为目的形成复合物。有时，通过这个反应产生的抗体的一部分对用于结合过程的交联试剂具有特异性。零长度交联剂通过介导两个物质之间的直接连接而排除了此类交叉反应活性的可能性。
作为用于大分子修饰和结合的第一种交联剂的同型双功能剂，由在两个末端含有同样官能团的双反应性化合物组成(Hartman和Wold，1966)。这些试剂可以与两个分子上相同的常见基团共价反应将一个蛋白共价连接到另一个蛋白。因此，一种蛋白的赖氨酸ε-胺或N-末端胺可以在存在同型双功能试剂的情况下通过将二者简单混和而交联到第二蛋白质上的相同官能团。
异型双功能结合剂包含两个不同的活性基团，其可以连接到蛋白质和其它大分子上两个不同功能性靶。例如，交叉接头的一个部分可以包含胺反应基团，而另一个部分可能由巯基反应性基团组成。结果是能够将交联反应引导到靶分子的选定部分，从而收集对于结合过程更好的控制。
异型双功能试剂用来以两步骤或三步骤方法交联蛋白质和其它分子，所述方法限制了通常使用同型双功能交叉接头获得的聚合度。
目前许多方法可用于利用零长度、同型双功能或异型双功能交联剂将肽免疫原与蛋白质/多肽载体结合。大多数的方法产生胺，酰胺，氨基甲酸乙酯，异硫脲或二硫键或有时产生硫醚。更通用的将蛋白质或肽连接到肽的方法利用双功能交联剂。这些交联剂是小间隔臂分子，在各末端具有活性基团。间隔臂分子可以在各末端具有相同的或不同的活性基团。最常见的活性官能团，连接基团和形成的键是
1.醛-氨基→仲胺2.马来酰亚胺-巯基→硫醚3.琥珀酰亚胺-氨基→酰胺4.Imidate酯-氨基→酰胺5.叠氮基苯-氨基→苯基胺6.酰卤-巯基→硫醚7.吡啶基二硫化物-巯基→二硫化物8.异硫氰酸酯-氨基→异硫脲给定载体蛋白的反应性，就其通过交联剂的修饰使其可以结合到肽免疫原的能力而言，通过其氨基酸组成和单独的氨基酸在分子三维结构中的序列位置以及通过肽免疫原的氨基酸组成来进行测定。
就蛋白质/肽载体和其它肽(例如，蛋白质/肽载体和肽免疫原)之间的接头(“L”)而论，间隔臂通常选自Ala，Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其它中性间隔臂。在某些实施方案中，中性间隔臂是Ala。应该理解，任选存在的间隔臂没必要由相同的残基组成，并因此可以是异型或同型寡聚物。示例性的间隔臂包括Ala的同型寡聚体。当存在是，间隔臂通常是至少一个或两个残基，更通常三到六个残基。在其它的实施方案中，所述蛋白质/多肽载体结合到肽免疫原，优选蛋白质/肽载体位于氨基末端。肽可以通过中性接头，比如Ala-Ala-Ala等接头连接，并优选另外包含连接到Lys残基((PAM)2Lys)的α和ε氨基的脂残基比如棕榈酸等，其通常通过Ser-Ser键等连接到肽结合物的氨基末端。
在本发明一些方面，肽免疫原是Aβ片段，选自Aβ1-5-L，Aβ1-7-L，Aβ1-9-L和Aβ1-12-L。在本发明的一些方面所述接头是GAGA(SEQ ID NO10)。
为促进肽免疫原与载体的结合，可以向抗原决定簇的末端添加另外的氨基酸。所述另外的残基还可以用于修饰所述肽免疫原的物理或化学性质。氨基酸比如酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，等等，可以被引入到所述肽免疫原的C-或N-末端。另外，还可以引入含有氨基酸比如甘氨酸和丙氨酸的肽接头。此外，抗原决定簇可以通过末端NH2-基团酰化修饰而不同于天然的序列，例如例如通过烷醇基(C1-C20)或硫代乙醇酰乙酰化，末端羧基酰胺化，例如氨，甲胺等等。在一些情况下，这些修饰可以提供连接到支持物或其它分子的位点。
在本发明一些方面，肽免疫原是Aβ片段，选自Aβ1-5-C，Aβ1-7-C，Aβ1-9-C和Aβ1-12-C，其中C是半胱氨酸氨基酸残基。在本发明的一些方面，肽免疫原是Aβ片段，选自Aβ1-5-L-C，Aβ1-7-L-C，Aβ1-9-L-C和Aβ1-12-L-C。
肽免疫原直接或者通过肽免疫原氨基或羧基末端的接头连接到蛋白质/肽载体。肽免疫原或蛋白质/肽载体的氨基末端可以被酰基化。此外，肽免疫原-蛋白质/肽载体结合物可以通过一个或多个连接残基比如如下所述的Gly，Gly-Gly，Ser，Ser-Ser连接到某些alkanyol(C1-C20)脂。其它有用的脂部分包括胆固醇，脂肪酸等。
肽免疫原可以通过化学交联连接到载体。用于将免疫原连接到载体的技术包括使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson，J等(1978)Biochem J，173723，)和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羰酸酯(SMCC)形成二硫键(如果肽缺乏巯基，可以通过向半抗原添加半胱氨酸残基而提供)。这些试剂通过赖氨酸上的ε氨基或其它氨基酸中的自由氨基在它们自身以及一种蛋白质的肽半胱氨酸残基之间形成二硫键和酰胺键。二硫化物/酰胺的多种形成试剂描述在Immune Rev.6285(1982)中。其它的双功能偶联剂形成硫醚而非二硫键。形成硫醚的试剂包括6-马来酰亚胺基己酸，2-溴乙酸和2-碘乙酸，4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸的活性酯。羧基可以通过将其与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐组合而进行活化。
最常见的，赖氨酸残基是载体蛋白上发现的最丰富的氨基酸残基，这些残基使用交联试剂修饰以产生随后连接到半抗原的亲核性位点。这种连接是通过化学活性的半抗原分子上任何亲水的侧链来实现的。这些包括精氨酸的胍基，谷氨酸和天冬氨酸的羧基，半胱氨酸的巯基和赖氨酸的ε-氨基等。使用交联剂修饰蛋白质使其可以连结到其它的部分，这些交联剂与蛋白质载体或半抗原分子上的任何侧链起化学反应。
在本发明的一个方面，有或者没有接头分子的载体蛋白被试剂官能化(衍生化)，该试剂向载体蛋白分子引入活性部位，该载体蛋白分子可以进行进一步的修饰引入亲核基团。在一个实施方案中，载体与卤酰化试剂反应，其优先与蛋白质氨基酸残基上的大量官能团反应，比如半胱氨酸的巯基，赖氨酸残基的伯ε胺基，α胺的α末端，甲硫氨酸的硫醚和组氨酸的两个咪唑基侧链氮(Gurd，1967)。在优选实施方案中，载体蛋白的赖氨酸残基上的伯ε胺基用b N-羟基琥珀酰亚胺基溴乙酸酯衍生以产生溴乙酰化的载体。通过向含有肽免疫原的溶液缓慢添加活化载体进行肽免疫原和活化的蛋白质载体的结合。
通过使本发明的方法，上述B部分论述的肽免疫原可以结合到上述A部分论述的任何载体。从本发明方法所得到的结合物被用作产生用于被动/主动免疫治疗的针对Aβ的抗体的免疫原。此外，连接到载体的Aβ或Aβ片段可以给药到实验动物产生针对Aβ的单克隆抗体。
在本发明的一个方面，结合物选自Aβ1-7-CRM197，(Aβ1-7x3)-CRM197和(Aβ1-7x5)-CRM197。在本发明的一个方面，结合物选自CRM197-Aβ1-5，CRM197-Aβ1-7，CRM197-Aβ1-9，和CRM197-Aβ1-12。在本发明的另一个方面，结合物选自Aβ1-5-C-CRM197，Aβ1-7-C-CRM197，Aβ1-9-C-CRM197，和Aβ1-12-C-CRM197，Aβ16-23-C-CRM197，Aβ17-24-C-CRM197，Aβ18-25-C-CRM197，CRM197-C-Aβ16-23，CRM197-C-Aβ17-24，CRM197-C-Aβ18-25，Aβ16-22-C-CRM197，Aβ17-23-C-CRM197，Aβ1 8-24-C-CRM197，CRM197-C-Aβ16-22，CRM197-C-Aβ17-23和CRM197-C-Aβ18-24。在本发明的另一个方面，结合物选自Aβ1-5-L-C-CRM197，Aβ1-7-L-C-CRM197，Aβ1-9-L-C-CRM197和Aβ1-12-L-C-CRM197。
加帽使用偶联剂的缺点是活性部位如果不被中和就会自由地与任何的不需要的分子体外或体内反应，所述偶联剂向载体和/或半抗原分子上活性氨基酸分子的侧链上引入活性位点。在本发明的方法中，未反应的官能团的加帽伴随有具有侧基活性基团的结合物与灭活/加帽活性基团的试剂的反应。用于本发明结合方法的示例性的失活/加帽试剂包括半胱胺，N-乙酰半胱胺和乙醇胺。或者，加帽通过与氨或碳酸氢铵的反应得以实现，这二者都将卤乙酰基转变位氨基乙酰基。加帽也在碱性pH(9.0-9.8)使用氢氧化钠或碳酸钠完成，其将卤乙酰基转变位羟乙酰基。与和半胱胺衍生物，乙醇胺等的反应相反，将卤乙酰基转变为氨基乙酰基或羟乙酰基的一个潜在优点是通过与氨或氢氧化物/碳酸盐反应引入相对小的化学官能团。所得到的加帽的官能团，例如氨基乙酰基或羟基乙酰基提供了结合物的载体蛋白部分相对较少的干扰。根据需要使用已知的方法纯化加帽的肽免疫原-载体蛋白，比如层析(凝胶过滤，离子交换作用，疏水性相互作用或亲和)，透析，超滤-透滤，使用硫酸铵或醇选择性沉淀等。
免疫原性结合物和组合物加帽的肽免疫原载体蛋白结合物以免疫原性组合物的形式给药到哺乳动物，特别是人用于预防和/或治疗目的。本发明的结合物用来引发和/或增强针对免疫原的免疫应答。例如，CTL-载体结合物用来治疗和/或预防病毒感染，淀粉样蛋白引起的疾病，癌症等。或者，也使用诱导抗体应答的多肽免疫原-载体结合物。可以使用本发明结合物治疗的疾病的例子包括各种细菌感染，病毒感染，真菌感染，寄生虫感染和癌症。
在治疗应用中，本发明的结合物被给药到已经患有淀粉样蛋白引起的疾病比如阿尔茨海默病、癌症，或感染上病原微生物的患者个体。那些处于疾病的潜伏期或急性期的患者可以用本发明的结合物单独治疗或连同其它合适的治疗一起进行治疗。
在治疗应用中，本发明的免疫原性组合物以足以引发针对微生物、淀粉样蛋白斑或表达在癌细胞上的肿瘤抗原的有效CTL应答或体液应答，以及治愈或至少部分制止疾病的发展、症状和/或并发症的量被给药到患者。足以实现这种效果的量被定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有效量将部分依赖于肽免疫原性组合物，给药的方式，被治疗的疾病的阶段和严重程度，患者的体重和一般健康状态，以及处方医生的判断。
本发明的免疫原性组合物用于治疗或预防给药的首次免疫的治疗有效量对于70kg的患者而言通常范围为从大约0.1μg到大约10,000μg的肽，通常从大约0.1μg到大约8000μg，优选从大约0.1μg到大约5000μg，最优选从大约0.1μg到大约1000μg。这些剂量之后，是依据加强免疫方案根据患者的应答和通过测量特异性免疫应答获得的条件在数周至数月后进行的从大约0.1μg到大约1000μg肽的加强剂量。
另外，预防性使用本发明以预防和/或改善细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、淀粉样蛋白引起的疾病或癌症。有效量如上所述。另外，本领域技术人员也将知道如何根据需要调整或修改预防性治疗，例如通过加强免疫和调整剂量以及剂量给药方案。
治疗性给药可以从疾病的第一病征或检测或外科摘除肿瘤或就急性感染而言诊断后不久开始。这随后是通过加强剂量，直到疾病发展被中止或逆转或症状被基本上缓解并持续此后的一段时期。在慢性感染中，可能需要初始的高剂量继之以加强剂量。
用本发明的组合物治疗感染的个体可以促进急性感染的个体感染的消散。对于那些容易(或倾向于)发展慢性感染的个体而言，所述组合物可尤其用于阻止从急性发展成慢性感染的方法。例如在此描述的，在感染前或感染期间鉴定易感的个体时，所述组合物可以靶向到他们，对较大群体给药的需求最小化。
本发明的结合物还被用来治疗慢性感染和刺激免疫系统以消除潜伏性感染个体中病毒感染的细胞。重要的是以足够有效引发和/或增强免疫应答的制剂和给药方式提供适量的本发明的免疫原性组合物。因此，对于慢性感染的治疗，对于70kg的患者每剂量的代表性剂量范围从大约0.1μg到大约10,000μg肽，通常从大约0.1μg到大约8000μg，优选大约0.1μg到大约5,000μg，最优选大约0.1μg到大约1,000μg。免疫剂量，继之以在给定间隔时间的加强剂量，例如从一到四周，可能是需要的，可能需要持续一段时间以有效免疫个体。就慢性感染而论，给药应该持续到至少临床症状或实验室检验显示病毒感染已经被消除或基本上缓解并持续此后的一段时期。
本发明的用于治疗或预防治疗的免疫原性组合物可以通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻或肌内的方法给药用于预防性和/或治疗性治疗。免疫原性试剂的一种典型给药途径是皮下给药，尽管其它的途径可以同样地有效。另外常见的途径是肌内注射。这种注射最通常在手臂或腿肌肉上进行。在一些方法中，试剂被直接注射到沉积物聚集的特定组织中，例如颅内注射。肌内注射或静脉内输液可优选用于抗体给药。在一些方法中，将具体的治疗抗体直接注射进入颅内。由于给药方便，本发明的免疫原性组合物特别适于口服。本发明另外提供了用于肠胃外投药的免疫原性组合物，其包含溶解或悬浮在可接受的载体，优选含水载体中的肽或结合物的溶液。
可以使用多种稀释剂、赋形剂和缓冲液，例如水，缓冲水，磷酸盐缓冲盐水，0.3％甘氨酸，透明质酸等。这些免疫原性组合物可以通过常规、公知的灭菌技术灭菌，或可以无菌过滤。所得到的水溶液可以如其包装形式使用，或冻干，冻干的制剂在给药前与无菌溶液组合。所述免疫原性组合物可以根据需要包含药物可接受的助剂以接近生理条件，比如缓冲剂，浸透压调节剂，润湿剂等，例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，单月桂酸山梨糖醇酯20，油酸三乙醇胺等等。
对于固体组合物，可以使用常规无毒的固体载体。这些可以包括，例如，药品级的甘露糖醇，乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖，碳酸镁等。对于口服给药，通过掺入任何通常采用的赋形剂，比如那些前面所列举的载体，和通常10-95％的活性成分，即本发明的一种或者多种结合物，更优选浓度为25-75％而形成药物可接受的无毒组合物。
药物制剂中本发明免疫原性组合物的浓度可以广泛地变化，即，从按重量计小于大约0.1％，通常处于或小于大约2％到直至20％到50％或更多，并通常可以主要根据流体体积、粘性等，根据所选择的具体给药模式而进行选择。
本发明的结合物还可以通过脂质体给药，其用来将结合物靶向到特定组织，比如淋巴组织，或选择性靶向到受感染细胞，以及增加肽组合物的半寿期。脂质体包括乳剂，泡沫，胶束，不溶性单层，液晶，磷脂分散系，片状层等等。在这些制剂中，待递送的免疫原性组合物单独或连同结合到例如淋巴样细胞常见的受体的分子一起被引入作为脂质体的一部分。这些分子将包括其结合到CD45抗原的单克隆抗体，或其它的治疗性或免疫原性的免疫原性组合物。因此，填充有所需的本发明的组合物的脂质体可以被定向到淋巴样细胞的位点，然后脂质体递送所选定的治疗性/免疫原性肽组合物。用于本发明的脂质体由标准的形成泡囊的脂质形成，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，比如胆固醇。脂质的选择通常考虑脂质体的大小，血流中脂质体对酸的敏感性和稳定性。多种方法可有效用于制备脂质体，描述于，例如，Szoka，等，Ann.Rev.Biophys.Bioelig.9467(1980)，美国专利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369，在此处引入作为参考。
为靶向到免疫细胞，待引入脂质体中的配体可以包括对于所需的免疫系统细胞的细胞表面决定簇具有特异性的抗体或其片段。含有本发明组合物的脂质体悬液可以静脉内、局部、体表等等方式给药。剂量根据给药方式，递送的组合物和治疗的疾病的阶段的变化而变化。
