灵芝漆酶毕赤酵母基因工程菌株的构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种分子生物学、基因工程领域的技术，具体是一种灵芝漆酶毕 赤酵母基因工程菌株的构建与应用。
【背景技术】
[0002] 自然界参与降解木质素的微生物种类有真菌、放线菌和细菌等，但最有效、最主 要的是真菌（BuswellJ，OdierE，KirkT.Ligninbiodegradation.CriticalReview inBiotechnology，1987,6:l_60)。主要是这些微生物能够产生木质素修饰酶（lignin modifyingenzymes，LMEs)，主要包括木质素过氧化物酶（ligninperoxidase，LiP)(EC 1· 11. 1· 14)、猛过氧化物酶（manganeseperoxida，MnP) (EC1. 11. 1· 13)、漆酶（laccase， Lac)(EC1. 10. 3. 2)以及产生过氧化氢的氧化酶，比如乙二醛氧化酶（glyoxaloxidase， GL0X)、芳基乙醇氧化酶（Aryl-alcoholoxidase，ΑΑ0)等。
[0003] 漆酶（EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，广泛 分布在植物、真菌、少数细菌和昆虫中。漆酶的活性中心一般包含4个铜离子，漆酶的催 化氧化反应即通过铜离子间的协同传递电子，夺取反应底物的电子，将底物氧化为自由基 形式，同时将从底物捕获的电子传递给〇2,将〇2还原为水（Hakulinen N，Kiiskinen LL， Kruus K，Saloheimo Μ，Paananen A, Koivula A, Rouvinen J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Mol Biol. 2002,9 (8): 601-605.)。漆酶作用的底物相当宽泛，典型的底物是各种 酚类化合物及其衍生物，包括简单的二酚、多酚、甲氧基取代酚（如愈创木酚）、氨基酚、氯 酚等。在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化的底物范围还将进一步扩大。由于漆酶 作用底物的广泛性及以水作为唯一副产物，使得漆酶在绿色生物技术应用中有较好的应 用前景，主要体现在芳香族化合物合成、食品和果汁加工、土壤和水体的生物除污、纸浆漂 白等方面（Zhou Xff, Cong WR, Su KQ，Zhang YM. Ligninolytic enzymes from Ganoderma spp:current status and potential applications. Critical Review in Microbiology, 2013, 39 (4) :416-26)。在上世纪对漆酶的研究中，70年代确定了白腐菌在实验室条件下降 解木质素的营养需求；80年代发现了白腐菌降解木质素的酶系，Lac、Lip和Μηρ ;90年代展 开了催化特征、分子生物学的研究，同时在生物制浆、生物漂白、染料废水、制浆废水等工业 领域的应用研究也蓬勃开展起来。
[0004] 虽然从自然界中的植物中能分离到漆酶，但是其工艺烦琐，成本高；多种微生 物具有产生漆酶的功能，如现有文件"一种生产漆酶的方法"（201310742301. 7)中， 利用杈戴氏霉GZUIFR-H104. 1真菌菌株培养生产漆酶；"灵芝漆酶的高效清洁生产方 法"（200610096638.5)利用树舌灵芝菌丝发酵生产漆酶等，但由于天然的产漆酶菌株的生 长缓慢，营养要求较高，或是产物在胞内形成包涵体（细菌菌株）不利于目标蛋白的纯化， 漆酶产量低、生产成本高。另外，利用丝状真菌生产漆酶还存在一些问题，如发酵周期长，培 养基要求高，酶活力低，菌丝在发酵罐中易受高剪切力的损伤等。随着分子生物学技术的发 展，利用DNA体外重组技术构建各类工程菌株，通过工程菌株的发酵生产各种蛋白已经成 为可能，并产生了巨大的经济效益。因此，在漆酶的生产中，克隆漆酶基因、构建漆酶基因工 程菌株，实现漆酶基因的异源表达，是今后实现重组漆酶的工业化生产及实际应用的重要 基础。
[0005] 目前已经从多种白腐真菌中克隆了漆酶基因，如GenBank:AAR21094,AAR21096， ABP81837,AAG09229,BAA22153,AAM18407,CAA7701等。通过灵芝基因组测序发现，在灵芝 全基因组中，真菌木质素氧化酶家族中有16个漆酶基因，与其他担子菌比较，灵芝漆酶基 因拷贝数仅次于灰盖鬼伞菌（Coprinopsiscinerea)，提示灵芝具有很强的木质素降解能 力（陈岳文等，灵芝漆酶注释基因Laccl的生物信息学分析及其Cu2+诱导表达，湖南农业大 学学报（自然科学版）.2013, 39 (3) : 265-269)，因此，一些研究者希望从灵芝中克隆漆酶基 因（如Genbank:AY485825 ;张银波等，灵芝（Ganodermalucidum)漆酶基因的克隆及其序 列分析。中国生物化学与分子生物学报，2005, 21 (5) :700-704。张桂敏，王亚平，蔡立涛，马 立新。外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA，武汉大学学报（理学版）。2007, 53(6): 701-705.)利用基因工程的方法生产漆酶，为我们的生产和生活服务。而在众多的表达宿主 中，原核表达产量低，且有可能形成包涵体，不利于漆酶的分离纯化，或有增加分离纯化成 本的缺点。毕赤酵母是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发 酵的大规模生产方式，其分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的分离和纯化。
