专利名称：巴士德毕赤酵母gs115/pfk－k5的高密度发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种毕赤酵母的发酵方法。特别是一种巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法。
背景技术：
甲醇毕赤酵母Pichia pastoris表达系统是继酿酒酵母之后的第二代酵母表达系统，既具有原核表达系统操作简单、表达高效、易于调控等特点，还具有真核细胞特有的蛋白质修饰功能，在表达真核生物蛋白质方面具有独特优越性。P.pastoris是一种嗜甲基酵母，可以在以甲酵为惟一碳源和能源的培养基中快速生长。甲醇毕赤酵母代谢的第一步是氧化甲醇形成甲醛，这一步是由醇氧化酶(alcohol oxidase，Aox)催化的，反应过程中产生过氧化氢。为了避免过氧化氢的毒性，这个反应是在被称为过氧化物酶体(peroxisomes)的特定细胞器内进行的。过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶，如AOX、二羟丙酮合酶(dihydroxy acetone synthase，DHAS)和过氧化氢酶(catalase)等。只有当细胞在甲醇培养基上生长时甲醇代谢所需要的酶才大量存在。而在利用其他碳源(如葡萄糖、甘油或乙醇)生长时，检测不到达两个酶的活性，菌体中也只有一个或几个很小的过氧化物酶体。在甲醇流加培养时，AOX水平急剧上升，可达细胞可溶性蛋白的30％以上。现在采用的策略是将外源基因替换AOX1基因，且实验表明这种替换所产生的转化子是最稳定的。AOX1的合成是在转录水平上调空的，其基因启动子具有明显的调空功能，可用于调空外源基因的表达。此调空作用是由碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的，即外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即可被诱导表达。
发明目的本发明的目的在于提供一种巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，使巴士德毕赤酵母在发酵过程中，大幅度提高菌体量和外源蛋白表达量。
为了达到以上发明目的，本发明的技术构思是甲醇毕赤酵母表达系统可分为细胞营养生长和外源蛋白表达二个阶段，前一阶段可实现高密度发酵，后一阶段便于优化表达条件。影响毕赤酵母表达外源蛋白表达量的因素主要有①启动子的影响；②外源基因自身的影响；③外源基因拷贝数的影响；④菌株遗传背景的影响；⑤蛋白质分泌的影响因素；⑥影响蛋白质稳定性的因素；⑦对重组转化子的筛选；⑧发酵条件的影响。
由于毕赤酵母GS115/PFK-K5是组氨酸缺陷型菌株，为了达到高密度发酵的要求，因此在菌体生长阶段添加组氨酸是必要的，同时在诱导表达阶段添加一定量的组氨酸能提高外源蛋白的表达量。
根据上述的技术构思，本发明采用如下技术方案本发明的巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，其特征在于该方法，包括以下步骤(1)巴士德毕赤酵母种子的培养、接种前准备及接种；(2)补料生长阶段该阶段包括补加甘油和组氨酸，A.补加甘油在发酵罐发酵过程中甘油耗尽时，即溶氧水平DO陡然上升时，开始补加含PTM112ml/L的50％甘油；如此反复直到菌体湿重量达到180～220g/L；B.补加组氨酸在发酵罐发酵过程中，当溶氧水平DO开始缓慢上升时，添加浓度为5～12％组氨酸溶液至发酵液终浓度0.01～1％；(3)甲醇诱导表达PFK-K5在补料生长阶段结束，即当菌体湿重达到180～220g/L时，停止补加甘油，当甘油彻底耗尽后，开始甲醇诱导，首次补加含PTM112ml/L的甲醇，同时添加5～12％组氨酸至使发酵液终浓度达到0.01～0.5％，待甲醇耗尽后，再次补加含PTM112ml/L的甲醇，如此诱导表达36～60小时后结束发酵；(4)巴士德毕赤酵母表达产物的分离提取。
上述的种子培养步骤为从YPD上挑2-3个菌落到含50μg/ml的Zeocin的BMGY的一级种子培养基中培养，至菌体OD600达到1.0，得到培养液；再取上述培养液到二级种子培养基BMGY中培养，至菌体OD600达到7.0，即得巴士德毕赤酵母种子。
上述的种前准备及接种过程为将酵母膏，蛋白胨溶解于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，经灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0％；再加入1M磷酸钾缓冲液，10×YNB，500×Biotin，50％甘油，PTM1；在火焰圈保护下，以10％的接种量将巴士德毕赤酵母种子接种于上述的发酵罐中，控制pH6.0±0.05，调节转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100％。