对于气溶胶给药，本发明的组合物优选以精细粉碎的形式与表怖活性剂和挥发剂一起提供。通常的组合物的百分比为按重量计0.01-20％，优选1-10％。当然表面活性剂是无毒的，优选可溶于挥发剂。这种试剂的代表是含有从6到22个碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，比如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与脂肪族多元醇或其环酸酐的酯。可以采用混合酯，比如混合或天然的甘油酯。表面活性剂可以占按重量组合物的0.1-20％，优选0.25-5％。组合物的余量通常是挥发剂。如果需要还可以包括载体，如对于鼻内递送的卵磷脂。
本发明的免疫原性组合物还可以用于制备单克隆抗体。这种抗体可以有效用作潜在的诊断或治疗剂。
本发明的免疫原性组合物还可以用作诊断剂。例如，本发明的组合物可用于测定特定个体对治疗方案的敏感度，所述方案使用多肽免疫原，并因此可能有助修饰现有的治疗方案或测定受感染个体的预后。此外，本发明的组合物还可以用于预测基本上处于发展慢性感染的危险的个体。
本发明的结合物可以任选的连同其它的试剂一起给药，所述试剂可至少部分有效治疗和/或改善疾病和/或其症状。就阿尔茨海默和唐氏综合症而论，其中淀粉样沉积发生在脑中，本发明的结合物可以连同其它加强本发明的药剂通过血脑屏障的试剂一起给药。
所述免疫原性组合物通常包含佐剂。佐剂是当连同免疫原或抗原一起给药时加强免疫应答的物质。许多细胞因子或淋巴因子已经显示具有免疫调节活性，因此可以用作佐剂，上述因子包括然而并非限于白介素1-α，1-β，2，4，5，6，7，8，10，12(参见，例如美国专利5,723,127)，13，14，15，16，17和18(及其突变形式)，干扰素-α，β和γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(参见，例如，美国专利5,078,996)，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，GSF和肿瘤坏死因子α和β。用于本发明其它的佐剂包括趋化因子，包括而不限于MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。粘附分子，比如选择蛋白，例如，L-选择蛋白，P-选择蛋白和E-选择蛋白也可以用作佐剂。另外有用的佐剂包括而不限于粘蛋白样分子，例如CD34，GlyCAM-1和MadCAM-1，整合蛋白家族的成员例如LFA-1，VLA-1，Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族的成员例如PECAM，ICAMs，例如，ICAM-1，ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3，共刺激分子例如CD40和CD40L，生长因子包括血管生长因子，神经生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，B7.2，PDGF，BL-1和血管内皮生长因子，受体分子包括Fas，TNF受体，Flt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2和DR6。另外的佐剂分子包括Caspase(ICE)。还参见国际专利公开W098/17799和W099/43839，其在此以全文引作所有目的的参考。
用于增强免疫应答的合适的佐剂包括而不限于MPLTM(3-O-脱酰基单磷酯酰脂A；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美国专利4,912,094中，其在此以全文引作用于所有目的的参考。其他适合用作佐剂的是合成的脂A类似物和氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，可以从Corixa(Hamilton，MT)购得，并描述于美国专利6,113,918，其在此引作参考。这种AGP之一是2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(S)-3-四癸酰氧基四癸酰]-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其名称为529(也称作RC529；Corixa)。该529佐剂被配制成水性形式(529 AF)或稳定的乳剂形式(529SE)。
其它的佐剂包括矿物油和水乳剂，钙盐比如磷酸钙，铝盐(明矾)，比如氢氧化铝，磷酸铝等，Amphigen，Avridine，L121/角鲨浠，D-丙交脂-聚丙交酯/葡萄糖苷，pluronic酸，多元醇，胞壁酰二肽，杀死的Bordetella，皂甙，例如StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)，描述于美国专利5,057,540中，其在此引作参考，以及从其产生的颗粒例如ISCOMS(免疫刺激复合物)，结核分支杆菌，细菌脂多糖，合成多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利6,207,646，其在此引作参考)，百日咳毒素(PT)，或大肠杆菌热敏感毒素(LT)，具体是LT-K63，LT-R72，PT-K9/G129；例如，参见国际专利公开WO93/13302和WO 92/19265，其在此引作多功能的参考。
还可以用作佐剂的是霍乱毒素和其突变体，包括描述于国际专利公开号WO 00/18434(其中第29位的氨基酸谷氨酸被另外的氨基酸取代(非谷氨酸，优选组氨酸)。类似的CT毒素或其突变体描述于国际专利公开WO 02/098368(其中第16位的氨基酸异亮氨酸被另外的氨基酸取代，单独地或者与第68位的氨基酸丝氨酸被另一氨基酸取代一起发生；和/或其中第72位的氨基酸缬氨酸被另一氨基酸取代)。其他的CT毒素描述于国际专利公开WO 02/098369(其中第25位的氨基酸置精氨酸被另一氨基酸取代；和/或在第49位的氨基酸插入氨基酸；和/或在第35和36位氨基酸插入两个氨基酸)。
应当理解整个说明书中参考任何理论解释所描述的结果并非限制本发明的范围。不依赖于在本发明中起作用的方法，此处描述的结果和优点可以通过参考以下本发明的实施例而完成。
本领域技术人员将可以清楚地了解可以进行许多改变和修饰只要不偏离权利要求的精神和范围。本说明书提到的所有公开物，专利和专利申请均整体引作多功能的参考，正如每个单独的公开物，专利或专利申请被具体和单独地指明引入参考一样。
实施例1CRM197与Aβ肽的结合通过将具有39个赖氨酸残基的活化载体CRM197与具有侧基巯基的半抗原/抗原性肽使用如下所述的方法(图1)反应进行半抗原/抗原性肽的结合作用。所有Aβ肽在羧基末端包含半胱氨酸残基以促进这些肽通过半胱氨酰基巯基与载体蛋白结合。这些肽通过固相合成产生。
I.活化CRM197的自由氨基通过与过量溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应而被溴乙酰化(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(Bernatowicz和Matsueda，1986)。向冰冷的CRM197(约15mg)溶液中，添加10％(v/v)的1.0M NaHCO3(pH8.4)。将与使用的CRM197等重量的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在200μL的二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢添加到CRM197中，并在室温下暗处温和搅拌1小时。将得到的溴乙酰化(活化)的蛋白通过经过脱盐(P6-DG)柱使用PBS/1mM EDTA(pH7.0)作为洗脱剂而进行纯化。纯化后，收集对应于活化的CRM197的级分，并通过BCA蛋白分析估计蛋白浓度。蛋白质的氨基，在用溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯处理前后都与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSA)反应，其用作溴乙酰化的指示(Means等，1972)。
II.结合在结合前，肽与5，5′-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)[Ellman试剂]反应以验证自由-SH基的含量(62-88％被还原)。对于最先的四种Aβ肽(不具有接头的氨基酸1-7，具有GAGAC接头的氨基酸1-12，具有GAGAC接头的氨基酸1-9，和具有GAGAC接头的氨基酸1-7)，大约8.0-10.0mg的肽溶解在无菌蒸馏水中至浓度为大约20mg/ml。将肽以1∶1(w/w)比例缓慢添加到冷活化的CRM197中，通过添加20-36μL的1N NaOH将pH调整到大约7.0-7.2。将得到的材料在4℃暗处温和搅拌过夜，随后在暗处对两次更换1L，pH7.2的PBS，进行透析。对于随后的四种肽(没有接头的氨基酸1-5，没有接头的氨基酸1-9，没有接头的1-12，和没有接头的氨基酸1-5)与Ellman试剂反应用来验证自由-SH基。CRM197被如前所述溴乙酰化，纯化并与TNBSA反应。将各肽的pH通过添加2.2倍各溶解肽体积的0.1M NaPO4(pH8.5)而调整到7.0。肽以比例1∶1(w/w)被缓慢添加到冷活化的CRM197中，在4℃暗处反应过夜。透析得到的材料。将最终的对照肽(1-12mer反向)使用除了如下改进的如前所述的方法与CRM197结合。并非将肽的pH调整到7.0，而是通过添加20％(v/v)的0.5M NaPO4(pH 8.0)将活化的CRM197的pH调整到大约7.5。将透析后的各结合物转移到无菌的15mL聚丙烯管中，用铝箔包裹储存在4℃。然后使用质谱验证载体上活性氨基残基的活化。
结合物 免疫原性肽Aβ1-5-C-CRM197DAEFR-C(SEQ.ID.NO.1)Aβ1-7-C-CRM197DAEFRHD-C(SEQ.ID NO.2)Aβ1-9-C-CRM197DAEFRHDSG-C(SEQ ID NO3)Aβ1-12-C-CRM197DAEFRHDSGYEV-C(SEQ ID NO4)Aβ1-5-L-C-CRM197DAEFR-GAGA-C(SEQ ID NO.5)Aβ1-7-L-C-CRM197DAEFRHD-GAGA-C(SEQ ID NO.6)Aβ1-9-L-C-CRM197DAEFRHDSG-GAGA-C(SEQ ID NO.7)Aβ1-12-L-C-CRM197DAEFRHDSGYEV-GAGA-C(SEQ ID NO.8)
Aβ12-1-C-CRMI97(-VE对照) VEYGSDHRFEAD-C(SEQ ID NO.9)L＝接头(GAGA)(SEQ ID NO.10)实施例2Aβ肽-CRM197结合物的制备和通过超滤纯化CRM197的溴乙酰化CRM197(100mg)的0.01M磷酸钠缓冲液，0.9％NaCl，pH7.0溶液与溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(在DMSO中溶解至20mg/mL)以重量比1∶1在氩气氛围下反应。按需要滴定反应以维持pH在7.0。混合物在暗处室温下搅拌1.5小时。反应混合物经1.2μm过滤器过滤到UF/DF系统(Millipore Labscale TFF，Billerica，MA)的保留物贮存器中。使用10K或30K UF膜通过0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH7.0中透滤(30-倍)完成纯化。溴乙酰化的CRM197通过经过0.2μm滤膜而进行过滤。溴乙酰化的程度通过将活化的CRM197与半胱氨酸反应，随后通过氨基酸分析和对得到的羧甲基半胱氨酸(CMC)进行定量而进行测定。
Aβ肽和溴乙酰化CRM197的结合和用N-乙酰半胱胺进行加帽将溴乙酰化CRM197(50mg)转移到反应容器中。向所述保持在2-8℃的搅拌溶液，添加1M的碳酸钠/碳酸氢盐。在氩气氛下进行滴定以获得目标pH9.0。分别称出50mg的Aβ肽并溶解在注射用水(WFI)中至20mg/mL。向这种溶液添加1M的碳酸钠/碳酸氢钠直到达到pH9.0。将肽溶液加到溴乙酰化的CRM197溶液中，混合物在2-8℃搅拌14-18小时。对剩余的溴乙酰基用过量20倍摩尔数的N-乙酰半胱胺在2-8℃加帽3-6小时。
反应混合物通过1.2μm滤器而过滤进入UF/DF系统(MilliporeXL)的保留物贮存器，将所述结合物在室温下10K或30K MWCO膜(Millipore)上通过经0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH 7.0进行30倍透滤而进行纯化。收集保留物，进行0.2μm过滤，分析蛋白质含量(Lowry或微量BCA比色分析)，经SDS-PAGE，经氨基酸分析，并分析在小鼠中的免疫原性。
实施例3通过对未反应的溴乙酰基团加帽而转化为氨基乙酰基将按实施例2的描述制备的溴乙酰化CRM197(50mg)转移到反应容器中。向维持在2-8℃的搅拌溶液加入1M的碳酸钠/碳酸氢钠。在氩气氛下进行滴定以获得目标pH9.0。分别称重50mg Aβ肽，并溶解在WFI中至20mg/mL。向该溶液中添加1 M碳酸钠/碳酸氢钠直至获得pH9.0。向溴乙酰化的CRM197溶液中添加肽溶液，混合物在2-8℃搅拌14-18小时。使用8％碳酸氢铵溶液在2-8℃对剩余的溴乙酰基加帽4个小时。
反应混合物通过1.2μm滤器过滤进入UF/DF系统(Millipore XL)的保留物贮存器，在室温下在10K或30K MWCO膜(Millipore)上通过经0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH7.0进行30倍的透滤而纯化所述结合物。收集保留物，进行0.2μm过滤，分析蛋白质含量(Lowry或微量BCA比色分析)，通过SDS-PAGE，通过氨基酸分析，并分析在小鼠中的免疫原性。
实施例4定量测定S-羧甲基半胱氨酸和S-羧甲基半胱胺进行结合以及肽免疫原-蛋白/多肽结合物的加帽程度的评估使用溴乙酰活化化学性质产生的蛋白质-肽结合物的酸水解导致在结合物位点从半胱氨酸形成酸稳定的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)以及在加帽位点从半胱胺形成酸稳定的S-羧甲基半胱胺(CMCA)(图2)。所有结合的和加帽的赖氨酸被转变回赖氨酸并照此检测。所有其它的氨基酸被水解回到游离氨基酸，除被水解条件破坏的色氨酸和半胱氨酸之外。天冬酰胺和谷氨酰胺被分别地变为天冬氨酸和谷氨酸。
用去离子水稀释结合物样品到总数蛋白质浓度小于1mg/mL。干燥每种结合物的两个10微克等份并重悬浮在100μL的6N HCl[Pierce]，5μL熔化的酚[Sigma-Aldrich]，和1μL的2-巯基乙醇[Sigma-Aldrich]中。在真空(100mT)下在110℃温育然后样品22小时。所得到的水解产物被干燥，重悬浮在250μL Beckman Na-S柠檬酸钠样品稀释缓冲液(pH2.2)中[Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA]，并使用Whatman 0.2μm尼龙注射器头过滤器和1mL注射器进行过滤。
然后将每种样品上样到Beckman 6300氨基酸分析仪样品环管并放入到分析仪中。使用离子交换层析分析分离各水解的样品和对照组的氨基酸，随后与Beckman茚三酮NinRX溶液在135℃反应。然后在570nm和440nm可见光范围内检测衍生的氨基酸(参见表1)。对各组分析而言，含有500皮摩尔的每种氨基酸的一组标准氨基酸[Pierce氨基酸标准H]与样品和对照组一起进行运行。S-羧甲基半胱氨酸[Sigma-Aldrich]被加到所述标准品中。
表1在Beckman 6300氨基酸分析仪上使用梯度程序1的氨基酸保留时间

