检测apec、upec毒力基因表达水平的dna芯片及其构建方法

专利名称：：检测apec、upec毒力基因表达水平的dna芯片及其构建方法
技术领域：
：本发明涉及禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的研究，属于人兽共患病
技术领域：
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背景技术：
：禽大肠杆菌病(AvianColibacilbsis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(AvianPathogenic^yc/^n'c/z/aco//，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。APEC感染相关的毒力因子己被相继报道，但是其发病机理尚未完全清楚。APEC和人尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic&c/zen'c/z/aco/z'，UPEC)均能引起肠道外感染，可能与它们的毒力特性有关，如黏附素，铁获得系统，毒素，保护素和侵袭素等，这些毒力特性使它们能够在宿主环境中生存进而产生疾病。很多研究证明，APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。但APEC的毒力基因是否人类UPEC毒力基因来源，或反过来，人类UPEC毒力基因是否APEC毒力基因的来源，更是我们关注的问题。了解APEC、UPEC这些毒力基因在相同条件下的表达情况可为APEC、UPEC是否互为对方毒力基因贮库这一问题提供依据。基因芯片技术是近年来发展起来并逐渐完善的一种微型化、集成化、平行化和高通量的基因分析新技术。基因芯片技术的应用已不局限于最初的DNA序列测定，现已在基因表达分析、基因突变及多态性分析、药物及毒物基因组学等多个领域显示出重大的理论意义和实际应用价值，具有广阔的前景。自Stanford大学的SchenaM等首次发表了用DNA微阵列研究基因表达的论文后，基因芯片正越来越多地应用于基因表达的研究。
发明内容本发明的目的在于发明一种可同时对APEC、UPEC毒力基因表达水平实行检测的DNA芯片。本发明是主要由154个靶基因探针组成的DNA芯片。其中97个基因片段扩增自大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因，44个基因片段扩增自用SSH方法获得的APEC特异性基因，13个基因片段扩增自用SCOTS方法获得的APEC特异性基因。本发明应用APEC、UPEC已知的毒力基因、耐药基因及通过SSH、SCOTS方法获得的APEC特异的潜在毒力基因作为探针，构建APEC、UPEC毒力基因表达芯片。通过对APECE058株和UPECHEC4株体内、外毒力因子表达水平的检测结果表明，该基因芯片具有高通量、微型化、集成化和平行化的优点。本发明之基因芯片可对APEC、UPEC在体内、外培养条件下的毒力基因的表达水平进行检测。本发明所述97个基因片段是,mC、^m//、^7、z'ra7V、；>/2、#^4、&^f、C5g丄popC、々L4、y^c丄cvaC、z'm、/mcCD、、6woE、c"/7、c/m丄/;/j^4、/mL4、s/L4、^/仏戶pG/Z、戸/G77/、/w丄々cG、ma/X、q/k6C、^DE"、、/-ecj、m<i/2、M5pj、se/丄、々/C、Wx、e/uc/4、esp尸、///c、Z/za、rir、eae、/er、Mx7、Wx2、戸a、A:a/P、wewC、,Z)、toxB、tog/4、ce《r、戸s、es/^、ct/L4、e"W、妳丄"/、咖/、s/2e丄_per^、es/S、owp丄^eG、^b;wC、/os丄/仏/77"、加、i愈2eS、teM、滅、WG、6/<3顶,7、w仏a蕴7、c附/丄w/(i丄yz"、；^'a丄*08、她rZW丄所述44个基因片段是ecs-7、ecs-(5、ecs扁7、ecs-S、ecs-9、ecs-/(9、W、ecs—72、ec5-73、ecs-74、ecs-75、ecs-7(5、ec5-77、aes-7、aes-2、aes—_3、aes-4、aes-5、aes-(5、7、aes-8、aes-9、aes-_/0、aes-仏aes-J2、aes-73、aes-"、aes-75、aas1-7(5、77、aes-_/8、aes-79、aes-20、aas-27、aes-22、aes-23、<aas-24、aas-25、aas1-27、"as-2<§、aes-29、aas-邓、aes-37、aes-32。所述13个基因片段是aec-S、、aec-73、aec-"、aec"S、aec-26、aec'-2丰、aec-25、aec-2(5、<aec-27、aec-29、aec-30、aec-37。本发明的第二个目的在于发明一种上述基因芯片的构建方法先通过PCR方法分别扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArrayTMmicroarrayer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建成检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片。扩增所述97个基因片段/^wC、^m//、to/2、/ra7V、f^2、》mj、A戸M、t^g丄/opC、、力c丄cvaC、/仏/mc'CD、/2/_y￡、c"/7、c/zw丄/2(y丄/mL4、w,L4、折仏戸/G//、戶/GZ/Z、/re丄/bcG、waZX、t^6C、s^xDE1、gyrS、rec/4、mtZ/、M5pj、se/丄、y^/C、Wx、e/zx/i、、Wz'c、z7za、rir、eae、/er、Wx7、Mx2、^五、戶a、to尸、wewC、邵Z)、tox6、tog/1、ces!T、戶s、e5p丄cofc4、east、妳丄cz/、咖/、s/2e丄/er丄om/丄^eG、y^wC、/^w爿、/仏/77a-丄//1、血、W、虑2e仏故丄滅、tefG、Wa7EAf-/、，62、a磁八5m/Z、sw/i/、a必J2、欣,jS、《(3c、/wf-/、ca"、/Za^、aac(3」-/K、ap/zf3」-7a、cwM、WW、、"'a』、/eoS、JforDAM的弓1物分别是—C:CGTCAATGTAAGGAAATCGCAGG禾口GGCATTCAACTCTGTTACCGTC;—/f:ATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTG禾口TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC;fe/z:TTATTCTCTTCGCTACAG和GATGACAGGCTACCGACAG;/raiV:TCCTGGTTGGGTTGAATA和CAGCCAGAGGCCCACTA;加^:—MGCGCATTTGCTGATACTGTTG和CATCCAGACGATAAGCATGAGCA;:ACTCTGACTTGACTATTACC禾口AGATGCAGTCTGGTCAAC;GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG和ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA;/eL4:GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG和GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC;，C:CACACACAAACGGGAGCTGTT禾口CTTCCCGCAGCATAGTTCCAT;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>欲2:TATCTCAGGGGACCACATCGG和ACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT;戸a:yto尸GTCGCTGAAAGAGCAGGTTA禾口TACTCCATCGTGTTGACATATCC;邵Z):GGGACTGGTGATGAGGTTG和CCACTAAATCCTTCGCCTTC;tox6:GGCAAAATACACCTTCCTC禾口CATTAGGGGCGATGTTTAC;啤j:TGAGAGATGGAGAACACCG和GAATAGAACTCCCGCTGG;c^r:GCTTTTATTAGATAGATTTGC和ATGTTATTCCCTGATTATG;戸GCGGGAGATGTTGATACC和GATGTCTTAACGGAATACGG;—ATGTGAGTGCGAGTTCTTC和TATTCACTACCGTTGTCAGG;:CTCAAGTAGAGGGAGGACC和TCTGGCTTAACAATAGTGGC;簡f:ATCCTCATCGCCTGTGTG和CGAGTGACGGCTTTGTAG;妳j:CGTTACCGCAGGTGTGATG和CAGCAGGAGTAATAGCAGTCG;CZ/:e/a/:GATGGAACTATCCTGCCG和CATAGGTGATAACGACGAAG;Ad:GCAGATAAAACGGTAGAAG和CCCGCAGCAATAGAATAG;戸A.CACCGAATACACAATAGAATCC禾口CATTGAACTACTGACATCGCC;/aeG:CCTGGATGACTGGT和CGTAGCAATAACTTATTAC;/C:AATACAGGTACATTAACTTCAATG禾口ATCCTTCTTAGTCACTTATATG;/a":GCGCCCGCTGAAAACAA和CGGTGTACCTGCTGAACGAA;声GCTGATTGGACGGAAGGT和TTAACTATAAATAACGGTGATA/77a":GCTACGCTTGCTTATGAC和CGTGTTCGCATTAGGTTC;&TGGATTCATCATGCACCACAAGG禾口CCATTTCTCTTTTGCCTGCCATC;加_:GCGGATTGTGCTAA和AGTTAAACTTCACCTGG;fe/G:CGGTCTTATGGGTGCTCTAT和CCTTGCTTGTTACTGCTGAC;■7W-/:CAGCGGTAAGATCCTTGAGA禾口ACTCCCCGTCGTGTAGATAA;—2:GGTGTTTCCGTTCTTGATAC禾口TATTGCCTTAGGAGTTGTCG;a超7:TATCAGAGGTAGTTGGCGTCAT和GTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATT;"础2:TGTTGGTTACTGTGGCCGTA禾口GATCTCGCCTTTCACAAAGC;,:CTTCCGCCGTTGTCATAA和GCAGCGACTTCCACGATG;/W-/:CGAATGTCGTAACCGCTG和CCTTGATGTTACCCGAGAG;//a/:TATGGTGATGCTCGGCGT和TTCGTGCCACCTGAAACC;騰卩」-爪GTCTCTGACACATTCTGGCG和ATGACCGACTGGACCTTC;:GAATCGGTCCGCATTTATC和ATTGGGAAGAAGGCGTCAC;—〖"-/a:AGCGTCTCCGACCTGATG和GTATTGACCGATTCCTTGC;wz必GTCACGCCGTATGTTATTGC禾口AACTGTTCGCCCTTCACTG;:CCGAACCGCTGAAAGAAG和CAGACGCCGTAACCATAAAC;",av4:AGACGCTGCCTTCAGTAAC和GACGCTCTGAGGTGGACG;/eaB:GTGTAGGTAACTGGGCTGG和AGTGAATCTGCTTCGTTGAG;7&D亂'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG禾口AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。本发明用已知的APEC、UPEC毒力基因、耐药基因以及用SSH(suppressionsubtractivehybridization)禾口SCOTS(selectivecaptureoftranscribedsequences)方法筛选出来的APEC特异的片段为探针，构建了禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌的毒力基因表达芯片，通过芯片上设置的阳性对照和阴性对照控制芯片的质量，建立了研究禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌的毒力基因和耐药基因表达差异的DNA芯片。图1为芯片点阵的矩阵排布；图2为E058株在鸡体内及LB培:件下的芯片扫描图;图3为尿液静置培养条件下HEC4/E058芯片扫描图具体实施例方式一、禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的构建1、靶基因及引物设计分别对GenBank中收录的APEC、UPEC和部分其他大肠杆菌的毒力基因以及耐药基因的序列进行多重对位排列分析，选定各毒力基因的保守区域，用PrimerPremier5.0引物设计软件设计各靶基因的引物，引物Tm值控制在55土5。C左右，靶基因片段大小在200-900bp之间，引物设计结果见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。部分基因克隆来自于通过SSH和SCOTS方法获得的APEC特异性克隆。其中禽致病性大肠杆菌各分离株、猪源大肠杆菌TB1、C83907、107/86猪源大肠杆菌Fc株、大肠杆菌933W、人源大肠杆菌各分离株、沙门氏菌S0503、S339、S10150、S09256、S213、S5216、41/06、S5213、S5413、S9305、S5301模板、大肠杆菌DH5a均可由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室购买；菌株复苏和培养在LB液体或固体培养基37。