上述的分离提取过程为在结束发酵后，发酵液经离心得发酵上清液，该上清液经硫酸铵沉淀、Sephadex G25脱盐、Sepharose 4B-Lys亲和层析，再经生理盐水透析，然后用PEG20000浓缩，再用生理盐水透析，即可得到巴士德毕赤酵母高密度发酵的产物PFK-K5。
采用本发明的巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵法，使巴士德毕赤酵母的菌体量和外源蛋白表达量均有大幅度提高。
图1为补料生长阶段添加组氨酸与未添加组氨酸的菌体生长情况比较2为甲醇诱导表达阶段同时添加组氨酸和不添加组氨酸的菌体生长和蛋白表达情况比较图。
具体实施例方式实例一巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5高密度发酵法巴士德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/PFK-K5，遗传表型Mut-his-，启动子为PAOX1，载体为pPICZαA，外源基因为Angiostatin的Kringle1基因、Kringle5基因和PF4 C端的13个氨基酸对应DNA序列相拼接，载体呈线性整合在染色体上，该菌株为本实验室构建。
①种子培养从YPD上挑2-3个菌落到一级种子培养基(300ml三角瓶装30ml含50μg/ml的Zeocin的BMGY)中培养18小时左右，菌体OD600达到1.0。再取2ml培养液到二级种子培养基(10只500ml三角瓶装50ml BMGY)中培养18小时左右，菌体OD600达到7.0。
②种前准备洗净发酵罐，组装好温度、pH(已校正)和泡沫传感器，称取50g酵母膏，100g蛋白胨溶解于3750ml水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，121℃15min灭菌，灭菌过程中校正溶解氧0％，接好空气过滤器。冷却后接好其他附属设备。加入1M磷酸钾缓冲液500ml，10×YNB 500ml，500×Biotin 10ml，50％甘油250ml，PTM124ml。
③接种在火焰圈保护下，以10％的接种量将种子接种于12.8L自动控制发酵罐中，装液量5.5L，通风量3L/min，搅拌转速为330r/min，培养温度30℃，自动流加氨水控制pH6.0±0.05。调节好转速、空气流量、罐压后(0.4个大气压)，校正溶氧100％。(本文所指的溶氧(DO)为相对溶氧水平，即将培养基刚接种时的饱和溶氧水平设定为100％，发酵过程显示的溶氧水平为相对于饱和溶氧的数值。)④补料生长阶段菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期，此时pH自动控制，自动流加氨水将pH控制在6.0，调节转速、通气量、罐压来维持DO在20％以上。
A补加甘油当发酵罐中的甘油耗尽后(约接种后11小时)，DO陡然上升，经检测甘油已耗尽，开始补加50％甘油(含PTM112ml/L)50ml。当甘油耗尽后，再补加50％甘油(含PTM112ml/L)50ml，重复此操作直到菌体量达到预定要求(本实验菌体湿重为210g/L)为止。
B补加组氨酸在接种后12小时时，溶解氧缓慢上升，说明菌体生长已受限制。氮源由调节pH值的氨水自动流加，作为碳源的甘油经检测并未耗尽，因此此时组氨酸可能已耗尽，成为菌体生长的限制因素。添加5％组氨酸至终浓度0.1％。
图1表明，添加组氨酸后，菌体在12-16小时生长非常迅速，湿重从65g/L增加到210g/L。而没有添加组氨酸时，菌体生长非常缓慢，菌体湿重仅仅从65g/L增加到84g/L。添加组氨酸后培养4小时的菌体湿重增加量是未添加组氨酸的7.6倍。16-17小时期间由于甘油已基本耗尽，因此菌体量都没有明显增加。
因此，在发酵罐补料-分批发酵过程中添加组氨酸可以大幅度提高菌体量，以实现高密度发酵。
⑤甲醇诱导表达PFK-K5阶段当细胞湿重达到预定值(本实验为210g/L)时，停止补加甘油，维持饥饿状态30分钟，让甘油彻底耗尽。然后开始甲醇诱导，首次补加甲醇(含PTM112ml/L)25ml，菌体适应甲醇后，可每次补加50ml甲醇。在首次添加甲醇时同时添加5％组氨酸至使发酵液终浓度达到0.05％。
图2表明，诱导表达阶段添加组氨酸后，菌体量有较大幅度的增加，而未添加组氨酸时，菌体量只有少量增加。添加组氨酸后诱导48h时PFK-K5的表达量(275mg/L)比不添加组氨酸时PFK-K5的表达量(220mg/L)高25％。