各标准峰面积用作成比例评估各样品的定量等价物。从440nm测定脯氨酸，并使用谷氨酸，最接近的氨基酸转变为在570nm的等价物。
使用皮摩尔赖氨酸与存在于蛋白质中的理论赖氨酸值的比较，将这些皮摩尔值的每一个转化为氨基酸残基的摩尔比率。基于赖氨酸共价连接到半胱氨酸和半胱胺，以及预期相似的水解，挑选赖氨酸用于这种评估。然后将所得到的氨基酸摩尔数与蛋白质氨基酸组成相比较，与CMC和CMCA的值一起报道。CMC值被直接用于评估结合程度，CMCA值被直接用于评估加帽的程度。
实施例5Aβ-CRM197肽结合物的表征和优化为了验证结合作用，通过氨基酸分析和基质辅助的激光解吸电离-飞行时间(MALDI TOF)质谱对所有的肽-CRM197结合物进行分析。对于各结合物，对每摩尔CRM197的肽结合物的摩尔数通过氨基酸分析(S-羧甲基半胱氨酸残基的数量)和MALDI-TOF质谱测定。各种方法测定的值通常是一致的。
I.大小排阻层析从储料取出一批浓缩的样品并温热到室温。温和地混合Aβ肽结合物样品以保证得到均匀的制剂。在Eppendorf微量离心机中离心Aβ肽结合物样品以除去所有颗粒。回收上清用于TosoHaas TSK-GelG3000SW层析(TosoHaas，Stuttgart，Germany)。TosoHaasTSK-GelG3000SW柱连接到HPLC系统，压力上限设定为1.4Mpa。用至少30mL PBS(10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.2±0.1)以流速0.75mL/min对柱进行平衡。使用下列参数将Aβ肽结合物上样到TosoHaasTSK-Gel G3000SW柱Aβ肽结合物样品的浓度1.5±1.0mg/mL流速0.75mL/min样品体积0.1mL运行时间30分钟在280nm和210nm监测吸收值。对长时间储存而言，用至少50mL20％乙醇以流速0.5-1.0mL/分钟对TosoHaas TSK-Gel G3000SW柱进行平衡。
II.PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
将活化的(溴乙酰化的)CRM197和Aβ肽-CRM197结合物通过SDS-凝胶使用NuPAGE Bis-Tris电泳(Novex，Frankfurt，Germany)以中性pH，预制聚丙烯酰胺微型凝胶系统和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液进行检测。将8μg等分的各活化CRM或结合物与还原性样品缓冲液混合并在100℃加热5分钟。将结合物和分子量(MW)标准品(Invitrogen，Carlsbad，CA)上样到基于Bis-Tris-HCl缓冲系统的10％(w/v，丙烯酰胺)NuPage凝胶(Novex)上并在MES SDS电泳缓冲液-PAGE(Laemmli)中进行电泳。在SDS-PAGE之后，用Pierce Gel CodeBlue(Pierce，Roclcford，IL)对凝胶染色。Aβ肽-CRM197结合物由天然CRM条带之上的66kDa左右的主带以及大约120kDa的二聚体条带所代表，伴随一些次要的多聚体条带(数据未显示)。
III.肽-CRM197结合物的MALDI-TOF质谱分析质谱被用于比较精确地(immediate)估计结合的程度。使用3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸(芥子酸)作为基质通过MALDI-TOF质谱分析合适的等分的活化的CRM197和结合物样品。通过MALDI-TOF质谱测定(Finnigan MAT Lasermat 2000质谱仪，Ringoes，NY)活化的CRM197的分子量被发现位于60.5kDa左右，而且根据结合程度(数据未显示)对不同的结合物分子量从65kDa到74kDa变化。CRM197中多至22个赖氨酸(约50％)被发现以1∶1的比率被修饰。
IV.优化实验活化和结合的程度是试剂蛋白质比例，反应温度和反应缓冲液pH的函数。下面给出一些例子来示例用于鉴定最适pH条件以具有对于结合反应而言可重复的过程控制参数所进行的最佳结合条件。结果(图3)显示对Aβ5mer(DAEFRC)(SEQ ID NO1)以及Aβ7mer(DAEFRHDC)(SEQ ID NO2)的结合反应是pH依赖性的，并当反应条件的pH提高时产生更高程度的修饰/结合。使用5mer和7mer肽的TFA盐，以不同的肽上样量在pH9.0评估结合的程度(图4)。从这些结果可以显见每个CRM分子具有限定数目的肽拷贝的肽结合物可以通过改变结合过程中肽/活化的CRM的比例而产生。使用Aβ7mer肽的乙酸盐完成相似的实验。
对于Aβ1-7/CRM结合而言，通过每CRM的CMCA摩尔数与每CRM的CMC摩尔数的比较而评估加帽过程。由于对检测的各肽CRM比率而言总CMC和CMCA是恒定的，假定加帽过程是完整的(图5)。结合物的总修饰保持在19到21之间，可以与溴乙酰化的赖氨酸的数目相比较(图5)。这些实验通过以TFA作为肽的反离子进行。使用肽的乙酸盐而非TFA盐重复Aβ1-7/CRM的结合，这些数据显示在图5和6中。随着各点的总CMC和CMCA保持在20和22之间，加帽过程看起来将完成。Aβ-CRM结合反应的条件被优化为在pH9.0，结合程度通过反应中肽与CRM的比率来进行控制。通过将比率从0.1变为1.5，可以改变结合程度(图6)。
活化和结合的程度是试剂蛋白质比率，反应温度和反应缓冲液pH的函数。各结合物修饰(结合作用)的程度通过从各结合物的质量值减去活化的CRM197的质量值并除以用于制备结合物的肽的质量值而进行计算。所有结合物的修饰(结合作用)程度描述在表2中。
结合的程度还与通过由每摩尔CRM197形成的S-羧甲基半胱氨酸残基的估计量测定的值相比较(也显示在表2中)。
表2修饰程度MALDI-TOF和AAA数据的比较