[0006] 中国专利文献号CN1657611，公开（公告）日2005. 08. 24,公开了一种具有漆酶、 木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂及其核苷酸序列，克隆了新的漆酶、木聚糖酶和过氧化物 酶基因，构建了漆酶、木聚糖酶和过氧化物酶基因的表达载体，将表达载体导入酵母或丝状 真菌中表达，并检测出重组酶的活性。将重组表达的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶混合酶配 制成制剂，可在造纸、环保、食品和饲料等工业中应用。但该技术并未给出用毕赤酵母作为 生产重组漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶蛋白的宿主的具体实现方案；构建的pBARPE-Lac 表达载体仅在黑曲霉（Aspergillusniger)中得到表达，并未涉及毕赤酵母的表达。现有 研究表明：大部分丝状真菌均有分泌漆酶的能力，该技术所测的漆酶（酶活）是菌丝体本身 分泌的漆酶还是基因工程菌产生的漆酶还很难预料，因为黑曲霉本身就是能够分泌产生漆 酶；再之，丝状真菌中产生漆酶的同时会分泌许多种酶类，发酵产生的混合液中的多种酶会 给后续的漆酶的分离和纯化带来众多不便。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种灵芝漆酶毕赤酵母基因工程菌 株的构建与应用，重组毕赤酵母阳性菌株经过甲醇诱导培养，可用于制备重组灵芝漆酶 (rGILac)〇
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明涉及一种灵芝漆酶毕赤酵母基因工程菌株的构建，通过从灵芝中克隆出漆 酶基因GILac，经EcoRI和Xbal双酶切后克隆入毕赤酵母表达质粒并构建出表达载体，最后 将其电转化入毕赤酵母表达宿主菌中，经培养扩增和筛选后得到毕赤酵母工程菌。
[0010] 所述的灵芝，采用但不限于灵芝（G.lucidum51562)、灵芝（G.lucidum 50044)、赤芝（G.lucidum00679)、紫芝（G.sinensi50817)，优选米用灵芝（Ganoderma lucidum) 50817，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)〇
[0011] 所述的漆酶基因GILac的核苷酸序列如SeqID.No. 1所示。
[0012] 所述的双酶切是指：将拟表达的灵芝漆酶基因GILac的cDNA序列经EcoRI和Xbal 双酶切。
[0013] 所述的毕赤酵母表达质粒优选为经过相同的所述EcoRI和Xbal双酶切的质粒，进 一步优选为pPICZaA。
[0014] 所述的构建是指：将拟表达的灵芝Lac的cDNA序列经EcoRI和Xbal双酶切后，克 隆入同样经过Xbal和EcoRI双酶切的pPICZαA-载体，再将酶切回收产物连接、转化大肠 杆菌DH5a感受态细胞中。
[0015] 所述的毕赤酵母表达宿主菌优选为毕赤酵母X33。
[0016] 所述的电转化是指：取5-10μL线性化的单拷贝质粒分别加入80μL毕赤酵母 父33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击，电压： 1500V，电击时间5. 4ms，电击完成后，立即加入lmL、lM预冷的山梨醇，混匀后转移到1. 5mL 离心管中，28°C，静止1~2h，每200yL涂一块YPD平板。28°C，培养3d，形成分散，饱满的 单克隆，挑斑接种3mLYH)液体培养基中。
[0017] 所述的培养扩增是指：将经过电转化的毕赤酵母X33细胞涂布于含Zeocin浓度为 1. 0mg/mL的YH)琼脂平板30°C培养3天，然后挑取转化子进行PCR扩增检测。
[0018] 所述的筛选是指：筛选高拷贝重组了漆酶基因表达框架的毕赤酵母重组子作为含 漆酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，即重组毕赤酵母阳性菌株。
[0019] 本发明涉及上述方式得到的基因工程菌株的应用，将其用于制备灵芝漆酶 rGlLac〇
[0020] 所述的制备是指：将所述重组毕赤酵母阳性菌株活化后接种于BMGY诱导前培养 基中，后转接入1. 5LBMMY诱导培养基中，诱导表达96h;诱导后上清经透析浓缩后重溶于 tris-HCl缓冲液中，利用镍离子亲和层析（Ni-IDA)纯化重组蛋白。
[0021] 所述的接种具体是指：将挑选的重组毕赤酵母X33阳性菌株接种于含有BMGY培养 液的摇瓶中，28°C下250rpm培养16-18h后，离心并收集细胞。
[0022] 所述的诱导是指：用BMMY培养液重悬接种后的细胞进行诱导，每24h补加甲醇至 终浓度为1%。
[0023] 所述的透析浓缩是指：将诱导后的产物在4000rpm、室温环境下离心5