因此在诱导表达前添加0.05％的组氨酸可以提高PFK-K5的表达量。
⑥PFK-K5的分离提取诱导表达48h后结束发酵，发酵液经4000r/min，10min离心得4.4L发酵上清液。
A 硫酸铵沉淀向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵的最终饱和度达到55％，静置24h后10000r/min×10min离心，收集到57g沉淀。PFK-K5回收率为92.5％。
B Sephadex G25脱盐取1.3g硫酸铵盐析后的沉淀(相当于100ml发酵液沉淀后得到的沉淀)溶解于10ml 0.02M pH8.0磷酸钠缓冲液，用Sephadex G25凝胶层析脱盐。总蛋白回收率为87.6％，PFK-K5回收率为93.3％。
C Sepharose 4B-Lys亲和层析脱盐后的样品与用平衡缓冲液(0.02mol/L，pH8.0磷酸钠缓冲液)平衡过的Sepharose 4B-Lys亲和柱混合，在万向摇床是振荡过夜。反应好的混合物装于1.6/30cm层析柱后用75ml平衡缓冲液洗涤至基线。改用100ml 0.5M的NaCl(平衡缓冲液配置)洗涤至基线。再用50ml平衡缓冲液洗涤。然后用用0.2M的六氨基己酸(平衡缓冲液配置)洗脱。控制流速约0.4-0.6ml/min。核酸蛋白检测仪读数开始迅速上升时开始收集流出液，共收集18ml液体。
将收集液用生理盐水透析24小时(换液3次)，然后用PEG20000浓缩至4ml，再用生理盐水透析1小时。测定蛋白浓度，共得到6.05mg PFK-K5，其纯度为94.1％，总回收率为22％。
权利要求
1.巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，其特征在于该方法，包括以下步骤(1)种子的培养、接种前准备及接种；(2)补料生长阶段该阶段包括补加甘油和组氨酸A.补加甘油在发酵罐发酵过程中甘油耗尽时，即溶氧水平DO陡然上升时，开始补加含PTM112ml/L的50％甘油；如此反复直到菌体湿重量达到180～220g/L；B.补加组氨酸在发酵罐发酵过程中，当溶氧水平DO开始缓慢上升时，添加浓度为5～12％组氨酸溶液至发酵液终浓度0.01～1％；(3)甲醇诱导表达阶段在补料生长阶段结束，即菌体湿重达到180～220g/L，停止补加甘油，甘油彻底耗尽后，开始补加含PTM112ml/L的甲醇诱导表达PFK-K5，同时添加5～12％组氨酸至使发酵液终浓度达到0.01～0.5％，待甲醇耗尽后，再次补加甲醇，如此诱导表达36～60小时后结束发酵；(4)表达产物的分离提取。
2.根据权利要求1所述的巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，其中所述的种子培养步骤为从YPD上挑2-3个菌落到含50μg/ml的Zeocin的BMGY的一级种子培养基中培养至菌体OD600达到1.0，得到培养液；再取上述培养液到二级种子培养基BMGY中培养至菌体OD600达到7.0，即得发酵种子液。
3.根据权利要求1所述的巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，其中所述的种前准备及接种过程为将酵母膏，蛋白胨溶解于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0％；再加入1M磷酸钾缓冲液，10×YNB，500×Biotin，50％甘油，PTM1；在火焰圈保护下，以10％的接种量将巴士德毕赤酵母种子接种于上述发酵罐中，培养温度30℃，控制pH6.0±0.05。调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100％。
4.根据权利要求1所述的巴士德毕赤酵母GS115/PFK-K5的高密度发酵方法，其中所述的分离提取过程为在结束发酵后，发酵液经离心得发酵上清液，该上清液经硫酸铵沉淀、Sephadex G25脱盐、Sepharose 4B-Lys亲和层析，即可得到高密度发酵的产物PFK-K5。
全文摘要
本发明涉及一种巴士德毕赤酵母GS115/PFK－K5的高密度发酵方法。本发明方法包括以下步骤种子的培养、接种前准备及接种；补料生长阶段该阶段包括补加甘油和组氨酸；甲醇诱导巴士德毕赤酵母表达PFK－K5在补料生长阶段结束，即当菌体湿重达到180～220g/L时，停止补加甘油，当甘油彻底耗尽后，开始甲醇诱导，首次补加含PTM
文档编号C12N1/19GK1699550SQ20051002586
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月17日 优先权日2005年5月17日
发明者陈宇光, 余波 申请人:上海大学