实施例6Aβ肽结合物的免疫原性研究各自结合到CRM197的跨越Aβ的N-末端残基1-5，1-7，1-9和1-12的肽(有和没有接头序列GAGAC)和对应于从氨基酸12到氨基酸1的反向序列的Aβ的N-末端(1-12mer反向序列)的肽被用于与STIMULONTMQS-21制剂中未结合的Aβ1-12mer肽一起免疫小鼠。各组小鼠在实验一开始(第0周)和随后在第3和6周皮下免疫与20μg佐剂STIMULONTMQS-21一起配制的30μg或5μg剂量的免疫样品之一。该研究方案示例在表3中。
如表3所示，结合到CRM197的跨越Aβ的N-末端残基1-5，1-7，1-9和1-12的肽(有和没有接头序列GAGAC)和对应于从氨基酸12到氨基酸1的反向序列的Aβ的N-末端(1-12mer反向序列)的的肽，被用于与QS-21一起配制的制剂中未结合的Aβ1-12mer肽一起免疫小鼠。各组小鼠在实验一开始(第0周)和随后在第3和6周皮下免疫与20μg的佐剂QS-21配制在一起的30μg或5μg剂量的免疫样品之一。整个实验中使用Swiss Webster小鼠，每组5只小鼠。
注射体积＝100μl；B＝放血；V＝免疫；E＝取血。
通过下面描述的针对Aβ和CRM197的ELISA测定抗-Aβ的效价。简单地说，Costar 96孔板(#3591)在室温下用2μg/mL Aβ1-42的无菌碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6包被过夜。倾空板并在室温用200μl/孔的0.05％BSA的1X PBS/0.05％Tween 20溶液封闭2个小时。倾空封闭的板并用含有TBS，0.1％Brij-35(没有叠氮化物)的洗涤缓冲液的洗板机洗涤。所有的原始抗血清用0.05％BSA的含0.05％Tween20/0.02％叠氮化物的1X PBS溶液梯度稀释，并将100μL各稀释物转移到合适的板孔中，并在室温孵育2小时。然后如上所述倾空/洗涤板。用0.05％BSA的含0.05％Tween 20/0.02％叠氮化物的PBS溶液1∶1000稀释来自Southern Biotech(city，state)的碱性磷酸酶结合的山羊抗小鼠二级抗体，并向每孔加入100μL并在室温下孵育1小时。然后如上所述倾空/洗涤板，最后以100μL/孔的在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制备的1mg/mL的p-硝基苯基磷酸盐底物的溶液在室温下孵育1小时。通过添加50μL/孔3N NaOH而终止颜色反应。在405nM读取板并以690nM作为参考。在O.D.0.1 AU计算终点效价。
表3小鼠免疫研究方案