C培养过夜。克隆载体为pGEM-TeasyVector、PCR2.1Vector,购自Invitrogen公司。混合模板见表1，PCR扩增所用各模板见表2。表l.混合模板'混合大肠杆菌分离株模板123456了89101#E058E037E1491794E120B12E235王A3E267E4622#E210BllE114E633E78E105E67新A2E123E5983#E112E653E627E158E313天A5E698E536E002E4695#E036E039E040E041E044E045E67E069E71E7810#E298E299E302E309E311E313E314E321E333E33414#E530E536E537E538E546E554E559E561E566E56723#E800西A5王A5E805王BllE807E808E809E811E81224#E814E815E816E844E855E859E860E864E865E868A09220108911327101580925611233102400983B10159091061027810600913409109098111249表2耙基因扩增所用引物、模板以及退火温度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>靶基因片段引物5'-3'模板退(，)度把段基长因度片序_(bp)'J如G广人'卿/朋C加TAACAGTGCTACGAAAGGCGGCTCTGCGAACTTCTTGCGACTGGTTAGGTCGTATGCCAACAACAGACTGAGCACGGCCTGGATGACTGGTCGTAGCAATAACTTATTACAATACAGGTACATTAACTTCAATGATCCTTCTTAGTCACTTATATGGCGCCCGCTGAAAACAACGGTGTACCTGCTGAACGAAGCTGATTGGACGGAAGGTTTAACTATAAATAACGGTGATAGTCGCTACGCTTGCTTATGACCGTGTTCGCATTAGGTTCTGGATTCATCATGCACCACAAGGCCATTTCTCTTTTGCCTGCCATCTCTTTCCCCTCTTTTAGTCAGACAGGCAGGATTACAACAAAGTGCCTATGCATCTACACAATCGCAGTGAGAAATGGACAATGGCGGATTGTGCTAAAGTTAAACTTCACCTGGCACTATGGCATTCTGCTGGCCATAGATCGCCGTGAAGAGGGCCCAGTGCTGTTGTTGTCAAGACCAAGACCCGCTAATGCGGTCTTATGGGTGCTCTATCCTTGCTTGTTACTGCTGACCAGCGGTAAGATCCTTGAGAACTCCCCGTCGTGTAGATAAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTATTGCCTTAGGAGTTGTCGTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTGTGACGGTGTTCGGCATTCTGTCTAACCCTCGGTCTCTGGCCATTTTCGGCATCGTCAACAGTTTGGCAGATGATTTCGCTGTTGGTTACTGTGGCCGTAGATCTCGCCTTTCACAAAGCAACGCCTTGCCTTCTATCTGCCCAAAGCCCACTTCACCGAC37#37#107/86C83W7987PFcC83927213421342134TBIS0503S09256S21310159S5109S1015802/98S0503S521641/06575758585957555058505859575746555351555860495618788477513768243313166283205948553900643537825357713645AF144010V00307M35945M35282M35257X14354AF022140X83966M34916M34916AB252836X00006.101830AF071555AJ6346025423DQ238104AY125351AF071555AF542061AF071555AF100173<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4SCOTS方法获得的APEC特异性潜在毒力基因的13个基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2、靶基因的扩增PCR扩增体系在总量为25pL的反应体系中加入10xPCR缓冲液(含15mmol/LMg2+)2.5pL、2.5mmol/LdNTP1.5jaL、每条引物l(iL(引物浓度为20(imol/L)、DNA模板l2iaL(O.l-lng)、TaqDNA聚合酶1.5U，加灭菌超纯水5(iL。PCR反应参数如下94°C30s，退火(各退火温度见表l)30s，72°C60s，30个循环，72。C延伸7min。3、分子生物学基本操作琼脂糖凝胶电泳、DNA目的片段的纯化回收、载体连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、亚克隆等分子生物学操作按SambrookJ，RussellDW编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版，2002年)进行。测序工作由上海联合基因科技有限公司和上海生工生物工程公司完成。4、耙基因序列分析序列分析采用DNAstar4.0序列分析软件包中多重序列对位排列分析程序进行序列比对分析，BLAST搜索评价靶基因的正确性和特异性。5、基因芯片制备以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度约为200-900bp左右。靶基因以0.5mg/mL溶解于DNASpottingSolution(Capita旧ioCorp.Beijing,China)中，PCR产物用SmartArrayTMmicroarrayer(CapitalBioCorp.Beijing,China)点样于经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括Hex作为点样阳性对照，以及酵母的8个基因序列作为外标。整个点阵分成l个亚阵亚阵有24列，21行，点间距为180fmi，点的直径约为150pm，每个样品在芯片上重复三次。玻片经水合(2h)、室温干燥(30min)、紫外线(UV)交联，再分别用0.5%SDS水洗涤后以无水乙醇浸泡(30sec)，离心干燥。如图1中，Hex为点样对照(immobilizedcontrol);Yl8为来自酵母的8个核酸序列外标；Blank(点样溶液)，为阴性对照。