专利名称：一种检测K562单细胞表达p16基因的方法
技术领域：
本发明属生物医药领域，涉及肿瘤相关基因的检测方法，尤其涉及利用PCR技术检测基因表达的方法。
背景技术：
在人类基因组测序工作完成后，生命科学的研究已从基因序列分析进入功能基因组学的研究。从分子水平探讨细胞内各种蛋白质的产生及其对基因转录、调控的作用，揭示特定基因表达与人体生长、发育、衰老的关系，揭示特定基因缺失或异常表达与疾病发生之间的关系，成为生物、医学领域研究的热点。
P16基因是重要的抗癌基因，定位于9p21上，全长8.5kb，由2个内含子间隔3个外显子组成，编码产物是16KD的蛋白。P16是细胞周期蛋白依赖性激酶——CDK4的抑制因子，参与细胞周期的调节，与肿瘤的发生有着密切的关系。当P16基因正常表达时，可以抑制Cdk4活性，最终阻止细胞进入S期。一旦P16基因因缺失，突变等原因导致功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。
P16基因在多种恶性肿瘤中有较高的失活率，失活的主要方式为基因缺失、点突变、移码、基因重排及甲基化等。p16基因纯合缺失常见于各种肿瘤，例如，食道癌约为92.3％，急性淋巴细胞性白血病(ALL)中约为40％，间皮瘤61.9％，胰腺癌40.5％，卵巢癌22％。P16基因突变与肿瘤的发生也有着密切的关系，在肺癌、黑色素瘤等肿瘤中，都存在p16基因突变，包括无义突变，错义突变，剪接供体位点突变等。
P16基因参与了各种组织的肿瘤形成，因此检测P16基因的突变与缺失，研究P16基因异常与肿瘤的分期、分级的相关性，对肿瘤临床治疗有重要意义。同样，通过检测P16基因表达，筛选可以激活P16基因的药物，在抗肿瘤药物开发中具有重要意义。许多荣等在《临床研究》1999；vol 18(4)，上，探讨了p16基因纯合缺失与急性淋巴细胞白血病的关系及其临床意义，采用PCR方法检测P16基因的有无；芮红兵在《中国实验血液学研究》2002；10(5)研究了野生型P16和P53抑癌基因共转染对K562细胞增殖的抑制作用，采用RT-PCR方法检测了P16基因的表达。
然而，通常采用的PCR方法，检测的对象是组织或多个细胞，采用的模板是从组织或多个细胞制备的DNA或RNA，在检测的灵敏度、特异性等方面均有缺陷，尤其是，检测结果不能反映各细胞之间的差异。
本领域迫切需要准确、灵敏，能够检测单个细胞P16基因的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测K562单细胞表达p16基因的方法，以克服现有技术存在的上述不足；本发明的方法包括如下步骤采用极限稀释法(limiting dilution)制备单细胞悬液，将含有单个细胞的悬液置于PCR管中；加入细胞裂解液裂解细胞；裂解后加入扩增p16全长基因的引物和RT-PCR试剂；进行RT-PCR扩增；扩增产物进行测序；扩增产物进行凝胶电泳。
用于检测p16基因表达的引物序列为上游引物GAATTCGGCGGTGAGGGGG下游引物GGATCCCTGAGGGACCTTC在本发明的一个优选的方案中采用极限稀释法(limiting dilution)制备单细胞悬液，将含有单个细胞的悬液置于PCR管中；加入细胞裂解液，冰浴中处理5min；裂解后加入p16特异性扩增引物和RT-PCR试剂；37℃逆转录1小时，94℃预变性5分钟，再以93℃30s，55℃30S，72℃50S，35个循环，循环结束后延伸8min；扩增产物进行凝胶电泳检测。
本发明的有益效果主要表现在本发明的方法能够检测单一细胞p16基因及其特异性表达情况。
RT-PCR扩增中mRNA模板的制备是一项技术性很强的工作，在抽提工作中，容易造成模板降解，导致实验失败。本发明通过单细胞原位基因扩增，避免模板降解所致的问题。与多细胞RT-PCR方法相比，本发明的方法具有更好的灵敏度。
图1、PCR扩增管中的单细胞和多细胞图(左为单细胞100X，中为多细胞100X，右为1μl细胞悬液40X)。
图2、p16基因表达的时间-效应图。
图3为p16电泳LightFrame分析图。
具体实施例方式
实施例1、K562白血病细胞的ABPS诱导培养凋亡基因的诱导取对数增殖期的K562白血病细胞系(上海细胞所细胞库购进)细胞，计数并将5×105/ml的细胞、10％胎牛血清(Fetus Cattle Serum，FCS，Gibco.lot.No.1165723)RPMI1640(Gibco)培养液和已知具有诱导凋亡基因表达的巴西蘑菇多糖(Agaricus Blazei Polysaccharide，ABPS)10μg/ml充分混匀后，加于96孔培养板(costar)中，每孔100μl，设8个复孔。样品制好后，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。进行诱导p16基因表达。