CRM197ELISAGreiner96孔板(#650011)用5.0μg/mL(100μ1/孔)的CRM197的无菌碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6在37℃包被90分钟。倾空板并用含有1×TBS，0.1％Brij-35洗涤缓冲液的洗板机洗涤板。所有的初级抗血清用含有0.3％Tween20/EDTA的1XPBS梯度稀释，各稀释度的100μL溶液被转移到合适的板孔内，并在37℃孵育1小时。然后如上所述倾空/洗涤板。用含0.05％Tween 20/0.02％叠氮化物的1×PBS以1∶1000稀释来自Southern Biotech的碱性磷酸酶结合的山羊抗小鼠IgG二级抗体，向每孔加入100μL并在室温下孵育1小时。然后如上所述倾空/洗涤板，最后以100μL/孔的在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制备的1mg/mL p-硝基苯基磷酸盐底物的溶液在室温下孵育1小时。通过添加50μL/孔的3N NaOH而终止显色。在405nM读取板并以690nM作为参考。在O.D为0.1AU计算终点效价。
表4-6示例了针对Aβ的终点ELISA效价。在初次免疫之后，全部8种结合物(排除阴性对照)诱导可测量的抗AβIgG免疫应答。然而，30μg剂量，而非5μg剂量的Aβ在初次免疫后第3周产生阳性应答。在所有结合物中，看起来有没有接头的Aβ1-7肽引发了与研究中的其他结合物一样好或更好的应答。在5μg剂量，Aβ1-5C在第8-16周有较好的应答。Aβ1-7C在30μg剂量达到最佳。以5μg剂量或30μg剂量进行的第二和第三次免疫后的抗体效价分析显示对大多数结合物而言，在第二次免疫后看到针对Aβ的最大免疫应答。至少在小鼠中，第三次免疫不显示增强所述免疫应答。然而Aβ肽需要以30μg剂量免疫三次以达到针对该肽的最大免疫应答(表5)。就抗体随时间延长而退化而言，用结合物免疫组的抗体水平与该组内最高水平相比降低2到3倍。对各组而言分析第6周和第8周的单个样品以计算针对Aβ的GMTs(表6)以观察是否任一的结合物组都基本上由于其它组。来自第6周Aβ1-5C，Aβ1-7C和Aβ1-9C结合物的统计分析表明Aβ1-7结合物诱导显著更高的效价。从这个实验还明显看出接头序列GAGAC对于增强针对肽的免疫应答没有贡献。
表4.

表4.使用来自5μg剂量的跨越淀粉样Aβ肽N-未端不同长度的肽结合物的抗血清针对Aβ在第0，3，6，8，13和16周的ELISA终点效价，参考Elan超免疫多克隆抗体#592＝3,073,307。
终点在O.D.0.1AU。
用与20μgSTIMULONTMQS-21配制的5μg上述抗原在第0，3，和6周SC-N免疫SwissWebster小鼠。
表5.

表5.使用来自30μg剂量的跨越淀粉样Aβ肽N-未端不同长度的肽结合物的抗血清针对Aβ在第0，3，6，8，13和16周的ELISA终点效价，参考Elan超免疫多克隆抗体#592＝3,073,307。
终点在O.D.0.1AU。
用与20μgSTIMULONTMQS-21配制的30μg上述抗原在第0，3和6周SC-N免疫Swiss Webster小鼠。
表6.

表6.使用来自30μg剂量的跨越淀粉样Aβ肽N-末端不同长度的肽结合物的抗血清针对Aβ在第6和8周的ELISA终点GMTs。
参考Elan超免疫多克隆抗体#592＝3,073,307。
终点在O.D.0.1 AU。
用与20μg STIMULONTMQS-21配制的30μg上述抗原在第0，3和6周SC-N免疫Swiss Webster小鼠。
a.使用Tukey-Kramer对来自1-5C，1-7C和1-9C的第6周效价的统计分析显示只在1-5C和1-7C之间存在统计差异，而使用Student′sT-检验的分析显示在1-5C和1-7C以及1-5C和1-9C之间存在统计差异。
b.对来自1-5C，1-7C和1-9C的第8周效价的统计分析未显示在这三个组之间存在统计差异。然而，显示在1-5C和1-7C之间有存在差异的趋势。
PDABP小鼠脑组织染色PDABP脑组织染色分析提供了Aβ肽结合物和/或Aβ1-42抗血清功能的指示。来自单独的小鼠组的血清样品被单独分析它们识别含有淀粉样肽的PDABP小鼠脑组织斑的能力。结果显示在表7A和7B中。除Aβ5mer结合物抗血清之外，在识别斑时具有剂量相关的应答。与接头无关，30μg结合物诱导的抗血清具有与5μg结合物抗血清比较更好的反应性模式。然而，Aβ5mer结合物抗血清，似乎具有对于5μg组相似的或更好的反应性。比较所有这些结果，可以得出结论由Aβ1-5mer至Aβ1-9mer制备的结合物足够在小鼠中引发识别斑的免疫应答，而接头的存在不是必要的。从这个研究可以得出以下结论(a)所有肽结合物诱导高效价的针对载体蛋白CRM197的抗血清，其水平等于或略超过与未结合的CRM197对照组的水平(未显示)。(b)具有GAGAC接头的结合物与无接头的结合物相比不增强免疫原性或功能。(c)免疫原性数据和PDABP脑组织染色(功能性抗体的初始指示)显示Aβ1-5mer和Aβ1-7mer结合物似乎是对于进一步研究开发的优选免疫原。
表7A.PDABP小鼠脑组织染色

所有的抗血清以1∶1000稀释用于染色过程。
表7B.PDABP小鼠脑组织染色

所有的抗血清以1∶1000稀释用于染色过程。
实施例7猴子中的免疫原性研究在第0，29和58天6只猴的组接受30ug的7mer结合物(总结合物)，佐剂为STIMULONTMQS-21，明矾或RC 529SE制剂。其他组包括以明矾(Al(OH)3)或RC529SE作为佐剂的30ug 5mer结合物，以75和300μgAβ和STIMULONTMQS-21作为阳性对照。每两周免疫阳性对照。在第36和64天测定抗Aβ抗体效价(图7-9)。在第36天，连同STIMULONTMQS-21，明矾和RC 529SE的7mer/CRM结合物分别引发的GMT效价为10110，13330和17090(图7)。比较起来，Aβ1-42加上STIMULONTMQS-21在75和300μg剂量水平分别引发223和1734效价的GMTs。Aβ5mer结合物以明矾作佐剂产生的效价为2134，以RC 529SE为佐剂产生的效价为15980。在第64日，即在3次剂量结合物加上STIMULONTMQS21或RC-529 SE作为佐剂诱导比第二次剂量后显著高的效价(对于7mer/RC-529 SE，GMTs效价为69910；对于Aβ5mer/RC-529 SE为21640和对于Aβ7mer/STIMULONTMQS-21为30310)(图8)。以明矾作为佐剂的结合物在第3次免疫后引发比第2次免疫后降低的效价。看起来Aβ7mer结合物与Aβ5mer结合物相比引发更好的应答。在猴子中，用RC-529 SE或STIMULONTMQS-21作为佐剂使Aβ7mer结合物引发最高水平的应答(图9)。对以明矾为佐剂的Aβ7mer结合物的应答为中等程度，并与以STIMULONTMQS-21为佐剂的300μg Aβ1-42的应答相似。
从这个实施例可以得出数个结论。首先，在灵长类中两种结合物都具有较好的免疫原性。第二，免疫制剂中存在佐剂会显著影响免疫应答。第三，除铝佐剂之外，RC-529SE和STIMULONTMQS-21增强各剂量免疫后的免疫应答至少直至3个剂量(图9)。总体而言，Aβ7mer结合物在529，随后STIMULONTMQS-21存在的情况下诱导更高的抗体应答(参见图9)。
实施例8多重抗原性肽(MAP)结合物的制备及其免疫原性研究多个方法可有效用于产生载体上的多抗原性位点。在前面的实施例中，各抗原性位点通过规定的结合作用和加帽化学反应与载体分别结合。在这个实施例中，多抗原性位点通过固相合成串联Aβ1-7mer重复而构造。或者，这些串联重复可以通过别处描述的赖氨酸核心的连接或者不通过这种连接与T-细胞表位结合。这些多抗原肽以另外的半胱氨酰基残基用于结合到所述载体蛋白而合成。合成在羧基端具有另外的半胱氨酰基残基的含有一个重复单位(1-7)，三个重复单位(1-7)3和五个重复单位(1-7)5的肽。这些肽通过它们的C-末端半胱氨酸残基过夜共价连接到溴乙酰化的CRM。反应在pH9.0-9.2以表8列出的添加的肽CRM比率进行。不与肽反应的溴乙酰基基团用N-乙酰半胱胺加帽。这些批次分别代表含有一个单拷贝，三个串联拷贝和五个串联拷贝的结合到CRM的Aβ1-7肽的结合物。表8简要列出样品的性质。
表8多抗原性肽(MAP)结合物样品

肽上样量(每种载体Aβ1-7肽的平均数)和加帽数(表9)是通过氨基酸分析测定的每种载体的特定氨基酸(CMC或CMCA)的数目。CMC和CMCA值参考赖氨酸。
表9各结合物的结合和加帽程度

Swiss-Webster小鼠(每组10只)被皮下免疫1或0.1μgAβ/CRM结合的肽。半数的小鼠用与100μg佐剂Al(OH)3配制的组合物免疫，另一半不用佐剂而进行免疫。免疫安排在第0周和第3周。安排在第0，3和6周取血。分析血清样品针对Aβ-42mer肽的抗体应答。结果显示在表10中。
表10多抗原性肽(MAP)结合物的抗-Aβ终点效价