fimH(type1fimbriae);afaBC(afimbrialadhesion);sfa/foc(SandF1Cfimbriae);focG(F1Cfimbriae);papC,papG(Pfimbrialmajorsubunitoradhesin，respectively);bmaE(Mfimbriae);felA(fimbriaeFl1);gafD(Gfimbriaefimbriae);iha(iron-regulatedgenehomologueadhesin);sitA(S.flexneriputativeirontransportgene);iutA(aerobactinreceptor);iroN(siderophorereceptor);cvaC(colicinV);iss(increasedserumsurvival);tsh(temperaturesensitivehemagglutinin);traT(theserumsurvivalgene);kpsM(group2capsule),ireA(siderophorereceptor);feoB(ferrousironuptakegene);iucCD(aerobactinsystem);fyuA,irp2(yersiniabactinsystem);cnf1,cnf2(cytotoxicnecrotizingfactor1);cdtA(cytolethaldistendingtoxinproteinA);hlyA,hlyE(hemolysin);vat(vacuolatingautotransportertoxin);flic(H-antigentype);malX(markerforpathogenicityislandfromstrainCFT073);kfiB(K5capsulegenecluster);ibeA(invasion);leoA(labileenterotoxinoutput);ompA(outermembraneproteinA).uidA(glucuronidasereportergene);uspA(encodesauropathogenicstrain-specificprotein);mdh(malatedehydrogenase);recA(strandtransferases);chuA(haemtransporter);fhuA(outermembranereceptor);cmlA(chloramphenicolresistance);aph(3)-Ia(kanamycinresistance);aac(3)-IV(aminoglycosideresistance);floR(florfenicolresistance);catl(chloramphenicolresistance);intl(integrasinI);sheA(hemolysin);csgA(curlifibers);cdtA(cytolethaldistendingtoxin);sepL,espA,espB,espP，eae，tir，ler,tagA:paa，cesT(LEE-specificgene);ehxA(EHEChemolysinA);katP(catalase);rfbE(0157somaticantigenegene);stxl,stx2:(shigatoxin);stx2eB:(shigaliketoxin);eae(intimingene);sta,stb(heat-stabletoxin);It(heat-liabletoxin);rtx(theputativeRTXfamlyexoprotein);paa(relatedattaching-and-effacinggene);cdtA(cytolethaldistendingtoxinA);bfpA(bundleformingpili);cif(cellcycle-inhibitingfactor);efal(EHECfactorforadherence1);toxB(enterotoxinB);perA(atranscriptionalactivator);faeG(&c/ze"'c/z/aco//K88fimbrialsubunit);fanC(E.coliK99PilusFormingSubunit);F41(fimF.41a.);fasA(P987;ETEC.F6fimbrialadhesin.)。ecs-1,ecs-7,ecs-10,ecs-11,ecs-12,ecs-13,ecs-15,ecs-8,ecs-16,ecs-17，aec-11,aec-13,ecs-14，aes-2,aec-14,aec-18,aec-20,aec-24,aec-25、aec-26,aec-27,aec-29,aec-30，aec-31，ecs-6，ecs-9,aes-l，aes-4,aes-2,aes-3,aes-6，aes-5,aes-6，aes-7，aes-8,aes-9，aes-10,aes-l1，aes-l2，aes-l3,aes-14,aes-l5，aes-l6，aes-17，aes-18,aes-19，aes-20，aes-21,aes-22,aes-23，aes-24,aes-25,aes-27,aes-29,aes-32,aes-28,aes-3,aes-30,aes-31为通过SSH和SCOTS方法获得的APEC潜在毒力基因片段。二、禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的应用1、细菌在不同培养基中的培养将禽高致病性大肠杆菌E058株和UPECHEC4株分别接种于LB液体培养基、无菌的人尿液中，于37。C静置培养至对数生长期(OD60(^0.40.8)。2、E058株感染SPF鸡及样品的采集、处理接种鸡血液中APECE058株的分离和富集左胸气囊接种1日龄SPF鸡3只(108CFU/只)，5h后采血，共采血4mL，将血液低速离心(500rpm，5min)，再将上清转移至新的离心管，在室温下12000rpm离心2min，去上清，菌体沉淀于液氮中速冻10min，而后转移到-85i:冰箱中保存待用。3、细菌RNA的提取细菌在培养基中培养至对数生长中期，OD600在0.40.8之间。将培养液分装于10mL的离心管，在室温下12000rpm离心2min，然后各加入lmL室温无菌水重悬，转移到1.5mL的离心管中，在室温下12000rpm离心2min，去上清，菌体沉淀于液氮中速冻10min，而后转移到-85"C冰箱中保存待用。抽提RNA时，从-85匸冰箱中取出装有菌体沉淀的1.5mL离心管，室温溶化，先后加入400nL的TES液、400pL的水饱和酚，剧烈振荡混匀，于60-65°C的水浴中加热lh，期间每隔约10min剧烈振荡一次；离心管冰浴5min，4°C、12000rpm下离心5min;水相转移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿抽提一次，4°C、12000rpm离心5min;水相转移至一新1.5mL离心管中(约400[iL)，加入l/10体积的DEPC水配制的NaAc(3M，pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇，-20。C静置30min;4。