段产物和第二组DNA片段产物，所得产物混合后，以LDLR1 (SEQID N0:7)和LDLR4(SEQ ID N0:10)为第三组引物与混合后的产物再进行PCR，即得重叠 PCR产 物PLDLR-LDLR基因；所得的重叠 PCR产物PLDLR-LDLR基因备用，后续克隆步骤本参见发明 实施例1步骤（1);
[0297] 引物LDLR2(SEQ ID N0:8)和引物LDLR3(SEQ ID N0:9)中的斜体且加粗的序列为 第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物的重叠部分序列；
[0298] b)采用引物 LDLR1、LDLR2、LDLR5 和 LDLR4 扩增 PLDLR-LDLR 基因，步骤为： LDLR1(SEQ ID N0:7)和 LDLR2(SEQ ID N0:8)为第一组引物，LDLR5(SEQ ID N0:11)和 LDLR4(SEQ ID NO: 10)为第二组引物，重叠 PCR时，先分别采用第一组引物和第二组引物进 行PCR，得到第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物，所得产物混合后，以LDLR1 (SEQ ID N0:7)和LDLR4(SEQ ID N0:10)为第三组引物与混合后的产物再进行PCR，即得重叠 PCR产 物PLDLR. Kozak. LDLR基因；所得的重叠 PCR产物PLDLR. Kozak. LDLR基因备用，后续步骤本 参见发明实施例1步骤（1);
[0299] 引物LDLR2(SEQ ID N0:8)和引物LDLR5(SEQ ID N0:11)中的点式下划线标识部 分为重叠 PCR的接头序列，即为第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物的重叠部分序 列；
[0300] c)采用引物 LDLR1、LDLR6、LDLR7 和 LDLR4 扩增 PLDLR-LDLR 基因，步骤为： LDLR1(SEQ ID N0:7)和 LDLR6(SEQ ID N0:12)为第一组引物，LDLR7(SEQ ID N0:13)和 LDLR4 (SEQ ID NO: 10)为第二组引物，重叠 PCR时，先分别采用第一组引物和第二组引物进 行PCR，得到第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物，所得产物混合后，以LDLR1 (SEQ ID NO: 7)和LDLR4 (SEQ ID NO: 10)为第三组引物与混合后的产物再进行PCR，即得重叠 PCR产 物PLDLR. UTR. LDLR基因；所得的重叠 PCR产物PLDLR. UTR. LDLR基因备用，后续步骤本参见 发明实施例1步骤（1);
[0301] 引物LDLR6(SEQ ID N0:12)和引物LDLR7(SEQ ID N0:13)中的点式下划线标识部 分为重叠 PCR的接头序列，即第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物的重叠部分序列。
[0302] 表1中，备注栏PLDLR表示相对应的引物为LDLR启动子的引物。
[0303] 表1中，备注栏UTR表示相对应的引物为UTR的引物。
[0304] 表1中，备注栏qPCR表示相对应的引物为用于相对定量PCR(RT-qPCR)的引物，包 括 LDLR-F(SEQ ID N0:17)和 LDLR-R(SEQ ID N0:18)。
[0305] 本发明实施例采用的相对定量PCR(RT-qPCR)内参为肌动蛋白（Actin)，内参引物 包括 Actin-F(SEQ ID N0:19)和 Actin-R(SEQ ID N0:20)。
[0306] 本发明实施例采用的相对定量PCR用Qiagen QuantiFast SYBR Green PCR kit试 剂盒在 Roche system 上完成的。程序包括为：94°C 5min，94°C for 20s, 68°C for 20s(40 个循环）。
[0307] 实施例一
[0308] 构建制备微环DNA的亲本质粒，包括以下步骤：
[0309] 1)以LDLR cDNA (GenBank登录号为ΝΜ_000527· 4所示核苷酸序列的188~ 2770bp)，含有SRE的LDLR启动子区域（LDLR启动子的核苷酸序列为GenBank登录号为 NG_009060. 1所示核苷酸序列的3170~4982bp ;SRE的核苷酸序列为GenBank登录号 为NG_009060. 1所示核苷酸序列的4983~5169bp)为模板，分别以表1中所示的引物组 合 1 (LDLR1、LDLR2、LDLR3、LDLR4)，引物组合 2 (LDLR1、LDLR2、LDLR5、LDLR4)，引物组合 3(LDLR1、LDLR6、LDLR7、LDLR4)为引物进行重叠 PCR，重叠 PCR的具体步骤参见本发明实 施例所述的"表1重叠 PCR引物说明"，得到的目的片段通过Spel以及Sail双酶切后，采 用DNA T4连接酶连接到ZY781. bpA的Spel以及Sail位点多克隆位点之间，得到的重组 质粒经测序鉴定后命名为2￥781.?0)1^.0)1^允口4、2￥781.?0)1^.1(〇231^0)1^允口4、2￥781· PLDLR. UTR. LDLR. bpA。
[0310] 其中，UTR序列为CAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT(SEQ ID N0:21)，UTR为非编码区域， 用来作为对照。
