一种有效抑制小鼠pdk2表达的rna干扰序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序 列，还设及该RNA干扰序列的应用。
【背景技术】
[0002] 线粒体中的丙酬酸脱氨酶复合体（pyruvatedehy化ogenaseComplex,PDC)能够 催化丙酬酸氧化脱簇生成NADH和乙酷辅酶A,并把糖酵解与Ξ簇酸循环W及ATP的生成紧 密地联系在一起。运一重要反应对于需要大量ATP的组织（如大脑、肌肉）来说至关重要。 通过PDC产生的乙酷辅酶A对于肝脏、脂肪运样能够产生脂肪的组织来说也是非常重要的， 因为线粒体中的乙酷辅酶A可W通过形成巧樣酸（胞体乙酷辅酶A前体）进入到脂肪酸的 合成过程。正是因为葡糖和脂肪酸之间存在运种底物竞争，所W高活性的PDC能够通过抑 制肉毒碱栋桐酷基转移酶来限制线粒体脂肪酸的摄取。由于在哺乳动物中不存在由乙酷辅 酶A逆转生成葡萄糖的通路，因此在葡萄糖缺乏的时候抑制PDC的活性对于葡萄糖的转化 至关重要。在肝糖元耗竭时，PDC反应的底物-丙酬酸作为葡萄糖合成的前体是肝脏和肾糖 异生所必须的。运就使得血糖维持在一个稳定的水平，W保证不能够使用其他底物的组织 获得ATP。除了脂肪酸氧化的产物（乙酷辅酶A和NADH)对PDC的异构抑制外，丙酬酸脱氨 酶激酶（Pyruvatedehy化ogenasekinase,PDK)通过憐酸化PDC也可W抑制其活性。PDC 被PDK憐酸化失活后限制了丙酬酸被完全氧化或转变成脂肪酸。同时，通过抑制PDK来增 加PDC的活性也是治疗糖尿病、屯、脏病W及肿瘤的药物祀点。
[0003] PDC是含有3个组分的复合体。运3个组分能够催化丙酬酸生成乙酷辅酶A:丙 酬酸脱氨酶（pyruvatedehy化ogenase，E1)、二氨硫辛酷胺乙酷基转移酶（dihy化olipoyl transacetylase，E2)W及二氨硫辛酷胺脱氨酶（dihy化olipoamidedehy化ogenase， E3)。El催化生理可逆的步骤：PDKW及丙酬酸脱氨酶憐酸酶（pyruvatedehy化ogenase 地os地at巧hosphatases，PD巧调节的正是运一活性。PDK和PDP催化可逆的憐酸化（失 活）和去憐酸化（激活）循环反应。E1的憐酸化主要发生在3个特异的位点：264位丝氨 酸（位点1)、271位丝氨酸（位点2)、203位丝氨酸（位点3)。位点1的憐酸化速度最快， 而位点3的憐酸化速度最慢。因此，位点1的憐酸化是根据代谢需要快速调节活性PDC比 例的主要位点。
[0004] 在人类和晒齿类动物中目前鉴定出有4种PDK同工酶：PDK1、PDK2、PDK3W及 PDK4。其中PDK1在屯、脏、膜岛和骨骼肌中被检测到。而PDK2分布最广，在屯、脏、肝脏和肾 脏中高水平表达。PDK3组织表达相对较局限（睾丸、肾脏和脑）。PDK4在屯、脏、氧化型肌 肉、肝脏和肾脏等组织中高丰度表达。E1憐酸化位点突变分析表明，4种PDK都可W憐酸化 位点1和位点2 ;而位点3只能被PDK1憐酸化。对于位点2，PDK4比PDKUPDK2和PDK3现 出更高的活性。PDK2可能通过憐酸化位点1来短期抑制PDC。如果PDK对于PDC的运种憐 酸化调节异常，通常会引起一些人类疾病。 阳〇化]葡萄糖代谢产物能够高度调节PDK的活性。乳酸（由糖酵解产生或是血液循环 中）代谢产生的El的底物丙酬酸、NAD+W及辅酶A都对PDK活性起到抑制作用。而线粒 体中PDC反应和脂肪酸氧化的产物乙酷辅酶A及NADH能够激活PDK。故而，增加线粒体中 NADH/NAD+W及乙酷辅酶A/辅酶A的浓度比例可W增加PDK的活性。营养条件和激素能够 改变PDK的表达而影响葡萄糖-脂肪平衡。低血糖能够促使膜岛素的浓度降低从而使得脂 肪分解增加，并最终导致脂肪酸氧化水平增高、葡萄糖的利用降低W维持血糖平衡。膜岛素 在调节血糖中具有重要作用，它能促进葡萄糖氧化利用、抑制脂肪分解的作用。因此，饥饿 诱导的膜岛素水平降低可W加剧脂肪组织中来源于Ξ酷甘油的脂肪酸氧化代谢。给饥饿过 夜的大鼠注入膜岛素化后，骨骼肌中的PDK4在mRNA水平减少了 72%，同时在蛋白质水平 减少了 20%，而膜岛素憐酸化Akt和F0X01则在其中发挥了重要作用。
[0006] 由于PDK2表达组织广泛，同时其参与了肿瘤、I型糖尿病及肝炎等的病理进程。因 此，特异抑制PDK2已经成为了运些疾病的新治疗祀标。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序 列；本发明的目的之二在于提供含有所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体；本发明的目的 之Ξ在于提供所述RNA干扰序列的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述RNA干扰序 列或所述慢病毒载体在抑制小鼠PDK2表达中的应用；本发明的目的之五在于提供所述RNA 干扰序列或所述慢病毒载体在促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌中的应用。
[0008] 为实现上述发明目的，经过大量实验，本发明提供如下技术方案：
[0009] WPCR法扩增小鼠PDK2分子全长的核巧酸序列（Genebank:NM_133667. 2;GI: 226958642)，使用生物信息学及研究计算软件化ttp://si;rna.wi.mit.edu/home.地p)结 合DNAstar对PDK2的RNAi干扰序列进行预测。获得两个针对PDK2的特异性RNAi序列 (命名：PDK2RNAi-l和PDK2RNAi-2)，具体如沈QIDNO. 3的第5~52位所示或如沈QID NO. 5的第5~52位所示。