C下12000rpm离心10min，沉淀用1mL70%乙醇洗一次，室温晾干，加入50隱100pLDEPC水，在65。C水浴加热15min充分溶解RNA沉淀。4、RNA质量检查取lpLRNA，测OD260禾flOD280，RNA样品OD260/280应在1.7-2.1之间。取约0.5吗RNA样品电泳，加入0.2mL的指形管中，补水至8pL，加入2pL5Xloadingbuffer混匀。如样品浓度过高，要进行稀释。70。C加热变性10mim，然后冰上骤冷，加入EBl(iL，离心后上样。电泳结束后，凝胶成像仪照像。RNA质量判定标准(原核生物)有清晰的23S、16S条带，无降解，且肉眼观察23S条带亮度约是16S的1-2倍。5、RNA纯化电泳检查符合标准，进行RNA纯化(MN试剂盒)加DEPC水至总体积50pL，加2倍体积的NTbuffer(100pL)，转移至纯化柱中，离心lmin，弃掉溶液，力B600|iLNT3washingbuffer,10000rpm离心30s，把柱子转移到新Eppendorf管中，力Q30(iLNE/2(65。C预热)，离心lmin，弃掉柱子。6、反转录、标记和杂交取20吗totalRNA，60。C抽干，用DEPC水补平体积至6.5pL，和反转录引物9RandomPrimer(上海英骏生物技术有限公司)4(iL以及外标(对照组x外标l(iL，实验组y外标l(iL)，总体积11.5iiL;混匀振荡，8000rpm离心30s;65。C加热5min，室温冷却10min后，加M-MLV反转录酶(200U/jaL)1.5[iL，5xlstbuffer(M-MLV)4^L,dNTP(10mM)li丄L,0.1MDTT2(iL,总体积为20(iL进行反转录25°C10min，37°C90min。加入反转录终止液5)iL，65。C10min后，再加如10N乙酸1jiL终止反应。反转录产物用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)纯化，过程同步骤4。将纯化后的反转录产物(浓縮至14)iL)和9RandomPrimer引物(4iiL)先95。C变性3min，再进行Klenow酶标记。标记过程中dATP,dGTP，dTTP使用浓度120(iM，dCTP使用浓度为60(iM，Cy5-dCTP、Cy3-dCTP使用浓度为40|iM。Cy3-dCTP标记实验组cDNA，Cy5-dCTP标记对照组cDNA，标记的总体积为26)iL，37°C，90min;70。C变性5min;冰浴5min。标记产物用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)纯化，过程同步骤4。不同点为用NE洗脱2次(30)aL/次)，纯化后抽干至1.5pL。7、杂交与清洗标记的DNA溶于3jiL灭菌水中(溶解顺序为先实验组-cy3，再对照组-cy5)，加入甲酰胺6iiL和4x杂交液缓冲液3(oL,杂交体系为总体积12pL，95'C变性3min，冰浴5min，将杂交液点在芯片上，于42。C水浴过夜；杂交结束后，先在42。C左右含0.2。/。SDS，2xSSC的洗液中洗5min，而后在0.2xSSC溶液中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。8、芯片扫描芯片用LnxScan10KA双通道激光扫描仪进行扫描。9、芯片图像的采集与数据分析采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后以ttest结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。筛选差异表达基因标准为(l)统计意义在95%显著性水准上为显著差异。(2)生物学意义差异表达大于2倍。三、芯片初步应用结果1、E058株体内外毒力基因差异表达的DNA芯片检测结果E058株在体内生长条件下，相对于其在体外LB培养，其差异表达基因共有9个，其中上调基因5个，下调基因4个(图2，表5)。如图2所示E058鸡体内(cy3)/E058LB培养(cy5)芯片杂交伪色图。表5鸡体内外E058株差异表达基因(上调基因5个，下调基因4个)翻功能平均Ratio值(cy3/cy5)T值PO.05P<0.01Klcapsuleantigens13.366728.1779TTolmctinrecsptor7.8400174.7295TTcolicinV2.810094.5757TTcelldivisionproteinftsk，UPEC2.540014.6347TT/CDaerobactin2.403338.9428TT加rlipoprotein，i.cci//0.48605.6157T,5DNAgyrase0.457328.0831TTnegativeresponseregulator0.414325.2554TTmalatedehydrogenase0.328081.6348TT2、E058株和HEC4株在尿液培养条件下毒力基因差异表达的DNA芯片检实验样品HEC4株基因表达和对照样品E058株的基因表达有差异，HEC4(cy3)/E058(cy5)差异表达基因共有18个,其中上调基因10个，下调基因8个(图3，表6)。如图3尿液静置培养条件下HEC4/E058芯片扫描图所示。表6尿液静置培养条件下HEC4株与E058株差异表达基因(上调基因10个，下调基因8个)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>通过对APECE058株和UPECHEC4株体内、外毒力因子表达水平的检测结果表明，该基因芯片具有高通量、微型化、集成化和平行化的优点。本发明由154个靶基因探针组成的基因芯片可同时对APEC、UPEC在体内、外培养条件下的毒力基因的表达水平进行检测。cgtcaatgtaaggaaatcgcaggggcattcaactctgttaccgtcatgaaacgagttattaccctgtttgttattgataaacaaaagtcacgccttattctcttcgctacaggatgacaggctaccgacagtcctggttgggttgaatacagccagaggcccactaaaggattcgctgttaccggatcggccaggatgattcgtcgacacggctttatcctctggcggcatattgacgattaaxgaagcgcatttgctgatactgttgcatccagaxgataagcatgagcaactctgacttgactattaccagatgcagtctggtcaacgacggctgtactgcagggtgtggcgatatcctttctgcagggatgcaataggcagtggtgtcttttggtgggcccagtaaaagataattgaaccatgaagttaaaattcatctccctggtactgaactttaaaggcacacacaaacgggagctgttcttcccgcagcatagttccatgtggcgaaaactagtaaaacagccgcctcgggtggataaatccatgatttgcagacggatgacaatccggtaxcagcatcgcttaccctgactatccccttaccagacataccgcgctatcgcaagcagtgtccaatgtctggtctccgaagactctcaatcggcatccaccttcaacaaccccagcagacgcagtttcagtgatggtgtcatagtagatgccgctcaggaaccaacggtcaggatgatggattcgtcattcggcttgtcaggacggcagatgcgttcaggtgctttgtattgacagccgacaaxtggactcgtaatcgtcgtcgccctgacaacttttaccstcatcgcgttccgcaatctgcttacgaggga111a_gaeltacgagacgcattatgggaggtagtcgccttgtgtgtgtctggtgagtC3gtC3g3CgggttgtttCtgtcaggctgtaatgatgctcctgtccagatgtgtttgcttcattacacgctgattctggtccttctggctttcagtcggagcacaggcagtggatacgtaatacttcccgcaccagcgetggcgactaataaccctatcccattgctctgctaaggetgggcageaaactgataattctccatcaagctgtttgttcgtccgccgctccggagaactgggtgcatcttaceggaggagtaattacaaacctggcacaccattcacgccgataacccacttcgacgccaataccaaaaccacgctgacgctgaagttgataccttcgccgggagtttaggatgaaagtcgcgcccatagacagggttgcgcgttggcatctgctttggeegttattggataxcgaxtaatCEiaaacaccgcatctgactcccaatcatcttcgccatggcgagcacattcaacacaactccagca犯tcaatcggtcaxcgttacctttggcggttacccgctttatcgcttgetgagaaaacaaegggccaacatttccaagaacctgtagtgaagaaagatggctccgtcatcaatgtgaacgaaagatcggtggaagccaggcatacggcagcatcactggattcacccgtaaccactctggcttccgtagctgacagwtcatccacaagggcacctccattaccttcaccaacggtgaccatagcattaacggctatttccgcatgatcccagacgatacgatccagcgcacacaacMgcccatacgatgagttccggcgagcaagcagttgatgtcagagggatactactcaaccttccccagttcatgtatctcaggggaccacatcggacaxaggagcagtttcagacagtctacaggtgaaggtggaatggattc.ctctctttcctctgcggggtcctggtggcccgcatacgtctggtcaggtcgtcaatacgtcgctgaaagagcaggttatactccatcgtgttgacatatcctgctaagagaaactccagaagatcattaaccgactgcgtggggactggtgatgaggttgccactaaatccttcgccttcggcaaaatacaccttcctccattaggggcgatgtttactgagagatggagaacaxcggaatagaactcccgctgggcttttattagatagatttgcatgttattccctgattatggcgggagatgttgataccgatgtcttaacggaatacggatgtgagtgcgagttcttctattcactaccgttgtcaggctcaagtagagggaggacctctggcttaacaatagtggcatcctcatcgcctgtgtgcgagtgacggctttgtagcgttaccgcaggtgtgatgcagcagga.gtaatagcagtcgatagggcgagagaasiggcggtgtcatactcaaacaactgggatggaactatcctgccgcata^ggtgataaxgacgaaggcagataaaacggtagaagcccgcagcaatagaatagccgaatacacaatagaatcccattgaactactgacatcgcctaacagtgctacgaaaggcggctctgcgaacttcttgcgactggttaggtcgtatgccaacaacagactgagcacggcctggatgactggtcgtagcaataacttattacaatacaggtacattaacttcaatgatccttcttagtcacttatatggcgcccgctgaaaacaacggtgtacctgctgaacgaagCtgattgg￡lCgg￡l￡lggttta_axta_ta_a_a_taaxggtg3t￡LgtcgctacgcttgcttatgaccgtgttcgcattaggttctggattcatcatgcaccEicaaggccatttctcttttgcctgccatcacaggcaggattacaacaaagtgcctatgcatctacacaatcgcagtgagaaatggacaatggcggattgtgctaaagttaaacttcacctggcactatggcattctgctggccatagatcgccgtgaagagggcccagtgctgttgttgtcaagaccaagacccgctaatgcggtcttstgggtgctctstccttgcttgttactgctgaccagcggtaagatccttgagaactccccgtcgtgtagataaggtgtttccgttcttgatactattgccttaggagttgtcgtatcagaggtagttggcgtcatgttccatagcgttaaggtttcattgtgacggtgttcggcattctgtctaaccctcggtctctggccattttcggcatcgtcaacagtttggcagatgatttcgctgttggttactgtggccgtagatctcgcctttcacaaagcaacgccttgccttctatctgcccaaagcccacttcaccgaccttccgccgttgtcataagcagcgacttccacgatgcgaatgtcgtaaccgctgccttgatgttacccgagaggtatggcaatgaaagacggtcagcaccttgtcgcctttatggtgatgctcggcgtttcgtgccacctgaaaccgtctctgacacattctggcgatgaccgactggaccttcgaatcggtccgcatttatcattgggaagaaggcgtcacagcgtctccgaxctgatggtattgaccgattccttgcctcttgtttggaccgctatcacaaccag犯gttca_ggc3cgtcacgccgtatgttattgcaactgttcgcccttcactgccgaaccgctgaaagaagca_gacgccgta^ccataa^cagacgctgccttcagtaacgacgctctgaggtggacggtgtaggtsmctgggctggagtgaatctgcttcgttgagagagtttgatcctggctcagaaggaggtgatccagecgca权利要求1、检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于包含154个靶基因探针的DNA芯片；其中97个基因片段扩增自大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因，44个基因片段扩增自用SSH方法获得的APEC特异性基因，13个基因片段扩增自用SCOTS方法获得的APEC特异性基因。