一种ω-转氨酶突变体基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种ω-转氨酶突变体基因及其应用。
【背景技术】
[0002]光学纯手性胺是一类有重要价值的医药及精细化工中间体，对手性胺类化合物的不对称合成进行深层次研宄具有较大的经济效益和应用价值。目前，超过70%的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体。
[0003]转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。作为5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的转氨酶，在反应过程中存在PLP和5-磷酸吡哆胺(PMP)的互相转换，催化的是典型的双底物反应，遵循乒乓反应机制。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类:天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。
[0004]手性胺在医药、农药和化学产业中起到非常重要的作用，它们通常作为中间体或合成单体用于制备各种诸如药物活性物质的生理活性物质，例如头孢菌素或吡咯烷衍生物等为数众多的手性胺的各种应用中，只有一种特定的光学活性形式，即(奶或对映体是有生理活性的。合成α-三氟甲基胺类化合物的化学方法主要有采用三氟甲基化试剂直接对胺类底物引入三氟甲基基团。然而，三氟甲基化试剂如C6H5SCF3等比较昂贵，且难以制备；而三氟甲基亚胺底物不稳定、易分解，在反应过程中容易水解，所以上述化学合成方法，不适合放大实验和产业化。与传统的化学合成方法相比，酶法通常使用更为温和的条件，并且能够获得合理的立体选择性。但是，通常使用的酶底物特异性、对映体选择性和/或转化率对于工业化的生产过程还不够高。另外，使用转氨酶生产光学活性胺的一个最主要的缺陷是常常会发生底物和产物抑制现象。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种ω -转氨酶突变体基因及其应用的技术方案。
[0006]所述的一种ω-转氨酶突变体基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不O
[0007]所述的一种ω-转氨酶突变体基因编码表达的ω-转氨酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]所述的一种ω-转氨酶突变体基因编码表达的ω-转氨酶在催化合成三氟甲基胺类化合物中的应用。
[0009]所述的一种ω-转氨酶突变体基因编码表达的ω-转氨酶在催化合成三氟丙胺中的应用。
[0010]所述的应用，其特征在具体包括以下步骤:以外消旋的三氟丙酮为氨基受体，在I?10 mL的pH为6.5?8.5磷酸盐缓冲液中加入摩尔比为1:2?4的L-天冬氨酸、L-丙氨酸或异丙胺作为氨基供体，加入0.5 mg的ω -转氨酶作为生物催化剂，反应0.5?3小时，反应温度为20?40°C，得到转化率超过70%以及ee>90%的三氟丙胺。
[0011]本发明首先是提供一种ω-转氨酶的变体基因，其编码对应的ω-转氨酶具有较高的产酶量，因此，在工业生产中可以提高生物催化与转化的效率。
[0012]本发明还提供变体基因编码表达的ω-转氨酶在制备三氟丙胺的应用，在缓冲液中添加三氟丙酮作为底物进行反应，然后从反应液中收集产物三氟甲基胺类化合物。本发明方法制备三氟丙胺具有反应条件温和、无污染且工艺简单等显著特点。
【附图说明】
[0013]图1为密码子优化前后ω-转氨酶基因序列的比对。
[0014]图2为密码子优化前后的mRNA 二级结构对比。a密码子优化前；b密码子优化后。
[0015]图3为重组表达ω -转氨酶纯化结果的SDS-PAGE分析。1-细胞破碎液；2_上样穿透液；3-20mM咪唑洗脱液；4-50mM咪唑洗脱液；5_100 mM咪唑洗脱液；6-250mM咪唑洗脱液。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0018]为进一步说明本发明，结合以下实例具体说明。实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明实施中未注明的实验方法，如感受态细胞制备、转化以及LB培养基配制等参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂译，科学出版社，2002)中的方法进行。
[0019]根据NCBI 数据库中 Chromobacterium v1laceum DSM30191 的 ω-转氨酶基因序列(Genbank: NP_901695)以及密码子使用数据库(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)中饱Escherichia 密码子使用频率分布表，分析ω -转氨酶的密码子使用情况。将Ε.中密码子使用频率小于15%的定义为稀有密码子，密码子优化的过程中根据以下原则:不改变ω-转氨酶所编码的氨基酸序列；将ω-转氨酶中的稀有密码子替换为使用频率较高的密码子，并且按照密码子使用频率比例分配同一氨基酸不同的密码子使用，去除ω-转氨酶的基因密码子优化过程产生的限制性内切酶酶切位点，参考pET_28a(+)载体所有的酶切位点。如图2所示，密码子优化后有17%的核苷酸发生了变化，对优化前后ω-转氨酶的mRNA 二级结构进行预测，结果显示优化后的mRNA 二级结构比优化之前简单，发卡结构明显减少，而且自由能增加说明稳定的二级结构量减少。密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-opt-TA基因)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。按照E.的密码子偏好性及基因二级结构优化对野生型ω-转氨酶进行改造，改造后的基因序列与野生型序列同源性为83% (图1)，其编码的蛋白质共459个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本发明中经密码子优化ω-转氨酶基因(ω-opt-TA基因)委托南京金斯瑞生物工程有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用pET_28a质粒作为克隆载体。构建的重组质粒pET-28a- ω -0pt_TA 转入 E.coli BL21 (DE3 )，获得重组菌。
[0020]上述重组菌的表达方法如下:将带有重组质粒pET-28a_ω-opt-TA的重组工程菌接种到20 mL含有50 Pg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、180 rpm振荡过夜培养，然后以1%的接种量接种到含有50 Pg/mL卡那霉素的100 mL LB液体培养基，37°C、180 rpm培养至0D600为0.6?0.8时，加入IPTG (终浓度为I mmol/L)，25°C、150 rpm继续诱导18 ho诱导结束后，4 °〇下4000Xg离心10 min，收集菌体沉淀。用pH 8.0、0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300 W，工作3 S，间隙6 s)，12000Xg离心10 min收集上清，即得到含有转氨酶活性的粗酶液。
[0021]采用N1-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。N1-NTA亲和层析过程中，细胞裂解缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，20 mmol/L咪唑，pH 8.0 ;洗脱缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300mmol/L氯化钠，100 mmol/L咪挫，pH 8.0 ;再生缓冲