分钟，收集 上清液，上清液装入透析袋中，与pH6. 0的磷酸缓冲液中透析48h，每12h更换一次缓冲液， 重复直至上清液浓缩到原体积的40%左右。
[0024] 所述的镍离子亲和层析是指：利用Ni-NTA柱（含有Ni-NTA琼脂糖，用10倍柱体 积的Lysisbuffer预平衡柱）纯化；用20倍柱体积的Washbuffer洗柱，用以除去非目的 蛋白；目的蛋白由Elutionbuffer洗脱出来，供SDS-PAGE电泳分析。
[0025] 所述的BMGY培养液每升中含有：1%酵母提取物、2%蛋白胨、lOOmM磷酸钾缓冲 液、ρΗ6· 0、1. 34%酵母氮源、4X10 5%生物素以及1%甘油。（均为质量/体积百分比）
[0026] 所述的ΒΜΜΥ培养液每升中含有：1%酵母提取物、2%蛋白胨、lOOmM磷酸钾缓冲 液、pH6.0、1.34%酵母氮源、4X10 5%生物素以及0.5%甲醇。（均为质量/体积百分比） 技术效果
[0027]与现有技术相比，本发明从白腐真菌灵芝中筛选高产漆酶的菌株，并克隆漆酶基 因，灵芝中漆酶基因具有拷贝数高，基因表达后具有更高的活性；本发明构建了灵芝漆酶 (Lac)的酵母分泌型共表达载体pPICZaA-GILac，并转化毕赤酵母（Pichiapastoris) X33,通过挑选高博莱霉素（Zeocin)抗性的重组子作为毕赤酵母工程菌。毕赤酵母的胞外 表达载体pPICZαA是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体，能表达高拷 贝的基因。
【附图说明】
[0028] 图1为灵芝漆酶全长cDNA电泳图；
[0029] 图中：泳道M:DNAmarkDL2000 ;泳道1:扩增的漆酶基因；
[0030] 图2为构建的灵芝漆酶基因酵母分泌型共表达载体pPICZaA-GILac;
[0031] 图3为阳性重组子的PCR鉴定结果；
[0032] 图中：泳道M :DNA mark DL 12000 ;泳道1 :宿主菌X33基因组；泳道2 :1#重组子 基因组；泳道3 :34#重组子基因组；泳道4 :36#重组子基因组；泳道5 :37#重组子基因组； 泳道6 :pPICZ a A-GL-Laccase质粒；
[0033] 图4为灵芝漆酶rGILac诱导表达SDS-PAGE结果；
[0034] 图中：泳道Μ:蛋白质Marker;泳道X33诱导：对照；泳道36#转化子：指24h、48h、 72h和96h毕赤酵母X3336#转化子诱导Lac蛋白表达；泳道36#转化子：指24h、48h、72h 和96h毕赤酵母X3337#转化子诱导Lac蛋白表达。
【具体实施方式】
[0035] 本实施例首先通过以下方式实现灵芝漆酶产酶高产菌株的筛选
[0036] 本实施例采用的灵芝菌种包括：灵芝（G.lucidum51562)、灵芝（G.lucidum 50044)、赤芝（G.lucidum00679)、紫芝（G.sinensi50817)被用于该实验，所有菌株购自 中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0037] 1)菌种的活化：将斜面菌株放至28°C温箱中活化24h后，挑取斜面试管菌种的菌 丝接至PDA固体培养基平板上，28°C恒温培养5~7d，待菌丝长满培养皿2/3面积时备用。
[0038] 2)酶活力的平板检验：酶活力的检验用PDA-Bavendamn方法（難sch R. Demonstration of phenoloxidases using Bavendamm's reaction in the ring dish test. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. 1972,127 (6) : 555-563)对产 漆酶的几株菌株进行初筛。将愈创木酚以0. 04%的浓度加入PDA培养基，在超净工作台上 用用接种铲接种已活化的直径为lcm的菌块，每个菌株做3个平行，28°C恒温培养，观察各 菌株菌落周围有无红褐色晕圈生成）
[0039] 将菌种接种到添加了愈创木酚的PDA培养基上，培养1天后开始拍照，接着每天观 察菌种的生长情况，并拍照。以愈创木酚作底物的氧化带法进行菌株漆酶分泌的初筛，有红 褐色晕圈生成，表明结果是可靠的，即产生氧化带的菌株都有漆酶活性，并且其氧化带产生 越早，说明漆酶产生也可能越早。接种4个灵芝菌株，在第ld、第2d、第4d、第7d红褐色晕 圈的生成情况分别测量了显色圈直径大小。
[0040] 结果直观分析可见，在培养初期各菌株在同一培养基上分泌漆酶的差别不大，培 养4d后灵芝50044菌株分泌漆酶的活性增长较快，培养7d后该菌株分泌漆酶的活性最高； 灵芝51562和灵芝00679从培养之初到培养结束分泌漆酶的活性一直呈直线上升的态势， 培养9d时分泌漆酶的活性达到最高值和灵芝50044菌株7d时分泌漆酶的活性接近。因此 灵芝初筛结果认为灵芝50044、灵芝51562和灵芝00679在初筛中不分上下，均可作为产漆 酶的候选菌株进一步研究。
