一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及属于分子生物学技术领域，具体设及一种扩增禽流感病毒全基因组的 引物体系及方法。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒简称流感病毒，是危害最大的人兽共患病病原，至今不仅给养禽、 畜牧业带来灾难性的破坏，造成巨大的经济损失，而且常引起世界性人流感大流行，严重危 害人类生命健康。流感病毒分为A、B、CΞ型，其中A型流感病毒危害最大，分布最广，且W 禽为敏感宿主。A型禽流感病毒基因组分为8个节段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS，表达12 种蛋白，运12种蛋白分别在病毒吸附、融合、转录翻译及新一代病毒粒子释放中各司其职。 其中诱导家禽等宿主机体产生中和抗体的主要表面抗原血凝素化emagglutinin，HA)、神经 氨酸酶（Neuraminidase,NA)种类分为不同亚型，迄今所发现有17个HA亚型化1~化6)， 10个NA亚型（N1~N10)，HA/NA的多亚型、不断变异，W及内部基因的交叉重组给流感病 毒防治带来困难。
[0003] 尤其是近年来出现的册N1亚型禽流感、W及2009年的化N1大流感、2013年3月 出现的新亚型禽流感H7N9等事件愈演愈烈。目前，H10N8、册N6、册N8等众多新亚型不断出 现。运种频繁变异重组给传统的HI检测、特异HA/NA引物检测方法带来了困难。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用性广的扩增各亚型禽 流感病毒全基因组的引物体系。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全基因组的 引物对：
[0007] Uaiv-F：agcraaagcagg；
[0008] Ua"-R:AGTAGAAACAAGG。
[0009] 作为优选，还包括扩增禽流感病毒8个节段的引物对：
[0010] PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC ；
[0011] PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；
[0012] PBl-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG ；
[0013] FBl-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；
[0014] PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC ；
[0015] PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；
[0016] HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；
[0017] HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT； 阳0 化]NP-F:AGCRMAGCAGGGTT
[0019] 或AGCRMAGCAGGGTT A ;
[0020]NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT； 阳02U NA-F :AGCAAAAGCAGGAGT ;
[0022] NA-R ：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；
[0023] M-F ：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；
[0024] M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT； 阳0巧]NS-F :AGCAAAAGCAGGGTGAC ;
[0026] NS-R :AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
[0027] 一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，W上述Uaiv-F和UAIV-R为引物对病毒RNA 进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。 阳02引作为优选，上述方法的RT-PCR反应体系如下：10. 0 yL病毒RNA、10. 0 μ L5*buffer、10. 0 μ L lOmM dNTP、1. 0 μ LUa"-F、1. 0 μ LUa"-R、1. 0 μ L酶、DEPC &0 补足50. ΟμΙ ;
[0029] 其中，Uaiv-F与Uaiv-R的浓度均为lOpmol/μL。
[0030] 作为优选，上述方法的RT-PCR反应条件如下：58°C30min，94°C预变性3min，然后 加入循环：94°C30s，48°C30s，72°C7.Omin;进行 35 个循环后，72°ClOmin。
[0031] 一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括W下步骤： 阳03引 1)cDNA的合成：WRT引物AGCRMAGCAGG为反转录引物，对病毒RNA进行PCR，合 成cDNA;
[0033] 2)8个节段的扩增cDNA为模板，分别使用上述8个节段的引物对进行PCR反 应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物；
[0034] 扣拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序， 拼接，得到禽流感病毒全基因组。
[0035] 作为优选，步骤2)中，PCR反应体系如下：12. 5μLTakarapremixExTaq、0. 5μL F引物、0. 5μΙR引物、cDNAO. 5μレ灭菌双蒸水补足25.ΟμΙ;
[0036] 所述F引物和R引物的浓度均为1化mol/μL。
[0037] 作为优选，其PCR反应条件如下：95 °C预变性5min，然后进入循环：94°C30s， 48-58Γ30s，72°Cl-3min，35 个循环后，72°ClOmin。
