一种基于rmce技术的转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种基于RMCE技术的转基因方法。
【背景技术】
[0002] 现有的转基因技术，多采用显微注射，其具有试验周期短、目的基因片段长度可达 100kb、整合效率高等优点，但还是存在诸多不足和缺点，如外源基因是以随机插入的方式 进入受体基因组，其整合位点和拷贝数都无法精确掌握，有可能引起基因沉默，更改细胞或 组织特异性基因的表达水平，甚至影响整个基因组的表达情况，从而造成宿主优良性状的 丢失，甚至有致死性状的出现。
[0003] 重组酶介导的盒式交换技术（Recombinase Mediated Massette Exchange，RMCE) 与同类方法相比，具有定点、高效、简单而又可能对基因组进行反复修饰等特点，因而在研 究基因功能、分析顺式作用成分以及构建各种转基因动物、建立人类疾病动物模型等方面 具有很大的应用价值。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了克服上述转基因技术的不足和缺点，研制基于RMCE技术的转基因 技术，为科学研究和市场应用提供前期基础，本发明所要解决的技术问题是提供了一种基 于RMCE技术的转基因方法。
[0005] 本发明解决了现有转基因技术插入位置及拷贝数不确定、引起基因沉默、更改细 胞或组织特异性基因的表达水平，甚至会影响整个基因组的表达情况。本发明可在短时间 内、高效率、精确的获得定点插入的转基因鼠。
[0006] 技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是一种基于RMCE技术的转基因 方法，包括以下步骤：
[0007] 1)构建载体：以Rosa26载体为框架，加上Lox2272位点或Attp70位点、广谱性启 动子、焚光蛋白基因、LoxP位点或Attp70位点、Frt位点、筛选标记和DTA终止区域；
[0008] 2)载体测序正确后，电转到ES细胞中，用含有抗生素的培养基进行筛选，获得阳 性ES细胞；
[0009] 3) PCR 或 Southern Blot 再次验证；
[0010] 4)将带有Flp重组酶的质粒转到阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细 胞；
[0011] 5)将验证正确的阳性ES细胞显微注射到小鼠的囊胚中，而后转移至代孕母鼠中， 获得含有荧光标记的RMCE工具鼠。
[0012] 其中，上述启动子为EF1 a、CAG、CMV或其他所有广谱性表达的强启动子。
[0013] 其中，上述荧光蛋白为eGFP、mCherry、RFP、BFP或其他所有发挥追踪作用的蛋白。
[0014] 其中，上述筛选标记为Neo、Puro或其他所有能达到筛选目的的蛋白。
[0015] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：
[0016] 1)操作简单、周期短，节省时间和成本；
[0017] 2)只需确定目的基因的序列信息，即可实现基因的定点插入；
[0018] 3)减少随机插入引起的非必要的基因沉默；
[0019] 4)避免基因突变造成的胚胎过早死亡等。
[0020] 本发明的转基因技术，是由RMCE与重组酶技术融合而来，其既有RMCE技术的优 点，又能实现基因的定点插入，转基因效率高、同时也减少了基因的随机插入带来的毒性。
[0021] 本发明只需要设计简单的载体，即可实现转基因鼠的构建；利用此工具鼠可以在 短时间内高效、特异性的完成基因的定点插入，为人类疾病的研究提供理论依据和动物模 型。另外此发明也可作为临床和医药研究的配套技术，为人类健康保驾护航。
【附图说明】
[0022] 图1 :实施例1中工具鼠构建的载体骨架；
[0023] 图2 :实施例2中工具鼠构建的载体骨架；
[0024] 图3:PCR扩增获得720bp的eGFP片段和1179bp的EF1a片段琼脂糖凝胶电泳 图；
[0025] 图4 :EF1 a菌落PCR结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0026] 图5 :eGFP菌落PCR结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0027] 图6 :5' arm PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0028] 图7 :3' arm PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；
[0029] 图8 :焚光显微镜检测ES细胞图片；
[0030] 图9 :PCR扩增获得1507bp的目的基因片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0031 ] 图10 :菌落PCR扩增获得748bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0032] 图11 :PCR验证扩增获得659bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0033] 图12 :PCR扩增获得672bp CMV片段、720bp的eGFP片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0034] 图13 :CMV菌落PCR获得513bp的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0035] 图14 :eGFP菌落PCR获得615bp的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0036] 图15 :5' arm PCR鉴定结果，获得3. lkb的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0037] 图16 :3' arm PCR鉴定结果，获得4. 5kb的扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0038] 图17 :焚光显微镜检测ES细胞图片；
[0039] 图18 :PCR扩增获得845bp的目的基因片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0040] 图19 :菌落PCR扩增获得421bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0041] 图20 :PCR验证扩增获得725bp的片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0042] 图 21 :加上 Lox2272 位点、EF1 a、eGFP 基因、LoxP 位点、Frt 位点、Neo 和 DTA 终 止区域的R〇sa26载体骨架；
[0043] 图22 :EF1 a后连入CHRM4基因的外显子序列；
[0044] 图23 :加上Attp70位点、CMV、eGFP基因、AttP70位点、Frt位点、Neo和DTA终止 区域的Rosa26载体骨架；
[0045] 图24 :CMV启动子之后连入hNQOl的外显子序列；
[0046] 图25 :常规转基因载体的构建。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0048] 1、实验材料
[0049] 实施例1 :
[0050] 插入基因简介：人类的 Cholinergic Receptor，Muscarinic 4 (CHRM4)基因， Ensembl的基因编号为ENSG00000180720,基因编码区全长1437bp ;其功能多样，如参与抑 制腺苷酸环化酶、磷酸肌醇的降解等。本实施例的EF1 a、eGFP基因、CHRM4基因等所有的 DNA模板由苏州金唯智基因公司合成的。
[0051] ( -）工具鼠的构建
[0052] 1、载体构建：在Rosa26载体骨架上连入加上Lox2272位点、EF1 a、eGFP基因、 LoxP位点、Frt位点、Neo和DTA终止区域。载体骨架如图21。
[0053] 1)片段的PCR扩增：
[0054] 引入EF1 a、Lox2272位点的引物：
[0055] mRosa26-EFla_F/Hpa]
GGCTCCGGTGCCCGTCAGT
[0056] mRosa26_EF 1a- R/ AsisI:
TCACGACACCTGAAATGGAAG
[0057] 备注：加粗部分为同源臂、灰色部分为Lox2272位点序列
[0058] 引入eGFP基因、LoxP位点的引物：
TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
[0061] 备注：加粗部分为同源臂、灰色部分为LoxP位点序列
[0062] EFla或者eGFP基因的PCR扩增体系：
[0063]
[0064] EFla或者eGFP基因的PCR扩增程序：
[0065]
[0066] PCR扩增结果参见图3, PCR扩增获得720bp的eGFP片段、1179bp的EF1 a片段。
[0067] 2)将获得的片段连接、转化、涂板、挑单克隆，进行菌落PCR验证：
[0068] 菌落PCR的模板是来源于上述挑选的单菌落。挑选的单菌落混于10 y L的灭菌的 蒸馏水中后，取1. 5 yL作为模板。
[0069] EFla的菌检引物：
[0070] mRosa26-EFla -SF:CCAGCCTGGTCTACACATCAAG
[0071] mRosa26-EFla -SR:ACCACACACGGCACTTACCTG
[0072] eGFP的菌检引物：
[0073] mRosa26-eGFP-SF:CCACAACATCGAGGACGGCAG
[0074] Neo_R:CTAAAGCGCATGCTCCAGACTG
[0075] 菌落PCR体系：
[0076]
[0077] 菌落PCR程序：
[0078]
[0079] 菌落PCR结果：EF1 a菌落PCR结果参见图4,获得515bp的扩增片段，eGFP菌落 PCR结果参见图5,获得700bp的扩增片段。
[0080] 3)将验证正确的克隆子送交测序
[0081] 2、将测序正确的载体电转至ES细胞中，用含有新霉素的培养基筛选，获得阳性ES 细胞；
[0082] 3、PCR再次验证；
[0083] 1)5'armPCR鉴定引物：
[0084] Utexas001_KI_Rl：CTTGGCCCGCATTTACAAGACTATC
[0085] Utexas001_5PCR_Fl：TCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTT
[0086] PCR扩增体系：
[0087]
[0088] 上述的DNA模板的获取：阳性的ES细胞用细胞裂解液裂解后就直接使用作为模 板；阳性的ES细胞加入lmL细胞裂解液，56°C，过夜即可；细胞裂解液的成分如下：50mmol/ L的Tris，PH8.0 ;100mmol/L的EDTA;mmol/L的NaCl;1%SDS;100yL的蛋白酶K(100mg/ mL) 〇
[0089] PCR程序：
[0090]
[0091] 鉴定结果参见图6, 5'armPCR鉴定结果，获得3. 7kb的扩增片段。
[0092] 2)3'armPCR鉴定引物
[0093] NeoPCRF161 ? 3:GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA
[0094] UtexasOO1_3PCR_R2：AAGACACCAGTTTCAGCCCAAGTTC
[0095] PCR扩增体系
[0096]
[0097]
[0098] DNA的获取：阳性的ES细胞用细胞裂解液裂解后就直接使用作为模板；阳性的ES 细胞加入lmL细胞裂解液，56°C，过夜即可；细胞裂解液的成分如下：
[0099] 50mmol/L 的 Tris，PH 8. 0 ;100mmol/L 的 EDTA ;mmol/L 的 NaCl ;1 % SDS ;100 y L 的蛋白酶K(100mg/mL)。
[0100] PCR 程序：
[0101]
[0102] 鉴定结果参见图7, 3' arm PCR鉴定结果，获得4. 8kb的扩增片段。
[0103] 4、将带有Flp重组酶的质粒转到阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细 胞，荧光显微镜检测，ES细胞中具有绿色荧光，如图8。
[0104] 5、将阳性ES细胞显微注射到小鼠囊胚中，而后转移至代孕母鼠中，获得含有eGFP 的RMCE工具鼠。
[0105] (二）转基因小鼠的制作
[0106] 1、插入载体的构建：在EFla后连入CHRM4基因的外显子序列，如图22。
[0107] CHRM4基因的PCR扩增引物：
[0108] CK070-KI-F:CTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCCACCATGGCCAACTTCACACCTGTC
[0109] CK070-KI-R:TCTAGTCCGCGGGTGCGATCGCGGTGGCGACCGGTGGATCCCGCC
[0110] PCR扩增体系：
[0111]
[0112]
[0113] PCR扩增程序：
[0114]
[0115] PCR扩增结果参见图9 :PCR扩增获得1507bp的目的基因片段。
[0116] 2、将获得的片段连接、转化、涂板、挑单克隆，进行菌落PCR验证。
[0117] 菌落PCR的模板是来源于上述挑选的单菌落。挑选的单菌落混于10 yL的灭菌的 蒸馏水中后，取1. 5 yL作为模板。
[0118] 目的片段菌检引物：
[0119] KI070-KI-Scr-F:CCGTAATGCAGAAGAAGACCATG
[0120] pBas i c_Scr-R:CTAAAGCGCATGCTCCAGACTG
[0121] PCR扩增体系：
[0122]
[0123] PCR扩增程序：
[0124]
[0125] PCR扩增结果参见图10 :菌