一种玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属作物生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米mZmDEP基因和其表达抑 制结构在玉米抗逆育种中的应用。
【背景技术】
[0002] DEP1(denseerectpanicle1)基因是傅向东等在水稻中首先报道的（傅向东、 黄向忠钱前刘正斌，2008. 06. 05,直立密穗基因及其应用，申请号200810111529. 5,授权公 告号CN101597610B)，与水稻的直立密穗相关，命名为对D印1。2008年专利是该基因在 水稻直立密穗株型改造方面的应用，该专利要求保护突变的水稻直立密穗基因序列及其氨 基酸序列，以及具有编码相同多肽的其它核苷酸序列及其互补序列；该专利还要求保护利 用这些序列构建表达载体并用于生产转基因植物的方法，和这些多核苷酸序列和其构建体 及载体在提高作物植物抗倒伏能力、穗数和穗粒数、光合效率、或提高作物植物结实期群体 生长率或干物质生产量中的用途，其中所述的植物是水稻。稍后，傅向东等通过QTL分析， 在水稻第9号染色体SSR标记RM3700和RM7048之间检测到了一个氮高效利用相关的主效 QTL，将其命名为qNGR9(aQTLfornitrogengrowthresponsesinchromosome9)。利用 图位克隆的方法，他们将候选NGR9基因精细定位在14kb的区间内。通过测序比较分析， 确定了NGR9候选基因为已知的水稻高产基因DEP1，2011年他们将研究结果申请了中国和 美国的专利。该专利是该基因在提高农作物（水稻）的氮肥利用效率和光合作用效率、降 低农作物（水稻）株高增强抗倒伏性方面的应用（傅向东吴昆钱前张成伟刘学英王栓锁， 2011. 01. 27,直立密穗基因提高氮肥利用效率的新应用，申请号201110029759. 9,授权公告 号CN102174527B)。权利要求为"直立密穗基因的应用，其用于提高农作物的氮肥利用效 率，提高光合作用效率，降低农作物株高增强抗倒伏性，所述应用通过将直立密穗基因转入 所述农作物中生成转基因农作物而实现"。在说明书中，发明人报道了将构建的pUbi:cbpl 载体转化玉米，获得了过表达depl基因的玉米。过表达depl基因的玉米也同样表现出半 矮化表型，叶片颜色变为深绿色，光合效率比对照玉米提高25. 6%，叶片夹角变小，提出直 立密穗基因可以用来提高玉米的种植密度和增加群体光合作用，进而提高产量。在玉米中， 傅向东等克隆了 2个水稻DEP1基因的同源基因即玉米ZmDEPl-1和ZmDEPl-2。ZmDEPl-1同 水稻DEP1的相似性为52. 60%，同水稻cbpl的相似性只有37. 74% ;ZmDEPl-2同水稻DEP1 的相似性为36. 07%，同水稻cbpl的相似性只有31. 13%。
[0003] 进化树分析得出，水稻的DEP1所在的小组中包括1个水稻基因 (Os〇9T04419〇〇-〇l，即DEP1 基因）、3 个玉米基因（GRMZM2G00166〇,GRMZM2Gl7232〇 和 GRMZM2G028726)、3个小麦基因和2个高粱基因。与之最相近的拟南芥基因为AT5G20635 AGG3(ARABID0PSISGPROTEINGAMMASUBUNIT3)，编码一个非典型的异三聚体G蛋白γ 亚基，后者参与保卫细胞Κ+通道调节和形态发育，并对植物激素脱落酸刺激发生响应，可 能在植物抗逆机制中起有一定作用。根据氨基酸序列，水稻DEP1与玉米GRMZM2G001660 T01(对应于ZmDEPl-1)和GRMZM2G172320T01(对应于ZmDEPl-2)的相似性最高，其次与GRMZM2G028726T02 的相似性高。GRMZM2G001660 位于玉米 2 号染色体上，GRMZM2G172320 位于玉米7号染色体上，GRMZM2G028726位于玉米1号染色体上。这3个基因的功能目前 仍不清楚。
[0004] 2014年李建生等报道了基于ZmDEPl基因的玉米籽粒性状关联分析（白光红，李 林，杨小红，李青，吴鹏昊，李建生新疆农业大学学报，2014, 37 (5) :356~361)，他们通过同 源克隆的方法从玉米中克隆了与水稻籽粒产量相关基因OsDEPl的同源基因ZmDEPl，同时 发现该基因与玉米粒重相关的两个QTL(q300k20和qgrwt6,位于7. 02Bin)共定位，推测是 一个可能与玉米产量相关的候选基因。利用关联群体对该基因进行了候选基因关联分析， 发现该基因：VUTR的一个SNP位点S182在两种环境下都与粒重和籽粒体积相关，推测可 能是一个影响玉米粒重、体积的功能位点。但在检索的文献中，关于玉米mZmDEP基因和其 表达抑制结构（mZmDEP的反义结构和其RNAi结构）在玉米抗逆育种中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对目前的研究现状，本发明提供一种玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉 米抗逆育种中的应用。