实施例2、单细胞RT-PCR检测单个细胞的获得实施例1诱导培养的细胞，采用极限释释法分别于诱导基因表达的24h、48h、72h和96h时，取出培养的细胞进行p16基因的检测。制备单细胞时，先将实验孔细胞在无菌条件下取出，加于细胞计数板中，计数，视细胞量，用PBS将细胞稀释至约103/ml，然后取出1μl细胞悬液，加于0.2ml的PCR管中，倒置光显微镜下观察，选择细胞形态完整的单个细胞进行RT-PCR。见图1。(左为单细胞100X，中为多细胞100X，右为1μl细胞悬液40X)。
RT-PCR在PCR管中加入细胞裂解液
[2]，离心，置冰浴中静置处理细胞5min，然后4℃12000r/min离心5min，旋即移至超净工作台中，加入p16基因特异性扩增药物，按华美公司酶混合物试剂盒说明分别加入RT-PCR的各种试剂，离心，PCR仪进行基因扩增。扩增条件为37℃逆转录1小时，94℃预变性5分钟，再以93℃30s 55℃30S，72℃50S循环扩增35次，最后终延伸8min。
扩增结果进行凝胶电泳，结果见图2。
第1泳道为marker，2，4，6，8为单细胞-时效PCR扩增条带，分别为ABPS诱导后24h，48h，72h和96h的扩增结果；3，5，7，9为多细胞时-效PCR扩增的条带，分别为ABPS诱导后24h，48h，72h和96h的扩增结果。
p16基因在诱导的24时小就有表达，72小时表达达到高峰，96小时下降。
实施例3、多细胞RT-PCR检测实施例1诱导培养的细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度到1.5*105/ml细胞作为多细胞对照组。常规方法制备mRNA模板......
在PCR管中加入模板1ul，按实施例2的方法进行RT-PCR扩增。凝胶电泳检测，结果图2。
1泳道为marker，2，4，6，8为单细胞-时效PCR扩增条带，分别为ABPS诱导后24h，48h，72h和96h的扩增结果；3，5，7，9为多细胞时-效PCR扩增的条带，分别为ABPS诱导后24h，48h，72h和96h的扩增结果。
p16基因在诱导的24时小就有表达，72小时表达达到高峰，96小时下降。
p16电泳LightFrame分析见图3。
权利要求
1.一种检测K562单细胞表达p16基因的方法，其特征在于，包括如下步骤采用极限稀释法制备单细胞悬液，将含有单个细胞的悬液置于PCR管中；加入细胞裂解液裂解细胞；裂解后加入p16特异性扩增引物和RT-PCR试剂；进行RT-PCR扩增；扩增产物进行凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的p16基因特异性引物为上游引物GAA TTC GGC GGT GAG GGG G下游引物GGA TCC CTG AGG GAC CTT C。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤采用极限稀释法制备单细胞悬液，将含有单个细胞的悬液置于PCR管中；加入细胞裂解液，冰浴中处理5min；裂解后加入p16特异性扩增引物和RT-PCR试剂；RT-PCR扩增37℃逆转录1小时，94℃预变性5分钟，再以93℃30s，55℃30S，72℃50S，35个循环，循环结束后延伸8分钟；扩增产物进行凝胶电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测K562单细胞表达p16基因表达的方法，包括如下步骤采用极限稀释法制备单细胞悬液，将含有单个细胞的悬液置于PCR管中；加入细胞裂解液裂解细胞；裂解后加入扩增p16全长基因的引物和RT－PCR试剂；进行RT－PCR扩增；扩增产物进行测序；扩增产物进行凝胶电泳。本发明通过单细胞原位基因扩增，避免模板降解所致的问题。与多细胞RT－PCR方法相比，本发明的方法具有更好的灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK1861806SQ200510025810
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月13日 优先权日2005年5月13日
发明者李兴玉, 李静, 丁焕平, 忻茜 申请人:上海师范大学