[0041] 2)灵芝漆酶高产菌株的再次筛选：将4株灵芝51562、灵芝50044、灵芝00679、灵 芝50817分别在无菌条件下接入产酶培养基中，振荡培养4d后分别在第4d到12d对漆酶 的酶活性进行测定，以确定灵芝漆酶高产菌株。
[0042] 所述的酶活性的测定，其方法和结果如下。
[0043] ①预培养：利用已经活化的固体培养基上的菌丝，在超净工作台内用接种产将 lcm2左右的平板菌种接至装有50mL液体预培养培养基（改良的PDA液体培养基）的150mL 三角瓶中。将三角瓶放入28°C恒温摇床中120rpm培养9~14d。
[0044] ②产酶培养：在无菌超净台上，使用5mL移液器分两次移取共10mL预培养的含菌 丝小球的液体，加入装有40mL液体灵芝产酶培养基的150mL三角瓶中，两个重复，置于28°C 恒温摇床中培养4d后开始测定漆酶活性，之后每天取样测定1次。
[0045] ③Cu2+产酶培养的影响：在无菌超净工作台上，用5mL移液管分两次取10mL预培 养的含菌丝小球的液体，加入含40mLCu2+产酶培养基的150mL三角瓶中，两个重复。28°C 恒温摇床中培养4d后开始测定漆酶活性，之后，每天取样测定1次。
[0046] ④漆酶酶活测定方法酶活力的定义和具体的操作如下：
[0047] 【漆酶活力定义】定义lmin催化1M底物的酶量为一个酶活单位（U)。
[0048] 【操作步骤】准确移取100mM丙二酸-丙二酸钠缓冲液、0· 6mMABTS溶液各30mL， 混合，摇匀，30°C水浴。取上述混合试剂250μL置于容积为400uL的比色皿中，420nm处调 零准确加入待测酶液X(10μL)，立即记录吸光值，每隔10S记录1次，共7次，取变化平均 值，折算成每分钟的吸光度变化（〇D42。变化）。
[0049]【漆酶活力计算】每升酶液所含有的酶活量计算公式如下：
[0051] 其中，漆酶催化ABTS形成的产物摩尔吸光系数为36000mol·L·cm^
[0052] 实验结果进行直观分析可见，灵芝00679和灵芝51562两个菌株的漆酶活性远 远高于灵芝50044和灵芝50817两个菌株，四株灵芝在9d内分泌漆酶的平均活性分别为 2654U/L(00679)、1175U/L(51562)、1199U/L(50044)和 782U/L(50817)。酶活测定进一步分 析认为，灵芝00679产漆酶能力最强，培养4d后漆酶的活性达到2291U/L，培养lid达到最 高值3267U/L。因此，后续实验便采用灵芝00679作为材料进行一系列实验。
[0053] 本实施例包括以下步骤：
[0054] 1)灵芝漆酶基因（GILac)的克隆
[0055] 1. 1)灵芝菌丝体的培养、诱导及预处理：选用筛选的灵芝菌株00679为材料，用移 液器吸取5mL的液体菌种，加入盛有25mL产酶培养基的250mL的三角瓶中，置恒温摇床中， 28C，240rpm振荡培养约4d收集菌体，用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）处 理的dH20配制的PBS缓冲液清洗3次，滤干后迅速置于液氮中冻存lOmin，备抽总RNA和总 DNA〇
[0056] 1. 2)总DNA、总RNA的抽提和mRNA的纯化：灵芝DNA提取方法参照天根（TIANGEN) DNA(或RNA)提取试剂盒中标识的方法进行。
[0057]1. 3)基因组步移：采用基因组步移试剂盒（TaKaRa)，具体操作步骤由本领域技术 人员参考试剂盒说明书（TAKARA)和实际情况而定。
[0058] 1. 4)DNA的纯化、消化，连接和转化：按照本领域技术人员已知的常规方法，如相 应的试剂盒操作手册和相关文献进行。
[0059] 1.5)0嫩测序所得目的片段均克隆到？1?18_1'载体上，由生工生物工程（上海） 股份有限公司测序。
[0060] 以灵芝的总DNA为模板进行PCR，结果得到约1. 5kb的扩增产物，与预期结果的相 符。纯化后克隆到PMD-18T上，送上海博亚公司测序。测序结果经NCBI的BLAST比对正确 后，设计两组基因组步移引物：
[0061] primer 1，如SeqlDNo. 2 所示，即 5' -TGGCTGCGACCCGAGTTCA-3' 和
[0062] primer 2,如SeqlDNo. 3 所示，即 5' -TCGCCGCAGTCAACGCAGATCC-3'、
[0063] primer 3,如SeqlDNo. 4 所示，即 5' -CCCCGTCGTAGCGCAGGATCG-3' 和
[0064] primer 4,如SeqlDNo. 5 所示，即 5' -GGGCGGCGAAGATGTTGAGTGCTGT-3' 进行基因 组步移，得到其结构基因的5端和3端序列，然后根据结构基因两端的DNA序列设计引物：
[0065]primer5,如SeqlDNo. 5 所示，即 5'-ATGGCCAGACTTCAATCCTTTG-3' 和
[0066] primer6,如SeqlDNo. 5 所示，即 5'-AGCGCTCACTGGTCGTCGTTGG-3'，以灵芝总DNA 为模板进行PCR扩增得到其完整的结