选为A 或G。
[0128] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体还包含肝特异性定位控制元件。
[0129] 如本文所用，"肝特异性定位控制元件"（HCR)是指具有DNase I敏感性位点的核 苷酸序列，该区发现于载脂蛋白E(ApoE)基因的下游，肝细胞控制区能增强肝特异性基因 的表达。
[0130] 优选地，所述肝特异性定位控制元件为增强子。
[0131] 进一步优选地，增强子为LDLR基因启动子上的增强子。
[0132] 优选地，所述LDLR基因启动子上的增强子的GenBank登录号为U32510. 1。
[0133] 本发明一个优选实施例中，构建了的调节性表达目的基因的载体采用的增强子的 核苷酸序列为GenBank登录号为U32510. 1所不核苷酸序列的5~325bp。
[0134] 具体地，所述LDLR基因启动子上的增强子的序列可通过PCR获得，所述PCR的方 法为：采用本发明提供的pLDLR-F(SEQ ID N0:11)和LDLR-R(SEQ ID N0:12)为PCR引物， 以ZY781. ApoE. bpA为PCR模板进行PCR后获得所述LDLR基因启动子上的增强子。
[0135] LDLR基因启动子上是没有肝特异性定位控制元件的，本发明将肝特异性定位控制 元件放在LDLR基因启动子前面，可以增强LDLR基因的表达。
[0136] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体不含标准质粒的骨架DNA序列。
[0137] 如本文所用的，"骨架DNA序列"包括标准质粒中负责细菌质粒的复制、或筛选含质 粒的宿主等功能的DNA序列，包括细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序等。
[0138] 本文所采用的"骨架DNA"和"骨架DNA载体"可以互换。
[0139] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体不含亲本质粒中抑制目的基因表达的骨 架DNA序列。
[0140] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为微环DNA。
[0141] 如本文所用，"微环DNA"是指不含原核质粒的骨架DNA序列，主要以超螺旋结构存 在的载体，能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外稳定持久表达转录或表达目的基因。
[0142] 本发明采用的微环DNA，由于除去了细菌来源的骨架DNA序列，与病毒载体、质粒 载体相比，微环DNA的体内体外基因表达减少了发生炎症和基因沉默的可能，表达周期更 久，基因表达强度增强 10-1000 倍（Chen Z Y 等，Gene Ther，，ll(10):856 - 864(2004); Kay 等，Nat Biotechnol, 28(12):1287-1289(2010);美国专利US, 897,380B2 ;Mayrhofer P 等，Methods Mol Biol, 542:87-104(2009))。
[0143] 优选地，所述微环DNA包括任何本领域技术人员根据需要所添加的序列。
[0144] 在本文一实施例中，微环DNA可通过传统质粒在大肠杆菌中经过位点特异性 重组制得，微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的 安全性（Chen Z Y 等，Gene Ther, 11 (10) : 856 - 864(2004) ;Chen ZY 等，· Molecular therapy, 2008, 16(3) :548-556) 〇
[0145] 本文所采用的"微环DNA"和"微环DNA载体"可以互换。
[0146] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为将所述目的基因表达盒插入p2〇C31 空质粒的多克隆位点所得的p2〇C31微环DNA载体母质粒。
[0147] 如本文所用，"p2〇C31空质粒"具有attB位点和attP位点，该attB位点和attP 位点能在OC31重组酶的作用下进行重组。
[0148] 具体地，所述空质粒p2〇C31构建方法参照Chen ZY等，Molecular Therapy，8(3)，495-500(2003)、Chen ZY等，Human Gene Therapy, 16(1)，126-131 (2005)和 美国专利US7897380B2。
