的一个重要限制因素。此外，在恢复浇水7天后，所有株系的净光合速率和气孔 导度值都有所增加，分别转mZmDEP正义或反义基因、或ZmDEPRNAi结构的株系中，均有一些 株系的净光合速率和气孔导度值都高于受体自交系的。干旱胁迫下更强的光合能力和复水 后更快的恢复速率表明，分别转mZmDEP正义或反义基因、或ZmDEPRNAi结构的株系，植株抗 旱能力得到明显提高。
[0028] 在干旱试验防雨棚中，对开花前玉米植株进行连续6周的干旱胁迫，然后恢复正 常浇水，在此期间观察了转基因植株与对照自交系植株在干旱胁迫下的表型变化，收获后 统计单株产量和小区产量。结果表明分别转mZmDEP正义或反义基因、或ZmDEPRNAi结构的 株系，植株的生长发育受影响较小，籽粒产量高。
[0029] 转基因植株的耐盐性检测
[0030] 在耐盐性检测中，将干燥的种子播于大小一致的砂盆（直径10cm，高15cm)中，分 别浇灌含不同浓度NaCl(0、lOOmM、150mM、200mM)的水溶液，2叶期后分别浇灌NaCl浓度不 变的1/2MS培养基无机盐溶液。各株系每浓度播30粒种子，即每盆6粒，5次重复。浇灌量 各盆之间保持一致，每天观察种子出苗状况和小苗的整齐度，并避免雨淋。15天、25天和35 天时分别统计种子出苗率（1片小叶露出沙子即认为出苗）、3叶期成活率和5叶期成活率。 盐胁迫处理过程中，测定处理植株和未处理（浇灌液中不加NaCl，即0浓度NaCl处理）植 株的生理指标，包括光合作用参数、离子含量、RWC、叶绿素含量、细胞溶质势、可溶性糖和脯 氨酸含量、细胞膜离子渗漏、丙二醛含量和生物量。测定结果表明，分别转mZmDEP正义基因 的株系、转mZmDEP反义基因的株系、转ZmDEPRNAi结构的株系，它们的种子在盐胁迫条件下 萌发率显著高于野生型的，小苗生长较好。其中部分株系在150mMNaCl浓度处理下萌发率 为95 %左右，约为受体自交系的2. 5倍，小苗受害较轻。若对5叶期小苗进行盐胁迫处理， NaCl浓度以每天50mM递增至终浓度200mM，然后每天浇灌一次，盐浓度不变。盐胁迫处理 15天后，转基因植株长势明显优于对照植株的，而受体自交系的小苗已受损严重，约半数死 亡。
[0031] 测定盐胁迫条件下不同株系小苗的生理参数的变化，得出无论转基因植株还是受 体自交系植株，叶片和根中的Na+含量都明显升高，K+含量先略有升高而后降低。与受体自 交系植株相比，转基因植株Na+增加量少，Κ+降低幅度小，部分株系的Na+、K+含量与受体自 交系相比差异显著，并且K+/Na+比值也显著高于受体自交系植株的。在盐胁迫条件下，所 有株系的叶绿素含量均是先有小幅度升高然后以不同速率下降，但分别转mZmDEP正义和 反义基因的株系、或转ZmDEPRNAi结构的株系，植株的叶绿素含量在处理期后期显著高于 受体自交系植株的。光合速率、气孔导度、胞间〇) 2浓度以及PSII光化学效率的测定结果 显示，在较长时间NaCl胁迫处理下，光合速率大幅度降低是由于气孔导度降低和PSII复 合体活性受抑共同造成的。但在盐胁迫处理中，分别转mZmDEP正义或反义基因的株系、或 转ZmDEPRNAi结构的株系，植株表现出明显较高的光合速率、气孔导度和最大光化学效率 (Fv/Fm)，即在盐胁迫处理中能合成较多的碳水化合物。
[0032] 盐胁迫条件下，叶细胞溶质势随着胁迫时间的增加而逐渐降低，但部分转基因株 系的溶质势显著低于受体自交系植株的，即具有更强的保水和吸收水分的能力。与受体自 交系植株相比，分别转mZmDEP正义或反义基因、或ZmDEPRNAi结构的株系，植株叶片含有较 多的可溶性糖和脯氨酸。这些结果表明，在盐胁迫条件下转基因株系细胞内积累了较多的 可溶性物质（包括Na+和脯氨酸及可溶性糖等），使细胞维持较低的溶质势，有利于细胞正 常代谢和光合作用以及植株的生长。在盐胁迫条件下，分别转mZmDEP正义或反义基因的株 系、或ZmDEPRNAi结构的株系，植株表现出较低的MDA水平和离子渗漏率，表明细胞膜受损 程度小于对照植株的，这与转基因植株有较高的PSII活性相一致。
[0033] 在滨海盐碱地种植的转基因株系和受体自交系的试验结果显示，一些转mZmDEP 正义或反义基因、或ZmDEPRNAi结构的株系，在盐碱地中的存活和生长发育明显优于受体 自交系的，单株绿叶数高于受体自交系的，经济性状如单株穗重及产量等显著优于受体自 交系，表现出显著提高的耐盐性。
[0034] 综合干旱和高盐胁迫条件下不同株系植株的生理指标和产量上的差异，得出转 mZmDEP正义或反义基因、或转ZmDEPRNAi结构的株系，在植株遇到胁迫时细胞溶质含量增 加幅度较大，减少了细胞水分的流失，细胞膜损伤小，光合能力较强，植株的生长发育受影 响较小，因此籽粒产量高，表现出明显改善的抗旱性和耐盐性，与受体自交系植株相比能够 更好地适应胁迫环境。