2、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述97个基因片段是ymC、,m//、/raW、z>p2、7^^、A戸M、ag/4、pcfpC、/eL4、力cJ、cv"C、/ss、/wcCD、vaf、6moE、/z/少五、cw/7、c'/2MJ、Zz(y丄z'wL4、57'f丄^B、戸pG//、/apGi//、zVeyl、/bcG、maiX、a/。5C、一D五、^r万、rec^、附d/、w^p^、化/丄、y^C、r/x、e/zxj、asp尸、_/7/c、z7za、、eoe、/er、Mx7、愈2、￡、戸a、fc2f尸、wewC、邻D、toxS、tog丄ce《r、戸s、esp丄cdL4、ea仏妳丄"/、e/a/、s/2e丄e^pB、omp丄^;eG、/朋C、々5v4、/仏/77"-丄/f、加、础、虑M、威、滅、WG、Z/a7EAf-7、，62、a磁7、cwL4、i'<i/4、；^4、/eo仏他rZW丄3、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述由SSH方法获得的44个基因片段是e"-7、e-6、ea-7、e"-S、ec51-9、ecs-7(、ecs腿77、ecs-/2、ecs-73、ecs-"、ecs-75、ec^-76、ecs-77、aes-7、aes-2、aes-3、aas-4、5、aas-6、a&s-7、aes-S、ae-9、aes-70、aes-77、a&s-72、aa-"、aas-74、aes-75、aes-M、<3&s-77、aas-78、aes-_/9、aes-，、a&s1-27、aes-"、aes-23、aes-24、aes画25、aes-27、aas-2S、aas-29、aes-30、aes-37、aay-32。4、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述由SCOTS方法获得的13个基因片段是fl"-S、aec-77、aec-73、aec-74、aec-7(5、aec-20、aec-24、aec-25、aec-26、aec-27、aec-29、aec-30、aec-37。5、一种如权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片的构建方法，其特征是先通过PCR方法分别扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArrayTMmicroarmyer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建成检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片。6、根据权利要求5所述检领UAPEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片的构建方法，其特征是扩增所述97个基因片段,mC、ym//、"/k/ra见—2、T^w丄^cwM、"g丄pa/C、声/丄y^fc丄cvaC、zh、/wcCD、va"6ma￡、/2/_y￡\c"/7、c/ra丄/z/少丄/wL4、w'/v4、^5、/a/G//、戸pGZ//、z>e/4、》cG、應汉、a^x6C1、*Z>E、rec丄mt/Zz、w>s^、se/丄、々pC、rfx、e/u:丄esp户、^/7/c、//zo、/7>、eae、/er、Wx7、愈2、/^Z)五、/aa、fe^_P、wewC、,Z)、toxB、tog/4、cesT、pas、^s/7/4、ccfr丄ms/、妙丄cz/、咖/、s/ze丄/er/i、esp_6、cw/丄y^eG、/朋C、加丄/仏//7a-丄/f、加、础、边M、fe^、WG、6/a7EM扁h#r-"、ap/zf3」-/a、c附/丄W^4、y/m丄/eaB、7d^DA^的引物分别是—C:CGTCAATGTAAGGAAATCGCAGG和GGCATTCAACTCTGTTACCGTC;—ATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTG禾口TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC;nTTATTCTCTTCGCTACAG和GATGACAGGCTACCGACAG;/歳TCCTGGTTGGGTTGAATA和CAGCCAGAGGCCCACTA;—2:AAGGATTCGCTGTTACCGGA和TCGGCCAGGATGATTCGTCG;加A—M:GCGCATTTGCTGATACTGTTG和CATCCAGACGATAAGCATGAGCA;砷C:GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG和ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA;/eM:GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG和GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC;，C:CACACACAAACGGGAGCTGTT禾口CTTCCCGCAGCATAGTTCCAT;&:GTGGCGAAAACTAGTAAAACAGC和CGCCTCGGGTGGATAA;/wcCD:atccatgatttgcagacgg和atgacaatccggtaccagca;TCGCTTACCCTGACTATCC禾口CCTTACCAGACATACCGC;6ma五GCTATCGCAAGCAGTGTC和CAATGTCTGGTCTCCGAAG;/z妙ACTCTCAATCGGCATCCAC和CTTCAACAACCCCAGCAG;c"/7:ACGCAGTTTCAGTGATGGTG和TCATAGTAGATGCCGCTCAG;c編GAACCAACGGTCAGGATG和ATGGATTCGTCATTCGGC;/z/W:TTGTCAGGACGGCAGATG和CGTTCAGGTGCTTTGTATTG;/m":ACAGCCGACAACTGGACTC禾口GTAATCGTCGTCGCCCTG;:ACAACTTTTACCATCATCGC禾口GTTCCGCAATCTGCTTAC;柳GAGGGATTTAGAATACGAGAC和GCATTATGGGAGGTAGTCG;CCTTGTGTGTGTCTGGTGAG和TCAGTCAGACGGGTTGTTTC;砷，TGTCAGGCTGTAATGATGCTC禾口CTGTCCAGATGTGTTTGCTTC;^:ATTACACGCTGATTCTGGTC和CTTCTGGCTTTCAGTCGG;/ocG:AGCACAGGCAGTGGATACG和TAATACTTCCCGCACCAGC;ma汉GCTGGCGACTAATAACCC和TATCCCATTGCTCTGCTAAG;一C:GCTGGGCAGCAAACTGATAATTCTC禾tlCATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG;—五CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC和CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA;:CACCATTCACGCCGATAAC和CCACTTCGACGCCAATACC;d:AAAACCACGCTGACGCTG和AAGTTGATACCTTCGCCG;m函GGAGTTTAGGATGAAAGTCGC和GCCCATAGACAGGGTTGC;—:GCGTTGGCATCTGCTTTG和GCCGTTATTGGATACCGAC;mGGTCACCGTTACCTTTGGC禾口GGTTACCCGCTTTATCGC;，ATCGGTGGAAGCCAGGCATACG和GCAGCATCACTGGATTCACCCG;:GCACCTCCATTACCTTCAC禾口CAACGGTGACCATAGCAT;麼TAACGGCTATTTCCGCATGA和TCCCAGACGATACGATCCAG;/enCGCACACAACAAGCCCATAC和GATGAGTTCCGGCGAGCAA;虑7:GCAGTTGATGTCAGAGGGATA禾口CTACTCAACCTTCCCCAGTTCATG;";c2:TATCTCAGGGGACCACATCGG禾口ACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT;to尸GTCGCTGAAAGAGCAGGTTA禾口TACTCCATCGTGTTGACATATCC;GGCAAAATACACCTTCCTC和CATTAGGGGCGATGTTTAC;tog^:TGAGAGATGGAGAACACCG和GAATAGAACTCCCGCTGG;cmr:GCTTTTATTAGATAGATTTGC禾口ATGTTATTCCCTGATTATG;戸GCGGGAGATGTTGATACC和GATGTCTTAACGGAATACGG;—:ATGTGAGTGCGAGTTCTTC和TATTCACTACCGTTGTCAGG;ccf":CTCAAGTAGAGGGAGGACC和TCTGGCTTAACAATAGTGGC;ATCCTCATCGCCTGTGTG和CGAGTGACGGCTTTGTAG;咏Ae/a/:GATGGAACTATCCTGCCG和CATAGGTGATAACGACGAAG;A":GCAGATAAAACGGTAGAAG和CCCGCAGCAATAGAATAG;戸j:CACCGAATACACAATAGAATCC禾口CATTGAACTACTGACATCGCC;—:TAACAGTGCTACGAAAGGCG和GCTCTGCGAACTTCTTGC;:GACTGGTTAGGTCGTATGCC和AACAACAGACTGAGCACGG;/aeG:CCTGGATGACTGGT和CGTAGCAATAACTTATTAC;/朋C:AATACAGGTACATTAACTTCAATG禾口ATCCTTCTTAGTCACTTATATG;，/77":GCTACGCTTGCTTATGAC禾口CGTGTTCGCATTAGGTTC;&TGGATTCATCATGCACCACAAGG禾口CCATTTCTCTTTTGCCTGCCATC;加疾虫2e5:GCGGATTGTGCTAA和AGTTAAACTTCACCTGG;CACTATGGCATTCTGCTGGC和CATAGATCGCCGTGAAGAGG;励GCCCAGTGCTGTTGTTGTC和AAGACCAAGACCCGCTAATG;tefG:CGGTCTTATGGGTGCTCTAT和CCTTGCTTGTTACTGCTGAC;Wa7W-7:CAGCGGTAAGATCCTTGAGA和ACTCCCCGTCGTGTAGATAA;carW:GGTGTTTCCGTTCTTGATAC禾口TATTGCCTTAGGAGTTGTCG;7:TATCAGAGGTAGTTGGCGTCAT禾口GTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATT;a必J2:TGTTGGTTACTGTGGCCGTA和GATCTCGCCTTTCACAAAGC;gac:CTTCCGCCGTTGTCATAA和GCAGCGACTTCCACGATG;/"f-/:CGAATGTCGTAACCGCTG和CCTTGATGTTACCCGAGAG;caf/:GTATGGCAATGAAAGACGG和TCAGCACCTTGTCGCCTT;//oi:TATGGTGATGCTCGGCGT和TTCGTGCCACCTGAAACC;騰n/K:GTCTCTGACACATTCTGGCG和ATGACCGACTGGACCTTC;#卜"GAATCGGTCCGCATTTATC和ATTGGGAAGAAGGCGTCAC;apA:AGCGTCTCCGACCTGATG和GTATTGACCGATTCCTTGC;:GTCACGCCGTATGTTATTGC禾口AACTGTTCGCCCTTCACTG;,J:CCGAACCGCTGAAAGAAG和CAGACGCCG丁AACCATAAAC;—:AGACGCTGCCTTCAGTAAC和GACGCTCTGAGGTGGACG;如&GTGTAGGTAACTGGGCTGG和AGTGAATCTGCTTCGTTGAG;7forDA^:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。全文摘要检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片及其构建方法，属于人兽共患病
技术领域：
，先扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArray^TMmicroarrayer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建154个靶基因探针的DNA芯片，用于检测APEC、UPEC毒力基因表达水平。文档编号C12Q1/68GK101096706SQ200710023940公开日2008年1月2日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者刘秀梵,宦海霞,赵李祥,祥陈,崧高申请人:扬州大学