[0006] 本发明所述玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中的应用：
[0007] 其中，所述玉米mZmDEP基因的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示；其编码的氨基酸 序列如SEQIDNo. 2所示；所述玉米mZmDEP基因的表达抑制结构是指SEQIDNo. 1所示核 苷酸序列的反义表达结构和SEQIDNo. 1所示核苷酸序列的RNAi结构，其中所述RNAi结 构是由SEQIDNo. 1的前628个核苷酸区域中的片段构建而成；所述玉米抗逆是指玉米的 耐旱性和耐盐性。
[0008] 本发明所述玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中应用的大体方 法是：在植物表达载体中分别插入mZmDEP基因过表达结构、mZmDEP基因反义表达结构、 ZmDEPRNAi结构，利用转基因技术将它们分别导入玉米细胞并再生植株，从其后代筛选出 抗逆高产转基因玉米株系，创制出具有耐旱性和耐盐性的玉米新品种。
[0009] 具体的，本发明所述玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中的应 用方法包括：
[0010] 玉米mZmDEP基因的克隆及序列分析
[0011] 从玉米自交系DH4866群体中发现了一个株型无明显变化的大籽粒植株。以其自 交后代的授粉16天果穗的籽粒分离总RNA，反转录产生cDNA。以已知与植物籽粒和产量相 关的基因序列为参照，设计多对PCR引物用于克隆基因。然后以cDNA为模板进行PCR扩增 反应，在引物 5 'GCGATATCATGGGGGAGGAGGTGGC3 ' 和 5 'GCGATATCTCAGCACAAGCATCCGG3 ' 的 组合中，扩增出约1200bp的条带（其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示）。将后者回收后重 组到T-easey载体中进行测序。分析测序结果得出，所克隆基因与Zeamaysclone442907 keratin-associatedprotein5-4mRNA同源，但序列上有明显差异。将所克隆序列翻译 成多肽，肽链长度明显小于keratin-associatedprotein5-4的。以该基因序列检测玉 米基因组测序资料，得出该基因可能是GRMZM2G172320的一个突变基因。同源基因检索发 现，在拟南芥AT5G20635/AGG3基因是其同源基因，后者在抗逆机制中起有作用，推测所克 隆基因也可能参与玉米对逆境的响应。在专利检索中，发现傅向东等报道的玉米ZmDEPl-1 和ZmDEPl-2基因与该基因同源，但在序列上与所克隆基因差异大，因此将该基因命名为 mZmDEP基因。
[0012] 植物表达载体构建
[0013] 采用定点重组或离体酶切重组技术将玉米mZmDEP基因的cDNA序列重组到植物 表达载体中，形成植物表达结构，用组成型启动子如玉米Ubiqintin基因启动子或胁迫诱 导型启动子如RD29B基因的启动子启动，用Ti质粒中胭脂碱合成酶基因Tnos序列或水稻 GluB5蛋白TgluB5序列终止转录。mZmDEP基因可以正义形式或反义形式插在基因表达框 中。在抑制表达结构构建中，将mZmDEP基因片段插入到以质粒pFGC5941为基础的经过改造 的植物表达载体中（该载体T-DNA区插入融合基因PCaMV35S: :mbar-Tnos，其中PCaMV35S 为花椰菜花叶病毒35SRNA启动子、用玉米偏倚的密码子代换的草丁膦抗性基因bar)，产 生干扰ZmDEP基因的RNAi结构ZmDEPRNAi。RNAi结构的两臂为互补的长度相等的mZmDEP基 因片段（在开放读码框的前631bp的片段中，可选取150~628bp长的片段）。mZmDEP融合 基因和ZmDEPRNAi结构分别重组到植物表达载体中用于玉米遗传转化，如重组到Mini-Ti 质粒中用于农杆菌为中介的玉米遗传