所有的结合物在初次免疫后诱导抗-Aβ1-42抗体效价，而在加强剂量后该水平显著提高。在没有铝佐剂的情况下，剂量应答的差异在第3周和第6周取血时都是明显的。剂量越高引发的抗体应答效价越高。在第3周，在两个剂量水平(0.1和1μg)铝佐剂引发与无佐剂组相比显著更高的抗体应答。在第二次免疫后，结合物在1μg剂量引发的抗体水平增加5到10倍。在这个剂量水平，具有3和5个重复的肽结合物诱导比含单个重复的结合物更高水平的抗体应答。还测定了针对CRM载体的效价，这些效价列在表11中。
表11多抗原性肽(MAP)结合物的抗CRM终点效价

在第0和3周免疫动物，在第0，3和6周取血。
佐剂100μg Al(OH)3或没有佐剂。
ND＝未测定。
表11的数据表明无佐剂组在1μg和0.1μg剂量水平即使在两次免疫后也都诱发非常低水平的抗CRM抗体应答。然而，与氢氧化铝佐剂的结合物在1μg剂量水平诱导显著水平的抗CRM抗体应答，而在0.1μg剂量水平诱导低得多的应答。在佐剂存在下，对单重复结合物而言CRM效价最高，对三重复结合物而言为中等，对五重复结合物而言为最低。这与预期是一样的，因为每肽剂量的CRM剂量对于Aβ(1-7)5/CRM而言最低，而对于Aβ(1-7)1/CRM而言最高。对0.1μg剂量而言差别仅在第6周是统计学显著的。
本发明的目的是引发针对抗原性半抗原而不必需针对载体蛋白的高效价的免疫原性应答。在某些情况下，需要的是引发针对半抗原抗原决定簇的最佳免疫应答，而针对载体蛋白的免疫应答最小或不产生。用于这种应用，无佐剂制剂的具有串联重复的多个抗原决定簇的结合物将满足这种需要。
实施例9具有多种载体蛋白的Aβ-肽结合物的制备及其免疫原性本实施例使用六种不同的载体蛋白比较结合物的免疫原性。以1∶1的重量比在pH9将Aβ1-7的乙酸盐添加到溴乙酰化的载体。除了Aβ1-7/rC5Aβ外所有的结合物用N-乙酰半胱胺加帽。所有可替代的载体为重组细菌蛋白，包括CRM(白喉类毒素)，重组C5a肽酶(rC5ap；克隆自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，包括D130A和S512A突变)，ORFs 1224，1664，2452(全部克隆自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes))以及T367，T858(各自克隆自肺炎衣原体(Chlamydiapneumoyaiae))。使用的载体的概述可以在表12中找到。各Aβ1-7结合物与这些载体的结合和加帽程度显示在表13中。
这个研究显示重组C5a肽酶结合物比测试的大多数其他载体诱导针对Aβ更高的效价，所述其他载体包括CRM。这个差异对于接受氢氧化铝的组的第6周效价而言是统计学显著的。此外，在没有佐剂的情况下，Aβ1-7/T858结合物比大多数其他结合物的免疫原性更显著。相对于CRM对照结合物而言效果较差的唯一结合物是Aβ1-7/T367，该结合物也不与Aβ特异性的单克隆抗体通过Western印迹反应。该研究证实了许多其他的载体可以成功用于针对Aβ肽的免疫。
表12载体和结合物性质的列表

表13各结合物的结合和加帽程度

结合结果肽上样量(每个载体Aβ1-7肽的平均数)和加帽数是通过氨基酸分析测定的每个载体的独特氨基酸(CMC或CMCA)的数目。CMC和CMCA值参考赖氨酸。
免疫结果本研究中各组效价的几何平均值列在表14中。在第3周，无论是否存在佐剂，Aβ1-7/rC5Aβ诱导比用化脓链球菌ORFs1224，1664，2452或肺炎衣原体ORFs T367和T858制备的相应的结合物明显更高的抗-Aβ效价。在第3周，缺乏佐剂的情况下，Aβ1-7/rC5ap也比其他的结合物更具免疫原性，除了Aβ1-7/T858。无Al(OH)3的T858结合物诱导比没有佐剂的ORF1224，ORF1664，ORF2452和CRM结合物更高的效价。免疫原性显著低于Aβ1-7/CRM的唯一结合物为Aβ1-7/T367(p＜0.00002)。T367载体在第3和6周有或没有载体的情况下应答都较差。在第6周，连同氢氧化铝的rC5ap结合物比其他结合物更具免疫原性(p＜0.04)，除了Aβ1-7/ORF2452。在没有佐剂的情况下，Aβ1-7/rC5ap和Aβ1-7/T858诱导比ORF1224，ORF1664或T367结合物显著更高的效价。没有氢氧化铝的Aβ1-7/CRM诱导比Aβ1-7/ORF1664或Aβ1-7/T367更高的效价。
表14抗-Aβ1-42终点效价

在第0和3周免疫动物，并在第0，3和6周取血。剂量基于结合物的总量。佐剂100μg Al(OH)3或没有佐剂。
实施例10其他Aβ肽-蛋白质结合物的制备I.活化将冻融的CRM197(8mL，59.84mg，7.48mg/mL)溶解在0.1M硼酸盐缓冲液(pH9，3.968mL)中以使浓度为5mg/mL。在冰浴下将溶液冷却至0-5℃。将溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺(59.9mg)(Aldrich-Sigma)溶解在DMF(100μL)(Aldrich-Sigma)中并逐滴添加到CRM197的溶液中。在添加溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺后，观察到沉淀。检查pH，降低到pH6。反应混合物的pH通过添加更多0.1M的硼酸盐缓冲液而恢复到pH9。然后在4℃搅拌反应混合物1hr，温和震荡。使用YM-10centriprep离心浓缩而纯化和浓缩混合物，并在Sephadex G-25上使用10mM硼酸盐作为洗脱剂而重提纯。集中对Bradford试剂呈阳性的级分，并使用centriprep YM-10浓缩。通过Bradford分析(线性)测定溴乙酰化的程度)。浓度为5.36mg/mL(产量30mg)。然后将终浓度调整为5mg/mL并存储在冰箱中5％蔗糖中直至使用。
II.结合对于各结合作用而言，使用融化的溴乙酰化CRM197。将肽溶解在硼酸盐缓冲液(2.5mg的125ml的0.1M硼酸盐缓冲液)中。观察到Aβ肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)，CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)，CKLVFFAED(SFQ ID NO48)和LVFFAEDC(SEQ ID NO50)的轻微不溶性。用肽溶液/悬浮液处理溴乙酰化的CRM197(5mg/mL)。混合物中肽和蛋白质的比例是1∶2。在具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)，CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)，CKLVFFAED(SEQ ID NO48)和KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)的结合物混合物中观察到混浊。然后检查混合物pH(pH9)并在4℃温育过夜，同时缓慢涡旋。在温育以前混合物的终浓度被调整至3mg/mL。具有肽CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)和LVFFAEDC(SEQ ID NO50)的结合物混合物的混浊在温育后消失。然而，KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)和CKLVFFAED(SEQ ID NO48)仍然是微混浊的。还以与半胱胺比例为1∶1(w/w)制备了可溶性模拟蛋白质结合物。从BIOSOURCE获得纯度大约95％的合成肽。
八聚体
LVFFAEDVC(SEQ ID NO44)KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)VFFAEDVGC(SEQ ID NO43)CLVFFAEDV(SEQ ID NO47)CKLVFFAED(SEQ ID NO48)CVFFAEDVG(SEQ ID NO46)七聚体VFFAEDVC(SEQ ID NO49)LVFFAEDC(SEQ ID NO50)III.蛋白质上未反应的赖氨酸基团的加帽未反应的赖氨酸用N-乙酰半胱胺(CMCA；Aldrich-Sigma)以比例1/1(w/w)在4℃保持在暗处涡旋加帽4hr。通过使用Slide-A-Lyzer盒(Mw截留范围10,000)(Pierce)对PBS缓冲液(2L)透析过夜(13hr)而从结合物中除去未反应的肽和加帽试剂。进行两次缓冲液更换和透析(2×14hr)。在具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO45)和CKLVFFAED(SEQ ID NO48)的结合物中观察到轻微的不溶性。然后将所有的结合物存储在4℃冰箱内的防腐剂中。
IV.蛋白质载体的表征MALDI-TOF MS被用于测定溴乙酰化的CRM197和模拟的结合物N-乙酰半胱胺-CRM197的质量。
基于CRM197和溴乙酰化的CRM197的质量，修饰了11个赖氨酸残基。
(59941.46-58590.29)/122＝11其中CRM197的Mw为58624.29溴乙酰化的CRM197的Mw为59941.46
溴乙酸酯的Mw为122溴乙酰化程度超过28％。(CRM197中赖氨酸的总数为39)。从这11个修饰的赖氨酸残基中，10个与半胱胺偶联。所述偶联率为90％。
(61143-59941)/119＝10其中溴乙酰化的CRM197的Mw为59941.46模拟结合物的Mw为61143N-乙酰半胱胺的Mw为119(10/11)×100＝90V.通过SDS-PAGE Western印迹表征肽-蛋白质结合物用Tris-Tricine预制凝胶分析通过Western印迹分析所述蛋白质-肽结合物。泳道如下分子量标记(泳道1)；L-28375 24/01(泳道2)；L-28375 24/02(泳道3)；L-28375 24/03(泳道4)；L-28375 24/04(泳道5)；L-28375 24/05(泳道6)；L-28375 24/06(泳道7)L-28375 24/07(泳道8)；L-28375 24/08(泳道9)；L-28375 24/09(模拟物)(泳道10)；和BrAcCRM(泳道11)。来自小鼠的肽特异性单克隆抗体(248-6H9-806Aβ17-28)用作初级抗体(抗血清)(发现1∶3000的稀释度是最好的)。山羊-抗小鼠IgG(H+L)-HPR是第二抗体(1∶1000的稀释度)。观察到初级抗体识别除模拟的结合物和活化的CRM197之外的所有结合物(参见图10)。
蛋白浓度通过Pierce BCA分析测定结合物样品的蛋白质浓度(参见表15)。
氨基酸分析进行氨基酸分析以测定结合程度。基于在结合物中发现的CMCA(羧甲基半胱胺)残基计算出结合的T程度。CMCA被用于在与肽结合后使未反应的活化位点加帽(参见表15)。
表15肽与BrAcCRM197的结合程度