[0149] 进一步优选地，所述调节性表达目的基因的载体为所述p2〇C31微环DNA载体母 质粒经过位点特异性重组获得的微环DNA载体。
[0150] 位点特异性重组主要有phiC31 (OC31)重组酶系统、parA重组酶系统、Cre重组 酶系统（胡春生等，生物技术通讯，22(1):104-109(2011))。本发明所述的经过微环DNA 载体母质粒的位点特异性重组获得的微环DNA载体的方法中，所述具有特异性重组位点的 微环DNA载体母质粒包括具有phiC31特异性重组位点的母质粒，比如p2 OC31微环DNA载 体母质粒；还包括并且不限于具有其他特异性重组位点的微环DNA载体母质粒，比如具有 parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点的微环DNA载体母质粒。
[0151] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为将所述目的基因表达盒插入pMC. BESPX空质粒的多克隆位点所得的pMC. BESPX微环DNA母质粒。
[0152] 如本文所用，"pMC. BESPX空质粒"具有attB位点和attP位点，该attB位点和attP 位点能在OC31重组酶的作用下进行重组。
[0153] 具体地，所述空质粒pMC. BESPX全基因序列参照Chen ZY等，Nature Biotechnol ogy，28,（12)，1289-1291(2010)。
[0154] 进一步优选地，所述调节性表达目的基因的载体为所述pMC. BESPX微环DNA母质 粒经过位点特异性重组获得的微环DNA载体。
[0155] 优选地，所述调节性表达目的基因的载体为将所述目的基因表达盒插入ZY781. bpA质粒的多克隆位点所得的ZY781. bpA微环DNA母质粒。
[0156] 具体地，所述ZY781.bpA为在空质粒p MC.BESPX的PspOMI和Seal位点插入 SV40bpA片段而制得的重组质粒，所述SV40bpA的基因登录号为NC_001669. 1 ;所述空质粒 pMC. BESPX 的全基因序列参照 Chen ZY 等，Nature Biotechnology, 28,（12),1289-1291 (20 10) 〇
[0157] 进一步优选地，所述调节性表达目的基因的载体为所述ΖΥ781. bpA微环DNA母质 粒经过位点特异性重组生产出微环DNA载体。
[0158] 如在本发明一个实施例中，以LDLR cDNA，以及含有SRE的LDLR启动子为模板， 以引物 LDLR1(SEQ ID N0:7)、LDLR2(SEQ ID N0:8)、LDLR3(SEQ ID N0:9)、LDLR4(SEQ ID NO: 10)为重叠 PCR的引物，将重叠 PCR后得到的片段通过Spel和Sail双酶切连接到 ZY781. bpA上，得到了所述调节性表达目的基因的载体，命名为ZY781. PLDLR. LDLR. bpA。
[0159] 在本发明一个优选的实施例中，所述LDLR cDNA的核苷酸序列为GenBank登录号 为NM_000527. 4所示核苷酸序列的188~2770bp。
[0160] 在本发明一个优选的实施例中，所述SRE的核苷酸序列为GenBank登录号为 NM_000527. 4所示核苷酸序列的1~187bp。
[0161] 在本发明一个优选的实施例中，所述SRE的核苷酸序列为GenBank登录号为 NG_009060. 1所示核苷酸序列的4983~5169bp。
[0162] 在本发明一个优选的实施例中，所述LDLR启动子的核苷酸序列为GenBank登录号 为NG_009060. 1所示核苷酸序列的3170~4982bp。
[0163] 优选地，如在本发明一个实施例中，利用本发明实施例提供的ZY781. PLDLR. LDLR. bpA微环DNA母质粒制备了微环DNA载体。所述ZY781. bpA微环DNA母质粒载体上的attB 位点和attP位点在Φ031重组酶的作用下进行重组，使得微环母质粒非可逆地产生含有 attL位点的质粒骨架DNA环和含attR位点的微环DNA。所述骨架DNA含有I-Scel内切酶 的酶切位点。所述骨架DNA被I-Scel内切酶酶切为线性DNA，继而被宿主菌中的DNA酶降 解，有利于微环DNA的分离提纯。