[0010] 然后使用全基因合成方法合成RNAi序列，将SEQIDNO. 3与SEQIDNO. 4,或SEQ IDNO. 5与沈QIDNO. 6退火形成双链，然后经EcoRI和化cl酶切位点连入GVl15慢病毒 表达质粒，构建GV115慢病毒表达质粒。
[0011] 对所获得慢病毒表达载体进行测序，正确无误后与包装质粒化Iper1. 0共转染 293T细胞，收集上清并浓缩，获得病毒颗粒。然后转染宿主细胞如RAW264. 7细胞，结果显示 转染细胞PDK2的表达受到显著抑制，其中PDK2RNAi-2效果最佳。此外，抑制PDK2表达可 促进RAW264. 7细胞线粒体活性氧（mtRO巧的分泌。
[0012] 因此，所述RNA干扰序列或慢病毒载体可W用于抑制小鼠PDK2表达的应用。也可 W将RNA干扰序列或所述慢病毒载体在促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌中的应用。 其中表达PDK2细胞优选为巨隧细胞。
[0013] 本发明的有益效果在于：本发明获得了有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序列， 能够显著干扰小鼠PDK2的表达，并且抑制PDK2表达可促进RAW264. 7细胞线粒体活性氧 (mtRO巧的分泌，能够提高细胞活性，增强免疫，能够用于肿瘤、I型糖尿病及肝炎等疾病的 治疗。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015] 图1为慢病毒表达载体GV115载体图谱。
[0016]图2为第1条RNAi慢病毒转染效率进行分析，提示在M0I= 0. 1的条件下，其能 与有效感染Raw264. 7细胞（其中绿色为载体表达的GFP蛋白）。
[0017]图3为第2条RNAi慢病毒转染效率进行分析。提示在M0I= 0. 1的条件下，其能 与有效感染Raw264. 7细胞（其中绿色为载体表达的GFP蛋白）。
[0018] 图4经RNAi干扰后RAW264.7细胞表达PDK2的Western-blot分析。
[0019] 图5经RNAi干扰后RAW264. 7细胞表达PDK2的qPCR分析。 W20] 图6为流式细胞术（FACs)分析表明，经RNAi干扰PDK2表达后，LPS可促进RAW264. 7细胞mtROS的分泌。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第Ξ版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 实施例1、小鼠PDK2特异性RNAi预测
[0023]根据小鼠PDK2 基因全长的核巧酸序列（Genebank:NM_133667. 2 ;GI:226958642)， 获得其编码框序列，具体如SEQIDNO. 1所示，氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0024] 然后根据生物信息学及计算软件化ttp://si;rna. wi. mit. edu/home.地p)结合 DNAstar软件对PDK2的RNAi干扰序列进行预测。获得两个针对PDK2的特异性RNAi序列。
[0025] 获得的针对小鼠PDK2的特异性RNAi其序列分别是：
[0026] PDK2RNAi-l：
[0027] siPdk2-F:aatt邑a邑aa邑ac邑tcattcactttcctc邑a邑邑aaa邑t邑aat邑ac邑tcttctcttttttta t佛Q ID NO.3);
[0028]siPdk2-R:曰曰曰曰曰曰曰邑曰邑曰曰邑曰c邑tc曰ttc曰ctttcctc邑曰邑邑曰曰曰邑t邑曰曰t邑曰c邑tcttctc(SEQ IDNO. 4)ο
[0029]PDK2RNAi-2 ：
[0030]siPdk2-5F:aattaaacacattggcagcatcgatctcgagatcgatgctgccaatgtgtttttttttt at佛QIDNO. 5);
[0031] siPdk2-5R:曰曰曰曰曰曰曰曰曰曰c曰c曰ttggc曰gc曰teg曰tctcg曰g曰teg曰tgctgcc曰曰tgtgttt(SEQ IDNO. 6) 〇
[0032] 各部分功能如表1所示。
[0033]表1、PDK2的特异性RNAi序列各部分结构
[0034]
[0035] 使用全基因合成万法合成SEQIDNO. 3~SEQIDNO. 6所示序列，并在两端分别 加入EcoRI及化cl酶切位点，分别将沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4,SEQIDNO. 5和沈QID NO. 6退火后连接入GV115慢病毒表达质粒（图1)，获得重组慢病毒表达质粒，分别命名为 GV115 :PDK2RNAi-l和GV115 :PDK2RNAi-2,然后对重组慢病毒表达质粒经测序确认无误后 与包装质粒化Iper1. 0共转染293T细胞，收集上清并浓缩，获得慢病毒颗粒。
[0036] 实施例2、小鼠PDK2特异性RNAi对RAW264. 7细胞PDK2分子表达沉默的分析及验 证
[0037] 小鼠巨隧细胞^胖264.7细胞病毒感染：在6孔板中生长的^胖264.7细胞，70% 铺满细胞底后，加入实