使用微板分光光度计和SOFTmax Pro进行全部的比色分析实施例11Swiss Webster小鼠中Aβ肽结合物的免疫原性研究用各自结合到CRM197的VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQID NO45)，C-VFFAEDVG(SEQID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)或Aβ1-7CRM197免疫杂交的SwissWebster小鼠，全部用佐剂RC 529 SE配制。在研究的开始(第0周)以及随后在第4周用Aβ肽结合物之一皮下免疫每组10只动物的9个组。在免疫的同一天收集血清，但收集时间在免疫之前。
近交的Balb/c小鼠中Aβ肽结合物的免疫原性研究如前段所述免疫近交的Balb/c小鼠，但是还在第12周用结合物和佐剂加强免疫。
结果收集两个研究中的血清用于分析Aβ13-28肽特异性的IgG抗体效价。还收集第12周加强免疫的前一天和此后一周来自Balb/c小鼠的血清用于分析。评价来自实施例11使用的动物的脾细胞对用跨越Aβ1-42，全长Aβ1-42，CRM197的重叠肽库或多克隆活化剂刺激的体外应答的潜力。分析包括对白介素4和5以及干扰素-γ的Elispot读数。在完成后，如上所述和实施例6的描述评价Aβ结合物。
实施例12PSABP小鼠中Aβ肽结合物的免疫原性研究用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQ ID NO45)，C-VFFAEDVG(SFQ ID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)免疫PSABP小鼠。PSABP小鼠，双重转基因小鼠(PSABP)过量表达的突变体ABP和PS1转基因描述于Holcomb等的(1998)Nature Medicine 497-11。
PDAPP小鼠中Aβ肽结合物的免疫原性研究用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO43)，LVFFAEDV-C(SEQ ID NO44)，KLVFFAED-C(SEQ ID NO45)，C-VFFAEDVG(SEQ ID NO46)，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO47)，C-KLVFFAED(SEQ ID NO48)，VFFAEDV-C(SEQ ID NO49)，LVFFAED-C(SEQ ID NO50)免疫PDAPP小鼠。PDAPP小鼠表达人APP(AppV71F)的突变形式并在年轻时发展阿尔兹海默病(Bard，等(2000)Nature Medicine 6916-919；Masliah E，等(1996)J Neurosci.15；16(18)5795-811)。
结果收集来自两个研究的血清用于分析Aβ13-28肽特异性IgG的抗体效价。在完成后，如上所述以及如实施例6和11所述，以及关联恐惧条件反射(contextual fear conditioning)(CFC)分析评价Aβ肽结合物。
关联恐惧条件反射是在大多数动物中，例如哺乳动物非常可靠和快速获得的常见的学习形式。试验动物由于将中性刺激和/或环境与负面的经历相联系从而学会害怕以前的中性刺激和/或环境(参见，例如，Fanselow，Anim.Learn.Behav.18264-270(1990)；Wehner等，NatureGenet.17331-334.(1997)；Caldarone等，Nature Genet.17335-337(1997))。
关联恐惧条件反射可尤其有效用于测定认知的正常功能或例如，作为疾病或紊乱的结果的功能障碍，所述疾病例如神经退行性疾病或紊乱，Aβ-相关疾病或紊乱，淀粉样蛋白引起的疾病或紊乱，存在影响认知功能的不需要的遗传改变(例如，基因突变，基因断裂或非所需的基因型)，和/或试剂的效力，例如Aβ结合剂或认知能力。因此，CFC分析提供了独立地检验和/或确认用于防止或治疗认知疾病或紊乱的试剂的治疗效果的方法，尤其是影响脑的一个或多个区域的疾病或紊乱，例如，海马，脑下脚，具环带的皮质，前额皮质鼻周皮层，感觉皮层和中央颞叶。
通常，使用标准动物腔和采用包含温和刺激的条件训练进行CFC分析(例如，0.35mA足部刺激)，与听觉(例如，一段85db的白噪声)，嗅觉(例如，杏仁或柠檬提取物)，触觉(例如，笼舍底部网纹)和/或视觉线索(闪光)等刺激相结合。根据所选定的试验动物，对负面经历(刺激)的应答通常是突然停止运动(除呼吸之外缺少移动)但是还可以包括眨眼或瞬膜反射的改变。通常分别在训练的第一天表征负面应答以测定本能的恐惧基线，而在随后的试验日测定负面应答结果，例如存在环境和/或线索但是缺少负面经历的情况下的突然停止运动被鉴定作为环境和线索条件恐惧。为提高可信度，试验用动物通常由独立的技术术人员单独试验并随时间的延长而进行评分。在现有技术中存在另外的试验设计，例如，在Crawley JN，What′s Wrong with Wrong with myMouse；Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-Liss，NY(2000)。
显示淀粉样蛋白引起的紊乱例如阿尔兹海默病特征性的明显症状或病理状况的示例试验动物(如，模式动物)包括哺乳动物(如啮齿累累或非人的灵长类)。模式动物可以根据需要通过选择性近交产生或者使用本领域公知的转基因技术遗传工程化改造产生，从而使与痴呆紊乱相关的基因中靶向的遗传变化(如基因突变，基因断裂)导致靶向基因的错误表达或错误地发挥功能。例如，若干转基因小鼠株系可以过量表达APP和发展淀粉状斑病变和/或发展为阿尔茨海默病的特征的认知障碍(参见，例如，Games等，上文，Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941550(1997)；Masliah E和Rockenstein E.(2000)J NeuralTransm Suppl.；59175-83)。
或者，可以通过使用化学化合物(例如神经毒素，麻醉剂)或外科手术(例如立体定位切除，axotomization，横切，吸引术)切除或干扰解剖学上与淀粉样蛋白引起的紊乱的特征性症状或病理状态相关的脑区域(例如，海马，扁桃体，鼻周皮层，中央间隔核，蓝斑，mammalary bodies)或特定神经元(例如，血清素能的，胆碱能或多巴胺能的神经元)的正常功能，产生模式动物。在某些优选实施方案中，动物模型显示出除了与淀粉样蛋白引起的紊乱相关的神经退行性病变之外显著的与学习或者记忆相关的认知障碍。更优选地，所述认知障碍随年龄的增长而进行性恶化，使得模式动物中疾病发展与患淀粉样蛋白引起的紊乱的个体的疾病发展相平行。
检验此处描述的结合物官能性的关联恐惧条件反射和其它体内分析可以使用野生型小鼠或者具有某种导致损害记忆的遗传变化的小鼠或者神经退行性疾病包括阿尔兹海默病的小鼠模型来进行，所述小鼠模型包括在脑脊液(CSF)或血浆中显示高水平可溶性Aβ的小鼠模型。例如阿尔茨海默病的动物模型包括过量表达人淀粉状前体蛋白(hAPPswe；Tg2576)的“Swedish”突变的转基因小鼠，该小鼠显示年龄依赖的记忆障碍和斑(Hsiao等(1996)，Science 27499-102)。此处描述的结合物的体内官能性还可以使用PS-1突变小鼠进行检验，描述在Duff等(1996)Nature 383，710-713中。阿尔茨海默病其它的遗传学改变的转基因模型描述在Masliah E和Rockenstei E.(2000)J NeuralTransm Suppl.59175-83中。
在各个方面，本发明的方法包括给药能够改善受试者认知的Aβ结合物，其中Aβ结合物已经在使用适合预测受试者的免疫原性效力的分析中被鉴定。在示例性的实施方案中，该分析是至少部分基于与合适的对照组相比，在对动物给药试验的免疫试剂后来自关联恐惧条件反射研究测定的比较认知的模式动物分析。CFC分析评价了在用潜在的治疗性化合物处理后动物(通常是小鼠或者大鼠)认知的改变。在某些实施方案中，评价的认知的变化是记忆损害状态的改善或者记忆障碍的恢复。因此，CFC分析提供了用于测定防止或者治疗认知疾病的试剂的治疗效果的直接方法，所述认知疾病尤其是，影响脑的一个或多个区域的疾病或者紊乱， 如海马，脑下脚，具环带的皮质，前额皮质鼻周皮层，感觉皮层和中央颞叶。这种CFC分析在未决的2004年12月15日提交的美国专利申请60/XXX,XXX，标题为“关联恐惧条件反射用于预测免疫治疗效力”(“Contextual Fear Conditioning forPredicting Immunotherapeutic Efficacy”)(专利律师文件号ELN-058-1)以及美国专利申请60/XXX,XXX，标题为“关联恐惧条件反射用于预测免疫治疗效力”(“Contextual Fear Conditioning for PredictingImmunotherapeutic Efficacy”)(专利律师文件号ELN-058-2)中有讨论，在此全文引入作为参考。
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<210>22<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>23<211>28<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp1 5 10 15Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu20 25<210>24<211>43<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu20 25 30Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>25<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>26<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc feature<222>(3)..(3)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>26Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15
Phe Arg His Asp20<210>27<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>27Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala20 25 30Ala Ala<210>28<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>28
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30His Asp<210>29<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>29Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu1 5 10 15Lys Ala Ala ALa20<210>30<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>31<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>32<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>33<211>34<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>33Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30His Asp<210>34<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp20 25<210>35<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15
Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu20 25 30Ala Thr<210>36<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>36Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys1 5 10 15Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr2025<210>37<211>79<212>PRT<213>Homo sapiens<400>37Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser20 25 30Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile35 40 45
Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro50 55 60Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp65 70 75<210>38<211>58<212>PRT<213>Homo sapiens<400>38Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly20 25 30Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg35 40 45Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu50 55<210>39<211>44<212>PRT<213>Homo sapiens<400>39Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp20 25 30Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>40<211>535<212>PRT<213>Homo sapiens<400>40Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn1 5 10 15Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln20 25 30Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp35 40 45Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly50 55 60Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val65 70 75 80Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu100 105 110Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly115 120 125Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser130 135 140Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser145 150 155 160Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp165 170 175Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg180 185 190Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val195 200 205Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly210 215 220Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu225 230 235 240Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val260 265 270Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val275 280 285Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu290 295 300Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala305 310 315 320Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser325 330 335Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp340 345 350Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe355 360 365Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser pro Gly His370 375 380Lys Thr Gln pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr385 390 395 400Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His405 410 415Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr435 440 445His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile450 455460Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly465470 475 480Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser485 490 495Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu500 505 510Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser515 520 525Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser530 535<210>41<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>41Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly1 5 10 15
Arg<210>42<211>42<212>PRT<213>Mus musculus<400>42Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>43<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 18-25+C<400>43Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Cys1 5<210>44<211>9<212>PRT
<213>Artificial<220>
<223>A-beta 17-24+C<400>44Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 16-23+C<400>45Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 18-25+C<400>46Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly1 5<210>47<211>9
<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 18-25<400>47Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val1 5<210>48<211>9<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 16-23<400>48Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp1 5<210>49<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 18-24+C<400>49Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys1 5<210>50
<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 17-23+C<400>50Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys1 5<210>51<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>A-beta 16-22+C<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>CRM 197 added via terminal cysteine<400>51Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Cys1 5<210>52<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 18-24
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine<400>52Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val1 5<210>53<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 17-23<400>53Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp1 5<210>54<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>C+A-beta 16-22+C<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine<400>54
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu1 权利要求
1.一种通过肽免疫原的氨基酸残基的活性基团将肽免疫原与具有一个或多个官能团的蛋白质/多肽载体结合的方法，该方法包括以下步骤(a)衍生蛋白质/多肽载体的一个或多个官能团或任选衍生连接于蛋白质/多肽载体的多肽接头的一个或多个官能团，以产生具有活性位点的衍生的载体；(b)将步骤(a)的衍生的蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸的活性基团在使肽免疫原通过官能团与衍生的蛋白质/多肽载体结合的反应条件下进行反应；和(c)另外将结合物与加帽试剂反应以使衍生的蛋白质/多肽载体上自由活性的未反应的官能团失活，从而保留载体的官能度，以便保持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，这种免疫应答在没有载体时不会发生。
2.权利要求1的方法，其中的载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体(Chlafnydia pneumoniae)ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
3.权利要求1的方法，其中的载体包含T-细胞表位。
4.权利要求1的方法，其中的载体是细菌类毒素。
5.权利要求3的方法，其中的载体是流感血凝素。
6.权利要求3的方法，其中的载体是PADRE多肽。
7.权利要求3的方法，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
8.权利要求3的方法，其中的载体是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
9.权利要求3的方法，其中的载体是热休克蛋白65(HSP 65)。
10.权利要求3的方法，其中的载体是来自结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(BCG)的多肽。
11.权利要求4的方法，其中的载体是破伤风类毒素。
12.权利要求4的方法，其中细菌类毒素是CRM197。
13.权利要求3的方法，其中的载体是重组链球菌C5a肽酶。
14.权利要求3的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
15.权利要求3的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1664。
16.权利要求3的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
17.权利要求3的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
18.权利要求3的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
19.权利要求1的方法，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
20.权利要求19的方法，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
21.权利要求1的方法，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白和真核生物的蛋白。
22.权利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
23.权利要求22的方法，其中的细菌选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphlylococcus epidermidis)，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，大肠杆菌(Esherichia coli)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)，肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)，Pseudomonas aerations，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，包氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysentriae)，耳炎差异球菌(Alloiococcus otitidis)和B类链球菌。
24.权利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
25.权利要求24的方法，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
26.权利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
27.权利要求26的方法，其中的真菌选自白假丝酵母(Candidaalbicaiis)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，组织浆菌，和曲霉。
28.权利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
29.权利要求28的方法，其中的寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
30.权利要求21的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
31.权利要求30的方法，其中的真核生物是人。
32.权利要求31的方法，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
33.权利要求32的方法，其中的肿瘤抗原选自肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特异性抗原。
34.权利要求31的方法，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
35.权利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
36.权利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
37.权利要求34的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
38.权利要求35的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ31-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
39.权利要求34的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
40.权利要求34的方法，其中的Aβ肽免疫原的一个或多个片段与另一肽免疫原融合。
41.权利要求40的方法，其中的Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原分子的N-末端。
42.权利要求40的方法，其中的Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同的另一个Aβ肽免疫原分子的C-末端。
43.权利要求40的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
44.权利要求40的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
45.权利要求41，42，43或44的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
46.权利要求41，42，43或44的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
47.权利要求40的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子连接到一个或多个异源肽分子。
48.权利要求47的方法，其中的Aβ多肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
49.权利要求47的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
50.权利要求47的方法，其中的异源肽选自T-细胞表位，B-细胞表位及其组合。
51.权利要求40的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)构象连接在一起。
52.权利要求40的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
53.权利要求51或52的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
54.权利要求51或52的方法，其中Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
55.权利要求1的方法，其中使用交联剂衍生蛋白质/多肽载体或任选连接的多肽接头的一个或多个氨基酸分子的官能团。
56.权利要求55的方法，其中的衍生试剂是零长度交联剂。
57.权利要求55的方法，其中的衍生试剂是同型双功能交联剂。
58.权利要求55的方法，其中的衍生试剂是异型双功能交联剂。
59.权利要求55的方法，其中的蛋白质/多肽载体与卤乙酰化试剂反应。
60.权利要求58的方法，其中的异型双功能试剂是与蛋白质/多肽载体的一个或多个氨基酸残基的伯胺或ε-胺官能团以及肽免疫原的一个或多个氨基酸残基的侧基硫醇基反应的试剂。
61.权利要求60的方法，其中的异型双功能试剂选自N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羰酸酯(SMCC)。
62.权利要求61的方法，其中的伯胺或ε-胺官能团是赖氨酸。
63.权利要求60的方法，其中的侧基硫醇基是肽免疫原的半胱氨酸残基。
64.权利要求63的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的氨基末端。
65.权利要求63的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的羧基末端。
66.权利要求63的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的内部。
67.权利要求63的方法，其中的侧基硫醇基由硫醇化试剂产生。
68.权利要求67的方法，其中硫醇基化试剂是N-乙酰基同型半胱氨酸硫内酯。
69.权利要求1的方法，其中用于使活化的蛋白质/多肽载体上的自由活性官能团失活的加帽试剂选自半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
70.权利要求1的方法，其中用于使活化的蛋白质/多肽载体上自由活性官能团失活的加帽试剂选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢铵和氨。
71.权利要求1的方法，其中肽免疫原的氨基酸残基的活性基团是自由巯基。
72.权利要求1的方法，其中一个或多个官能团位于接头上，其任选连接到蛋白质/多肽载体。
73.权利要求72的方法，其中的接头是肽接头。
74.权利要求73的方法，其中的肽接头是聚赖氨酸。
75.一种将肽免疫原与具有以下结构的蛋白质/多肽载体结合的方法 其中，C是蛋白质/多肽载体，X是蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的可衍生官能团或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的可衍生官能团，其中m是大于0但小于等于85的整数，所述方法包括以下步骤(a)衍生蛋白质/多肽载体或任选连接的多肽接头的一个或多个官能团，以产生具有活性位点的衍生的分子；(b)将步骤(a)的衍生的蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸残基的活性基团反应，以形成共价结合的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物；和(c)将所述结合物与加帽试剂进一步反应以使活化的蛋白质/多肽载体上自由活性官能团失活，以便加帽的基团不与其他分子自由反应，从而保留载体的官能度，使其保持引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，这种免疫应答在没有载体时不会发生，从而产生具有以下通式的加帽的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物 其中，C是蛋白质/多肽载体；Xd是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，n是大于0但是小于等于85的整数，以及p是大于0但是小于85的整数。
76.权利要求75的方法，其中的载体选自血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组的链球菌C5a肽酶，化脓链球菌ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
77.权利要求76的方法，其中的载体包含T-细胞表位。
78.权利要求77的方法，其中的载体是细菌类毒素。
79.权利要求77的方法，其中的载体是流感血凝素。
80.权利要求77的方法，其中的载体是PADRE多肽。
81.权利要求77的方法，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
82.权利要求77的方法，其中的载体是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
83.权利要求77的方法，其中的载体是热休克蛋白65(HSP65)。
84.权利要求77的方法，其中的载体是来自结核分支杆菌(BCG)的多肽。
85.权利要求78的方法，其中的载体是破伤风类毒素。
86.权利要求78的方法，其中细菌类毒素是CRM197。
87.权利要求77的方法，其中的载体是链球菌rC5a肽酶。
88.权利要求77的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
89.权利要求77的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1664。
90.权利要求77的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
91.权利要求77的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
92.权利要求77的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
93.权利要求75的方法，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
94.权利要求93的方法，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1，MIP-1β和RANTES。
95.权利要求75的方法，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
96.权利要求95的方法，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
97.权利要求96的方法，其中的细菌选自肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，大肠杆菌，克雷伯氏肠杆菌，单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，肉毒梭状芽孢杆菌，假单胞菌，鼠伤寒沙门菌，包氏疏螺旋体，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
98.权利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
99.权利要求98的方法，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
100.权利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
101.权利要求100的方法，其中的真菌选自白假丝酵母(Candidaalbicaiis)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，组织浆菌和曲霉。
102.权利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
103.权利要求102的方法，其中的寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
104.权利要求96的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
105.权利要求104的方法，其中的真核生物是人。
106.权利要求105的方法，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
107.权利要求106的方法，其中的肿瘤抗原是肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特异性抗原。
108.权利要求105的方法，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
109.权利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
110.权利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
111.权利要求108的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
112.权利要求108的方法，其中的肽免疫原是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
113.权利要求108的方法，其中的肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
114.权利要求108的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原的分子与另一肽免疫原融合。
115.权利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到另一相同Aβ肽免疫原分子的N-末端。
116.权利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到另一相同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
117.权利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