[0311] 2)以 ZY781. ApoE. bpA 为模板（pMC. BESPX Spel 和 EcoRI 插入 HCR 和 ApoE 启 动子，Seal和PspOMI插入SV40bpA，所述的HCR为增强子，所述增强子的核苷酸序列为 GenBank登录号为U32510. 1所示核苷酸序列的5~325bp)，LDLR-F(SEQ ID N0:11)和 LDLR-R(SEQ ID NO: 12)为引物PCR得到的HCR片段，通过Spel酶切分别连接到ZY781. PLDLR. LDLR. bpA, ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA上，得到的质粒经测序鉴定后分别命名为 ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA, ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA。
[0312] 3)分别以 ZY781. PLDLR. LDLR. bpA, ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA 为模板， LDLR-8(SEQIDN0:8)和LDLR-4(SEQIDN0:4)为引物PCR得到的片段，通过HindIII 和Sal I双酶切连接到ZY781. ApoE. bpA，得到的质粒经测序鉴定后分别命名为ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA, ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA〇
[0313] 结果：
[0314] a.所采用的ZY781. bpA空载体的的质粒图谱分别如图1所示；所构建的用于制备 微环DNA的亲本质粒的质粒图谱分别如图2~8所示。
[0315] b.对所构建的用于制备微环DNA的亲本质粒进行测序，测序结果表明本发明实施 例1得到了微环DNA的亲本质粒。
[0316] 实施例二
[0317] 制备微环DNA，包括以下步骤：
[0318] 1)将实施例 1 制备的亲本质粒 ZY781. PLDLR. LDLR. bpA、ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA, ZY781. PLDLR. UTR. LDLR. bpA, ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA, ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA分别转化大肠杆菌基因工程菌E. coli ZYCY10P3S2T，得到含有各亲 本质粒的E. coli ZYCY10P3S2T，分别表示为：
[0319] E. coli ZYCY10P3S2T(ZY781. PLDLR. LDLR. bpA),
[0320] E. coli ZYCY10P3S2T(ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA)、
[0321] E. coli ZYCY10P3S2T(ZY781. PLDLR. UTR. LDLR. bpA),
[0322] E. coli ZYCY10P3S2T(ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA)、
[0323] E. coli ZYCY10P3S2T(ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA)、
[0324] E. coli ZYCY10P3S2T (ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA)、
[0325] E. coli ZYCY10P3S2T (ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA);
[0326] 2)得到含有各亲本质粒的E. coli ZYCY10P3S2T分别进行接种：
[0327] 在12mL细菌培养管中装入5mL TB培养基（卡那霉素（Kanamycin)终浓度50 μ g/ ml)，接种后在37°C、250rpm培养8h。
[0328] 3)在2L锥形瓶中装入400mL TB培养基（Kanamycin终浓度50 μ g/ml)，按1 %的 接种量进行接种，然后37°C、250rpm培养12-16h。
[0329] 4)配制诱导液：取400mL的LB培养基、16mL的Na0H(lmol/L) ;400 μ L的阿拉伯糖 (已经过滤除菌，质量分数20wt% )。
[0330] 5)将步骤⑷配置的诱导液加入到步骤（3)中的培养液中诱导5_8h。
[0331] 6)离心收集菌体，用QIAGEN Plasmid Mega Kit (25)(货号12183)质粒大量提取 试剂盒提取质粒。
[0332] 7)酶切鉴定制备的微环DNA，结果显示亲本质粒ZY781. PLDLR. LDLR. bpA、ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、ZY781. PLDLR. UTR. LDLR. bpA、ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、 ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA 均获得 了较纯的微环 DNA，分别命名为 MC. PLDLR. LDLR. bpA, MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA, MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA, MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA〇