[0038] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0039] 经过对众多A型流感病毒基因组进行比对分析，发现所有A型流感病毒基因组 vRNA8个节段的5'末端的13个核巧酸及3'末端的12个核巧酸高度保守，5'末端的核巧 酸序列为AGUAGAAACAAGA，3'末端的核巧酸序列为UCGUCUUUGUCC;由于每一个RNA节段的 5'末端和3'末端分别有部分序列互补，使病毒RNA环化形成锅柄样的结构，W保护病毒基 因组。本发明提供的扩增各亚型禽流感病毒全基因组的引物体系是针对亚型禽流感病毒高 度保守序列设计的，既包括了上述禽流感病毒的基因组，还包括了两端极其保守的非编码 区，其中包括一对扩增各亚型禽流感病毒全基因的引物对，可采用一步法快速地获得禽流 感病毒基因组，另外8对分别用于扩增8个节段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS的引物对，可 选择性地对8个节段进行扩增并拼接得到禽流感病毒基因组。
[0040] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0041]图1为采用一步法RT-PCR扩增禽流感病毒全基因组的凝胶电泳图； 阳0创 图2为H7N9和H9N2的PCR扩增禽流感病毒8个节段的凝胶电泳图；
[0043] 图3为册N8病毒的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0044] W下实施例中，所采用的PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统均为常规设备，所 用试剂如未特殊说明，均为市售或通过常规的实验方法获得。
[0045] 要施巧1[ 1 ;病料的米用与病毒的分齒
[0046] 1)病料的采集
[0047] 无菌采集病禽泄殖腔拭子和气管拭子；气管、肺脏、肠道及肠道内容物、肝脏、脾 脏、肾脏和脑等组织的混合样品。
[0048] 2)病毒的分离
[0049] 采集的泄殖腔拭子和气管拭子先浸在灭菌生理盐水中，将鼻拭子在管壁反复挤压 后取出，充分振荡管中液体，加入适量抗生素，室溫静置作用30m，4000巧m罔屯、5min，取上 清液，迅速用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，-70°C保存。
[0050] 采集的病料组织，如：气管和肺脏等组织，首先用灭菌的玻璃研磨器在无菌的条件 下研磨，用化证3液制成10%匀浆，加入双抗至最终浓度分别为20001]/1^和200011肖/1^， 4°C感作4h后，取液，迅速用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，-70°C保存。
[0051] 上述处理的病料上清液经尿囊腔羊膜腔双腔接种9-lldSPF鸡胚，0.2血/胚， 37°C解育，每天照蛋2次，连续观察6天，弃去24h污染死胚。将死亡或溯死鸡胚置4°C地 W上，剖检，观察胚胎病变、收获尿囊液，取尿囊液，用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，得到 病毒总RNA，-70°C保存。
[0052] 本实施例中，采用TaKaRa公司病毒总RNA提取试剂盒提取病毒总RNA。 阳化引 连施例2:-巧法RT-PCR扩蜡禽流威病毒仓基闲紀
[0054]RT-PCR反应体系：10. 0μL病毒总RNA、10. 0μL5*buffer、10. 0μLlOmMdNTP、1. 0μLUaiv-F、1. 0μLUaiv-R、1. 0μL酶、DEPC&0 补足 50. 0μL; 阳化引其中，Uaiv-F与Uaiv-R的浓度均为lOpmol/μL。
[0056]RT-PCR反应条件：58°C30min，94°C预变性 3min，然后加入循环：94°C30s， 48°C30s，72°C7.Omin;进行 35 个循环后，72°ClOmin。取加^RT-PCR产物于 1. 5% 的琼脂 糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测有梯度7条带，对H9N2亚型某毒株的扩增结果如图 1所示。克隆后测序或者直接测序。
[0057]图 1 中，Ml泳道为DL5000DNAMarker;
[0058] 1泳道为H9N2亚型某毒株全基因组，其中，PB2/PB1 2：34化P、PA2233bp、HA 1742bp、NP156化p、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，120v 条件下电泳30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、Μ和NS四条带型；电泳2h，PB2/PB1 与PA，HA、NP与ΝΑ均可W分开。
[0059] 2泳道为Η7Ν9亚型某毒株全基因组，其中，ΡΒ2/ΡΒ1 2：34化Ρ、ΡΑ2233bp、 HA1683bp、NP156化p、NA1398bp、M102化p、NS890bp。其电泳条件为：1%琼脂糖凝胶， 120v条件下电泳30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四条带型；电泳化，PB2/ PB1与PA，HA、NP与NA均可W分开。
[0060] 3 泳道为册N2 亚型某毒株全基因组；PB2/PB1 2：34化P、PA2233bp、HA1779bp、NP 156化p、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，120v条件下电泳 30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四条带型；电泳化，PB2/PB1 与PA，HA、NP 与ΝΑ均可W分开。
[0061] 4泳道为阴性对照；
[0062]M2 泳道为：DL2000DNAMarker。
[0063] 连施例3:二巧法PCR扩蜡禽流威病毒仓基闲紀
[0064] 1)cDNA的合成： 阳0化]W RT引物AGCRMAGCAGG为反转录引物，对病毒总RNA进行PCR，合成cDNA;
[0066] 其中，该PCR的反应液如表1所示：
[0067] 表1基因组cDNA合成反应液
[0068]
W例将上述反应液混匀后，于70°C水浴5min，冰上冷却2min，加入到表2所述体系中进 行反应：
[0070] 表2基因组cDNA合成反应体系
[0071]
[0072] 室溫下放置10min，55°C水浴70min，94°C作用5min，反应产物直接进行PCR扩增 或-20°C保存备用，得到cDNA。
[0073] 2) 8个节段的扩增：W cDNA为模板，分别使用上述的8个节段的引物对进行PCR反 应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物； 阳074] 其中，PB2节段PCR反应体系如表3所示，为25μL体系：
[0075] 表3 ΡΒ2节段PCR反应体系
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