[0164] 本发明提供的调节性表达目的基因的载体同时具有肝特异性启动子和胆固醇调 节元件SRE两种调控元件，其中，肝脏是胆固醇代谢的重要器官，肝特异性启动子有利于调 节性表达目的基因的载体的组织特异性表达，提高基因治疗的靶向性；此外，本发明采用的 胆固醇调节元件SRE能充分利用细胞天然的胆固醇反馈调节机制，增强了细胞主动、合适 地对胆固醇的代谢进行调节的内在能力，当胞内胆固醇水平高时，细胞通过反馈调节途径 的调节作用，降低胆固醇的合成和代谢水平，细胞对LDL的代谢能力降低，细胞表现为LDLR 基因表达的下调；反之，当胞内胆固醇水平低时，细胞表现为LDLR基因表达的上调。
[0165] 本发明提供的调节性表达目的基因的载体优选地还具有肝特异性定位控制元件 HCR和Kozak序列2种调控元件中的至少一种。
[0166] 本发明提供的调节性表达目的基因的载体的启动子优选地还具有为PLDLR启动 子和PApoE启动子中的一种。
[0167] 本领域技术人员可根据具体需要选择合适的SRE、HCR、Kozak和启动子组合，本发 明优选为如下组合中的一种：
[0168] 1)同时具有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE两种调控元件；
[0169] 2)同时含有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、Kozak序列三种调控元件；
[0170] 3)同时含有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、肝特异性定位控制元件HCR三种 调控元件；
[0171] 4)同时具有PLDLR启动子、胆固醇调节元件SRE、肝特异性定位控制元件HCR、 Kozak序列四种调控元件。
[0172] 第二方面，本发明提供了一种调节性表达目的基因的载体的制备方法，包括：
[0173] 将肝特异性启动子、胆固醇调节元件和目的基因插入载体的多克隆位点，得到所 述调节性表达目的基因的载体，所述调节性表达目的基因的载体包含目的基因表达盒，所 述目的基因表达盒包含：肝特异性启动子、胆固醇调节元件和目的基因，所述胆固醇调节元 件、肝特异性启动子与目的基因可操作地连接。
[0174] 如本文所用，"载体"是指在基因工程研究中，可以插入外源DNA并能在受体细胞中 复制的结构。
[0175] 优选地，所述载体为病毒载体、原核质粒载体或真核质粒载体。
[0176] 优选地，所述目的基因表达盒插入所述载体的多克隆位点。
[0177] 优选地，所述目的基因为蛋白质的编码基因或小分子RNA的编码基因。
[0178] 进一步优选地，所述蛋白质的编码基因包括但不限于细胞受体、信号分子、调控因 子、抗原或抗体基因。
[0179] 如本文所用，"细胞受体"优选为细胞膜上或细胞内的受体，该受体能特异性结合 靶标分子，如本发明一实施例中采用的LDLr。
[0180] 如本文所用，"信号分子"为能特异性结合细胞膜上或细胞内受体，且引发、影响或 调节相应的信号通路的多肽或蛋白质。
[0181] 如本文所用，"调控因子"为能特异性调节细胞内转录、翻译、代谢等活动的分子。
[0182] 如本文所用，"抗原"或"抗体"包括但不限于天然的、重组的抗体、抗原或抗原表 位。
[0183] 如本文所用，"抗原"或抗体"包括但不限于人源或鼠源抗体。
[0184] 如本文所用，"抗体"包括但不限于治疗性的抗体。
[0185] 如本文所用，"抗体"可以为单靶向、双靶向或多靶向抗体。
[0186] 如本文所用，"靶向"是指抗体特异性地结合抗原，"双靶向"是指抗体具有两个与 抗原特异性结合的位点，"多靶向"是指抗体具有两个以上的与抗原特异性结合的位点。
[0187] 进一步优选地，"小分子RNA的编码基因"包括但不限于可以转录siRNA、shRNA、 dsRNA或miRNA的基因。
[0188] 优选地，所述目的基因为参与胆固醇合成途径的酶的编码基因或受体蛋白的编码 基因。
[0189] 优选地，所述目的基因为小分子RNA的编码基因，所述小分子RNA的编码基因能特 异性沉默参与胆固醇合成途径的酶的编码基因或受体蛋白的编码基因的表达。
[0190] 优选地，所述目的基因为参与脂肪酸合成途径的酶的编码基因或受体蛋白的编码 基因。
[0191] 优选地，所述目的基因为小分子RNA的编码基因，所述小分子RNA的编码基因能特 异性沉默参与脂肪酸合成途径的酶的编码基因或受体蛋白的编码基因的表达。
[0192] 优选地，所述目的基因为LDLR基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase，HMGCS)基因或 3_ 羟基 _3_ 甲基戊 二醜辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3_methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR)基因。