[0333] 实施例三
[0334] 相对定量PCR (RT-qPCR)从mRNA水平对LDLR基因表达情况进行检测，包括以下步 骤：
[0335] a. HepG2细胞以每孔3*104铺板24孔板培养24h。
[0336] b. Qiagen superfect转染试剂盒（货号301307)，将实施例2制备的不同微环 DNA、以及对照质粒ZY781分别转染Η印G2细胞。
[0337] c.每种质粒转染HepG2细胞设置三组，根据细胞培养基的不同分别为对照组（采 用 Control medium)、胆固醇组（米用 Sterol medium)和他汀组（米用 Statin medium), 其中，对照组的细胞培养基为DMEM ;胆固醇组的细胞培养基为在DMEM细胞培养基中加入终 浓度为10 μ g/mL的胆固醇（Sigma，货号C3045-5G)、以及终浓度为0. 5 μ g/mL的25-羟基 胆固醇（Sigma，货号H1015-10MG);他汀组的细胞培养基在DMEM细胞培养基中加入终浓度 为0. 75 μ g/mL的他汀类药物（Sigma，货号S6196-5MG)，各组细胞培养36h (细胞培养条件 为常规条件）。
[0338] d.米用 Omega Total RNA试剂盒（货号 R6834-02)提取 RNA。e.米用 primeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（货号DRR047A)进行反转录。
[0339] f. RT qPCR以Actin为内参，内参引物为Actin-F与Actin_R(参见表1)。引物 LDLR-F与LDLR-R(参见表1)特异性地针对LDLR基因。相对定量PCR用Qiagen QuantiFast SYBR Green PCR kit试剂盒（货号204054)在Roche system上完成的。程序包括为：94°C 5min，94°C for 20s，68°C for 2〇8(40个循环）。
[0340] 结果：
[0341] a.如图9~16所示，图9~16分别为ZY781. bpA空载体、微环DNA MC. PLDLR. LDLR. bpA、MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA转染H印G2细胞后，对各组细胞中LDLR基因的mRNA 进行RT-PCR结果，在图9~图16中，每个图中柱-1(每个图中的781、PLDLR等不同，如图 9中，柱-1用781-1表示）为对照组，柱-2为胆固醇组，柱-3为他汀组（P为可信度，为重 复5次平行实验的结果，表示P〈0. 05, "**"表示P〈0. 01)
[0342] 由图9可知，即ZY781. bpA空载体转染细胞后的RT-PCR结果，图9中各组细胞的 LDLR基因表达水平均不高；此外，在图9中，虽然图9的胆固醇组的LDLR基因表达水平较 低，但相对于对照组，胆固醇组相差不明显；此外，而相对于对照组，图9的他汀组的LDLR基 因表达水平差异也不大，说明不含本发明提供的调节性表达目的基因的载体的细胞对胆固 醇水平的反馈调节不明显。
[0343] 而在图10~11以及图13~16中，每个图的的对照组、胆固醇组和他汀组均显 示出下述的类似的规律，该规律表现为：相对于各自的对照组，胆固醇组均显示出不同程度 的LDLR基因表达下调；而相对于各自的胆固醇组和对照组，他汀组均显示出不同程度的 LDLR基因表达上调；所述规律在图10、11、13、14中尤其表现明显；这说明在本实施例3提 供的细胞实验水平上，本发明提供的微环〇嫩1(：.?0)1^.0)1^允口4、]\?：.?0)1^.1(〇231^0)1^· bpA、MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、比微环 DNA MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA 的调节能力更强。即 在细胞实验水平上，本发明提供的调节性表达目的基因的载体
[0344] 同时具有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE两种调控元件；
[0345] 或同时含有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、Kozak序列三种调控元件；
[0346] 或同时含有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、肝特异性定位控制元件HCR三种 调控元件
[0347] 或同时具有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、肝特异性定位控制元件HCR、 Kozak序列四种调控元件时，本发明提供的调节性表达目的基因的载体对目的基因的调节 作用更加明显，上述的4种调控元件组合是更选优的组合方式。
[0348] 此外，图12显示：相对于图12的对照组，虽然胆固醇组显示出LDLR基因表达下 调，但是相对于图12的胆固醇组，图12的他汀组却并没有显示出LDLR基因表达的上调；这 说明没有胆固醇调节元件SRE的微环MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA不能起到调节表达LDLR基 因的作用，这从反面说明具有胆固醇调节元件SRE的调节性表达目的基因的载体（本实施 例中，所述目的基因为LDLR基因）对于细胞根据胞内胆固醇水平主动地调节LDLR基因的 表达非常关键，本发明提供的载体转录的胆固醇调节元件SRE通过胆固醇反馈调节路径赋 予了细胞调控胆固醇代谢的内在能力，当胞内胆固醇水平高时（对应本发明实施例的胆固 醇组），细胞通