118.权利要求114的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
119.权利要求115，116，117或118的方法，其中Aβ片段衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
120.权利要求115，116，117或118的方法，其中的Aβ片段是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
121.权利要求114的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子融合到一个或多个异源肽分子。
122.权利要求121的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
123.权利要求121的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
124.权利要求121的方法，其中异源肽选自T-细胞表位，B-细胞表位及其组合。
125.权利要求114的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
126.权利要求114的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
127.权利要求125或126的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
128.权利要求125或126的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
129.权利要求75的方法，其中使用交联剂衍生蛋白质/多肽载体或任选连接的多肽接头的一个或多个氨基酸分子的官能团。
130.权利要求129的方法，其中的衍生试剂是零长度交联剂。
131.权利要求129的方法，其中的衍生试剂是同型双功能交联剂。
132.权利要求129的方法，其中的衍生试剂是异型双功能交联剂。
133.权利要求129的方法，其中的蛋白质/多肽载体与卤乙酰化试剂反应。
134.权利要求133的方法，其中的异型双功能试剂是与蛋白质/多肽载体的一个或多个氨基酸残基的伯胺或ε-胺官能团以及肽免疫原的一个或多个氨基酸残基的侧基硫醇基反应的试剂。
135.权利要求134的方法，其中的异型双功能试剂是N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羰酸酯(SMCC)。
136.权利要求134的方法，其中的伯胺或ε-胺官能团是赖氨酸。
137.权利要求136的方法，其中用N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯衍生蛋白质/多肽载体的氨基酸残基赖氨酸的伯胺或ε-胺官能团导致蛋白质/多肽载体上赖氨酸残基的伯胺或ε-胺官能团的溴乙酰化。
138.权利要求134的方法，其中的侧基硫醇基是肽免疫原的半胱氨酸残基。
139.权利要求138的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的氨基末端。
140.权利要求138的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的羧基末端。
141.权利要求138的方法，其中的半胱氨酸残基位于肽免疫原的内部。
142.权利要求138的方法，其中的侧基硫醇基由硫醇化试剂产生。
143.权利要求142的方法，其中的硫醇化试剂是N-乙酰同型半胱氨酸硫内酯。
144.权利要求75的方法，其中用于使活化的蛋白质/多肽载体上自由活性官能团失活的加帽试剂选自半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
145.权利要求75的方法，其中用于使活化的蛋白质/多肽载体上自由活性官能团失活的加帽试剂选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢铵和氨。
146.权利要求75的方法，其中的肽免疫原氨基酸残基的活性基团是自由巯基。
147.权利要求75的方法，其中的一个或多个官能团位于接头上，所述接头任选连接到蛋白质/多肽载体上。
148.权利要求147的方法，其中的接头是肽接头。
149.权利要求148的方法，其中的肽接头是聚赖氨酸。
150.一种肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物，其中的蛋白质/多肽载体具有如下通式的结构 其中C是蛋白质/多肽载体，X是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的可衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的可衍生官能团，其中m是大于0但小于等于85的整数，并且，其中的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物具有如下通式的结构 其中，C是蛋白质/多肽载体，Xd是蛋白质/多肽载体上氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，从而保持载体的官能度，以便维持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时是不会发生，n是大于0但是小于等于85的整数，p是大于0但是小于85的整数。
151.权利要求150的结合物，其中的载体选自血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
152.权利要求150的结合物，其中的载体包含T-细胞表位。
153.权利要求152的结合物，其中的载体是细菌类毒素。
154.权利要求152的结合物，其中的载体是流感血凝素。
155.权利要求152的结合物，其中的载体是PADRE多肽。
156.权利要求152的结合物，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
157.权利要求152的结合物，其中的载体是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
158.权利要求152的结合物，其中的载体是热休克蛋白65(HSP65)。
159.权利要求152的结合物，其中的载体是来自结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(BCG)的多肽。
160.权利要求153的结合物，其中的载体是破伤风类毒素。
161.权利要求153的结合物，其中的细菌类毒素是CRM197。
162.权利要求152的结合物，其中的载体是链球菌rC5a肽酶。
163.权利要求152的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
164.权利要求152的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1664。
165.权利要求152的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
166.权利要求152的结合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
167.权利要求152的结合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
168.权利要求150的结合物，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
169.权利要求168的结合物，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
170.权利要求150的结合物，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
171.权利要求170的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
172.权利要求171的结合物，其中细菌选自肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，大肠杆菌，克雷伯氏肠杆菌，单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，肉毒梭状芽孢杆菌，假单胞菌，鼠伤寒沙门菌，包氏疏螺旋体，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
173.权利要求170的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
174.权利要求173的结合物，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
175.权利要求170的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
176.权利要求175的结合物，其中的真菌选自白假丝酵母，新型隐球菌，球孢菌，组织浆菌，和曲霉。
177.权利要求170的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
178.权利要求177的结合物，其中的寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
179.权利要求170的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
180.权利要求179的结合物，其中的真核生物是人。
181.权利要求180的结合物，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
182.权利要求181的结合物，其中的肿瘤抗原选自肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
183.权利要求180的结合物，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
184.权利要求183的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
185.权利要求183的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
186.权利要求183的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
187.权利要求183的结合物，其中的肽免疫原是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
188.权利要求183的结合物，其中的肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
189.权利要求183的结合物，其中一个或多个Aβ分子与另一肽免疫原的一个或多个分子融合。
190.权利要求189的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原的另一个分子的N-末端。
191.权利要求189的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到另一相同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
192.权利要求189的结合物，其中Aβ肽免疫原的分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原的分子的C-末端。
193.权利要求189的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原的分子的C-末端。
194.权利要求190，191，192或193的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
195.权利要求190，191，192或193的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
196.权利要求189的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子连接到一个或多个异源肽分子。
197.权利要求196的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
198.权利要求196的结合物，其中的Aβ片段是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
199.权利要求196的结合物，其中的异源肽选自T-细胞表位，B-细胞表位及其组合。
200.权利要求189的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
201.权利要求189的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个不同的Aβ肽免疫原拷贝以多抗原肽(MAP)的构象连接。
202.权利要求200或201的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
203.权利要求200或201的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
204.根据权利要求75的方法产生的肽免疫原-蛋白质/多肽载体结合物，其具有通式如下的结构 其中，C是蛋白质/多肽载体，Xd是蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团，或任选为共价连接到蛋白质/多肽载体的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，以及，其中，P是肽免疫原分子，其共价连接到蛋白质载体的氨基酸残基的衍生官能团，或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，R是加帽分子，其共价连接到蛋白质/多肽载体的氨基酸残基的衍生官能团，或任选共价连接到与蛋白质/多肽载体共价连接的肽接头的氨基酸残基的衍生官能团，从而保持载体的官能度，以便维持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，该免疫应答在没有载体时不会发生，n是大于0但是小于等于85的整数，p是大于0但是小于85的整数。
205.权利要求204的结合物，其中的载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体(Chlafnydiapneumoniae)ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
206.权利要求204的结合物，其中的载体包含T-细胞表位。
207.权利要求206的结合物，其中的载体是细菌类毒素。
208.权利要求206的结合物，其中的载体是流感血凝素。
209.权利要求206的结合物，其中的载体是PADRE多肽。
210.权利要求206的结合物，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
211.权利要求206的结合物，其中的载体是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
212.权利要求206的结合物，其中的载体是热休克蛋白65(HSP65)。
213.权利要求206的结合物，其中的载体是来自结核分支杆菌(BCG)的多肽。
214.权利要求207的结合物，其中的载体是破伤风类毒素。
215.权利要求207的结合物，其中细菌类毒素是CRM197。
216.权利要求206的结合物，其中的载体是链球菌rC5a肽酶。
217.权利要求206的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
218.权利要求206的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1664。
219.权利要求206的结合物，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
220.权利要求206的结合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
221.权利要求206的结合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
222.权利要求206的结合物，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
223.权利要求222的结合物，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
224.权利要求206的结合物，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
225.权利要求224的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
226.权利要求225的结合物，其中的细菌选自其中细菌选自肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，大肠杆菌，克雷伯氏肠菌，单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，肉毒梭状芽孢杆菌，假单胞菌，鼠伤寒沙门菌，包氏疏螺旋体，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
227.权利要求224的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
228.权利要求227的结合物，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
229.权利要求224的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
230.权利要求229的结合物，其中的真菌选自白假丝酵母，新型隐球菌，球孢菌，组织浆菌和曲霉。
231.权利要求224的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
232.权利要求231的结合物，其中的寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
233.权利要求224的结合物，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
234.权利要求233的结合物，其中的真核生物是人。
235.权利要求234的结合物，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
236.权利要求235的结合物，其中的肿瘤抗原选自肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤抗原和前列腺癌特异性抗原。
237.权利要求234的结合物，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
238.权利要求237的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
239.权利要求237的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
240.权利要求237的结合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
241.权利要求237的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
242.权利要求237的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
243.权利要求237的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原的分子与另一肽免疫原融合。
244.权利要求243的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原的另一分子的N-末端。
245.权利要求243的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原的另一分子的C-末端。
246.权利要求243的结合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
247.权利要求243的结合物，其中的Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
248.权利要求244，245，246或247的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
249.权利要求244，245，246或247的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
250.权利要求243的结合物，其中一个或多个Aβ片段连接到一个或多个异源肽分子。
251.权利要求250的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
252.权利要求250的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
253.权利要求250的结合物，其中的异源肽选自T-细胞表位，B-细胞表位及其组合。
254.权利要求243的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
255.权利要求243的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个拷贝的不同的Aβ肽免疫原以多抗原肽(MAP)的构象连接。
256.权利要求254或255的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
257.权利要求254或255的结合物，其中Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
258.权利要求243的结合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子连接到一个或多个异源肽分子。
259.权利要求258的结合物，其中的异源肽选自T-细胞表位，B-细胞表位及其组合。
260.权利要求258的结合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
261.权利要求258的结合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
262.一种免疫原性组合物，包括通过权利要求75的方法产生的肽免疫原与蛋白质/多肽载体的结合物，连同一种或多种可药用的赋形剂，稀释剂和/或佐剂。
263.权利要求262的免疫原性组合物，其中的载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
264.权利要求262的免疫原性组合物，其中的载体包含T-细胞表位。
265.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是细菌类毒素。
266.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是流感血凝素。
267.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是PADRE多肽。
268.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
269.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是乙肝表面抗原(HBSAg19-28)。
270.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是热休克蛋白65(HSP65)。
271.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是来自结核分支杆菌(BCG)的多肽。
272.权利要求265的免疫原性组合物，其中的细菌类毒素是破伤风类毒素。
273.权利要求265的免疫原性组合物，其中细菌类毒素是CRM197。
274.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是链球菌rC5a肽酶。
275.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
276.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是化脓链球菌ORF1664 。
277.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
278.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
279.权利要求264的免疫原性组合物，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
280.权利要求262的免疫原性组合物，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
281.权利要求280的免疫原性组合物，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
282.权利要求262的免疫原性组合物，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和真核生物蛋白。
283.权利要求282的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
284.权利要求283的免疫原性组合物，其中的细菌选自肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，大肠杆菌，克雷伯氏肠杆菌，单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，肉毒梭状芽孢杆菌，假单胞菌，鼠伤寒沙门菌，包氏疏螺旋体，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
285.权利要求282的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
286.权利要求285的免疫原性组合物，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
287.权利要求282的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
288.权利要求287的免疫原性组合物，其中的真菌选自白假丝酵母，新型隐球菌，球孢菌，组织浆菌和曲霉。
289.权利要求282的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
290.权利要求289的免疫原性组合物，其中的寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
291.权利要求282的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
292.权利要求291的免疫原性组合物，其中的真核生物是人。
293.权利要求292的免疫原性组合物，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
294.权利要求293的免疫原性组合物，其中的肽免疫原选自肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE)抗原和前列腺癌特异性抗原。
295.权利要求292的免疫原性组合物，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
296.权利要求295的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
297.权利要求295的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
298.权利要求295的免疫原性组合物，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
299.权利要求295的免疫原性组合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并且是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
300.权利要求295的免疫原性组合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
301.权利要求295的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同Aβ肽免疫原另一分子的N-末端。
302.权利要求295的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的C-末端。
303.权利要求295的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
304.权利要求295的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
305.权利要求301，302，303或304的免疫原性组合物，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
306.权利要求301，302，303或304的免疫原性组合物，其中的的Aβ片段是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
307.权利要求295的免疫原性组合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子连接到一个或多个异源肽分子。
308.权利要求307的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
309.权利要求307的免疫原性组合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
310.权利要求295的免疫原性组合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
311.权利要求295的免疫原性组合物，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接。
312.权利要求310或311的免疫原性组合物，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
313.权利要求310或311的免疫原性组合物，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
314.权利要求262的免疫原性组合物，其中一种或多种佐剂选自GM-CSF，529SE，IL-12，磷酸铝，氢氧化铝，结核分支杆菌，百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)，细菌脂多糖，氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物，MPLTM(3-O-脱酰基单磷酯酰脂A)，多肽，Quil A，STIMULONTMQS-21，百日咳毒素(PT)，大肠杆菌热敏感毒素(LT)，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，G-CSF，TNF-α和TNF-β。
315.权利要求314的免疫原性组合物，其中的肽免疫原是Aβ，载体是CRM197，佐剂是529SE。
316.一种诱导哺乳动物受试者免疫应答的方法，包括给所述受试者给药有效量的权利要求262的免疫原性组合物。
317.权利要求316的方法，其中的载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PADRE多肽，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，结核分枝杆菌，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌ORF1224，化脓链球菌ORF1664，化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORFT367，肺炎衣原体ORFT858，破伤风类毒素，HIVgp120 T1，识别微生物表面粘附基质分子(MSCRAMMS)的组分，生长因子，激素，细胞因子和趋化因子。
318.权利要求316的方法，其中的载体包含T-细胞表位。
319.权利要求318的方法，其中的载体是细菌类毒素。
320.权利要求318的方法，其中的载体是流感血凝素。
321.权利要求318的方法，其中的载体是PADRE多肽。
322.权利要求318的方法，其中的载体是疟原虫环子孢子(CS)蛋白。
323.权利要求318的方法，其中的载体是乙肝表面抗原。
324.权利要求318的方法，其中的载体是热休克蛋白65(HSP65)。
325.权利要求318的方法，其中的载体是来自结核分支杆菌(BCG)的多肽。
326.权利要求319的方法，其中的细菌类毒素是破伤风类毒素。
327.权利要求319的方法，其中细菌类毒素是CRM197。
328.权利要求318的方法，其中的载体是链球菌rC5a肽酶。
329.权利要求318的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1224。
330.权利要求318的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF1664。
331.权利要求318的方法，其中的载体是化脓链球菌ORF2452。
332.权利要求318的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT367。
333.权利要求318的方法，其中的载体是肺炎衣原体ORFT858。
334.权利要求316的方法，其中的载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答。
335.权利要求334的方法，其中的生长因子或激素选自IL-1，IL-2，γ-干扰素，IL-10，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β和RANTES。
336.权利要求316的方法，其中的肽免疫原选自细菌蛋白、病毒蛋白和真核生物蛋白。
337.权利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自来自细菌的蛋白抗原。
338.权利要求337的方法，其中的细菌选自肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，大肠杆菌，克雷伯氏肠杆菌，单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，肉毒梭状芽孢杆菌，假单胞菌，鼠伤寒沙门菌，包氏疏螺旋体，弗氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，耳炎差异球菌和B类链球菌。
339.权利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自来自病毒的蛋白抗原。
340.权利要求339的方法，其中的病毒选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，副流感病毒(PIV)，水泡性口膜炎病毒(VSV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，冠状病毒，牛痘病毒，轮状病毒，狂犬病病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
341.权利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真菌的蛋白抗原。
342.权利要求341的方法，其中的真菌选自白假丝酵母(Candidaalbicaiis)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，球孢菌(Coccidoides)，组织浆菌和曲霉。
343.权利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自来自寄生虫的蛋白抗原。
344.权利要求343的方法，其中寄生虫选自疟原虫，锥虫，血吸虫和利什曼原虫。
345.权利要求336的方法，其中的肽免疫原衍生自来自真核生物的蛋白抗原。
346.权利要求345的方法，其中的真核生物是人。
347.权利要求347的方法，其中来自人的肽免疫原衍生自恶性肿瘤。
348.权利要求347的方法，其中的肽免疫原衍生自肾细胞癌抗原，乳癌抗原，癌胚抗原，黑素瘤(MAGE-1)抗原和前列腺癌特异性抗原。
349.权利要求346的方法，其中的肽免疫原来自人Aβ多肽。
350.权利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域。
351.权利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的C-末端区域。
352.权利要求349的方法，其中的肽免疫原衍生自Aβ多肽的内部区域。
353.权利要求350的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并且是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
354.权利要求349的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
355.权利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的N-末端。
356.权利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到相同的Aβ肽免疫原另一分子的C-末端。
357.权利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其C-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
358.权利要求349的方法，其中Aβ肽免疫原的一个分子在其N-末端融合到不同的Aβ肽免疫原分子的C-末端。
359.权利要求355，356，357或358的方法，其中Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
360.权利要求355，356，357或358的方法，其中Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
361.权利要求349的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子连接到一个或多个异源肽拷贝。
362.权利要求361的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4。
363.权利要求361的方法，其中的Aβ肽免疫原选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42。
364.权利要求349的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接在一起。
365.权利要求349的方法，其中一个或多个Aβ肽免疫原分子与一个或多个不同的Aβ肽免疫原分子以多抗原肽(MAP)的构象连接。
366.权利要求364或365的方法，其中的Aβ肽免疫原衍生自Aβ多肽的N-末端区域，并是选自Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，1-12，3-7，1-3和1-4的Aβ片段。
367.权利要求364或365的方法，其中的Aβ肽免疫原是选自Aβ7-11，3-28，16-22，16-23，17-23，17-24，18-24，18-25，17-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42的Aβ片段。
368.权利要求262的方法，其中一种或多种佐剂选自GM-CSF，529SE，IL-12，磷酸铝，氢氧化铝，结核分支杆菌，百日咳博德特氏菌，细菌脂多糖，氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物，MPLTM(3-O-脱酰基单磷酯酰脂A)，多肽，Quil A，STIMULONTMQS-21，百日咳毒素(PT)，大肠杆菌热敏感毒素(LT)，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，G-CSF，TNF-α和TNF-β。
369.权利要求368的方法，其中的肽免疫原是Aβ，载体是CRM197，佐剂是529SE。
全文摘要
本发明涉及生产具有蛋白质/多肽载体分子的肽免疫原结合物的方法，所述蛋白质/多肽载体分子可有效用作免疫原，其中肽免疫原通过载体或任选连接的接头分子的氨基酸残基上的活化官能团结合到蛋白质载体上，其中氨基酸残基上任何未结合的活性官能团通过加帽而失活，从而维持载体分子的免疫功能，但降低发生使结合物安全性或效果降低的不希望的反应的倾向。此外，本发明还涉及这样的免疫原性产品和含有通过这种方法制备的这种免疫原性产品的免疫原性组合物。
文档编号A61K39/38GK1984676SQ200480037802
公开日2007年6月20日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月17日
发明者拉萨帕·G·阿鲁穆格哈姆, A·克利须那·普拉萨德 申请人:惠氏公司