[0193] 进一步优选地，所述LDLR基因的GenBank登录号为NM_000527. 4。
[0194] 进一步优选地，所述HMGCS基因的GenBank登录号为NM_002130. 7。
[0195] 进一步优选地，所述HMGCR基因的GenBank登录号为NM_000859. 2。
[0196] 上述的 GenBank 登录号 NM_000527. 4、NM_002130. 7 和 NM_000859. 2 所示的核苷酸 序列分别包括LDLR基因、HMGCS基因和HMGCR基因的核苷酸序列。
[0197] 优选地，所述目的基因包括但不限于本文所例举的LDLR基因、HMGCS基因或HMGCR 基因。
[0198] 优选地，所述目的基因包括与登录号为NM_000527. 4所示核苷酸序列中LDLR 基因的核苷酸序列的同源性>95% (较佳地> 98% )，且编码的氨基酸序列与登录号为 NM_000527. 4所示核苷酸序列中LDLR基因的编码的氨基酸序列相同或基本相同的基因序 列。
[0199] 优选地，所述目的基因包括与登录号为NM_002130. 7所示核苷酸序列中HMGCS基 因的序列的同源性>95% (较佳地彡98% )，且编码的氨基酸序列与登录号为NM_002130. 7 所示核苷酸序列中HMGCS基因的编码的氨基酸序列相同或基本相同的基因序列。
[0200] 优选地，所述目的基因包括与登录号为NM_000859. 2所示核苷酸序列中HMGCR基 因的序列的同源性>95% (较佳地彡98% )，且编码的氨基酸序列与登录号为NM_000859. 2 所示核苷酸序列中HMGCR基因的编码的氨基酸序列相同或基本相同的基因序列。
[0201] 优选地，所述肝特异性启动子为人源肝特异性启动子。
[0202] 优选地，所述肝特异性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α -I-抗胰蛋白 酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α -甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II 启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结 合球蛋白启动子、HCR-ApOCII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的 增强子元件结合的AAT启动子、载脂蛋白E启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动 子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白Η启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素 运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及0_纤维蛋白原的启动子、α-Ι-抗糜蛋白酶启动子、 a -2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、 补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及a-ι-酸性糖蛋白启动子。
[0203] 具体地，所述的启动子中，部分中英文对照为：
[0204] 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子：PEPCK启动子）；α -I-抗胰蛋白酶启动子：ΑΑΤ 启动子；胰岛素样生长因子2 :IGF-II启动子；因子VIII启动子：FVIII)启动子；HBV基础 核心蛋白启动子：BCP启动子；HBV前s2蛋白启动子：PreS2启动子；甲状腺素-结合球蛋 白启动子：TBG启动子；肝脏控制区域-ApOCII的杂合启动子：HCR-ApOCII的杂合启动子； 肝脏控制区域-人抗胰蛋白酶启动子：HCR-hAAT杂合启动子；卵磷脂-胆固醇酰基转移酶 启动子：LCAT启动子；载脂蛋白Η启动子：ApoH启动子；甲状腺素-结合球蛋白启动子：TBG 启动子；甲状腺素-结合球蛋白启动子：TBG启动子。
[0205]