[0035] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构 (mZmDEP的反义表达结构和其RNAi结构）在玉米抗逆育种中的应用。虽不清楚mZmDEP 基因在玉米中的作用，本发明公开的基因在与高等植物组成型启动子（花椰菜花叶病毒 CAMV35SRNA基因启动子P35S、或玉米Ubiquitinl基因启动子Pubi)融合后，分别以mZmDEP 正义和反义基因形式或ZmDEPRNAi结构的形式转入玉米，转基因株系表现出显著提高的抗 旱性和耐盐性，提高了玉米植株对环境的适应性，能在常规栽培条件下提高玉米的籽粒产 量，在玉米育种中有很好的应用价值。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1 :过表达玉米mZmDEP基因创造玉米抗旱自交系
[0037] l)mZmDEP基因过表达载体的构建采用定点重组技术将重组到入门载体pENTRll 的玉米mZmDEP基因的cDNA序列重组到植物表达载体pB7WG2. 0-P35S: :bar-Tnos_Pubi::M CS-Tnos中，产生植物转化载体pB7WG2. 0-P35S: :bar-Tnos-Pubi: :mZmDEP-Tnos。利用冻融 法将后者导入根瘤农杆菌LBA4404中，并采用PCR法进行鉴定。
[0038] 2)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、 6WC等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所 用培养基有：
[0039] A培养基：用于种子萌发，包括KN03 1 900mg/l，NH4N03 1 6 50mg/l，CaCl2 · 2H20 440mg/l，MgS04 · 7H20 370mg/l，KH2P04 ·H20 170mg/l，FeS04 · 7H20 27. 8mg/l，ZnS04 · 7H20 10mg/l，MnS04 · 4H20 22. 3mg/l，H3B03 10mg/l，KI0· 83mg/l，Na2Mo04 · 2H20 0· 5mg/l， CuS04 · 5H20 0· 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0· 025mg/l，盐酸硫胺素 20.Omg/1，盐酸吡哆醇 1.Omg/ 1，烟酸 1.Omg/1，肌醇 100.Omg/1，蔗糖 20g/l，琼脂粉 7g/l，pH5· 8 ~6· 0。
[0040] Β培养基：Α培养基附加生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，脯氨酸200mg/ 1，鹿糖l〇g/l, 6-BA4. 5 ~9. 0μmol/1 和 2,4一D1. 0 ~3. 0μmol/1，用于诱导离体培养 芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。液体培养基则去掉琼脂粉。
[0041] C培养基：A培养基附加生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，脯氨酸200mg/ 1蔗糖l〇g/l，6-BA4. 5μπιο?/?和IBA(吲哚丁酸）1. 8μπιο?/?，用于丛生芽组织块分化小 苗。
[0042]D培养基：Α培养基附加酪蛋白水解物200mg/l，蔗糖10g/l，6-ΒΑ2. 25~ 4. 5ymol/l和IBA3. 6~4. 5ymol/l，用于丛生小芽发育成小苗。
[0043] Ε培养基：Α培养基附加ΙΒΑ2. 8~5. 6μπιο1/1，用于无根小苗生根。
[0044] 培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在 培养基灭菌后加入。
[0045] 种子灭菌和萌发：玉米种子用70%乙醇浸泡8分钟，再用0. 1 %氯化萊浸泡10~ 15分钟，然后用无菌水洗涤3~5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无 菌水，封口后放在黑暗条件（23~28°C)下1-2天。萌动（露白）后种子放在Α培养基上 于黑暗条件下继续萌发。
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