0077]PB2节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min30s，共进行34个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0078] PB2节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电 泳30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。 阳0巧]其中，PB1节段PCR反应体系如表4所示，为25μL体系： W80] 表4ΡΒ1节段PCR反应体系
[0081]
阳0間 ΡΒ1节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，49°C退火30s， 72°C延伸3min，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0083]PB1节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电 泳30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。
[0084] 其中，PA节段PCR反应体系如表5所示，为25μL体系：
[0085] 表5ΡΑ节段PCR反应体系
[0086]
[0087] ΡΑ节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，49°C退火30s， 72°C延伸3min，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0088] PA节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测。将目的条带送交测序或克隆后测序。 阳089] 其中，HA节段PCR反应体系如表6所示，为25μL体系：
[0090] 表6ΗΑ节段PCR反应体系
[0091]
[0092]HA节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min30s，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0093]HA节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
[0094] 其中，NP节段PCR反应体系如表7所示，为25μL体系：
[0095] 表7ΝΑ节段PCR反应体系
[0096]
[0097] 阳09引 ΝΡ节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min30s，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0099]NP节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
[0100] 其中，NA节段PCR反应体系如表8所示，为25μL体系：
[0101] 表8ΝΑ节段PCR反应体系 阳102]
阳103] ΝΑ节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0104]ΝΑ节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。 阳1化]其中，Μ节段PCR反应体系如表9所示，为25μL体系：
[0106]表9Μ节段PCR反应体系 阳107]
[0108] Μ节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸Imin30s，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0109] Μ节段凝胶电泳条件：将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
[0110] 其中，NS节段PCR反应体系如表10所示，为25μL体系： 阳111 ] 表10NS节段PCR反应体系 阳112]
阳11引NS节段PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin30s，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0114] NS节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1 %的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳 30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。
[0115] 3)拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序， 拼接，得到禽流感病毒全基因组。 阳11引檢测例1 :
[0117] 采用实施例3提供的方法对H7N9基因组扩增，其节段PCR反应程序如表11所示，
[0118] 表11H7N9基因组8个节段扩增试验及产物长度 阳119]
阳120] 将5μΙPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检ii，其凝胶 条带如图2所示，其中，Μ泳道为DL2000DNAMarker;l泳道为H7N9PB2 234化p;2泳 道为H7N9PB1 234化p;3 泳道为H7N9PA2233bp;4 泳道为H7N9HA1683bp;5 泳道为NP 1565bp;6泳道为NA1398bp;7泳道为Μ1027bp;8泳道为NS890bp;9泳道为阴性对照； 10泳道为空白。将目的条带送交测序或克隆后测序后拼接。
[0121] 粉·测例2：
[0122] 采用实施例3提供的方法对H9N2基因组扩增，其节段PCR反应程序如表12所示，
[0123] 表12H9N2基因组8个节段扩增试验及产物长度 阳124]
阳12引将5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检ii，其凝胶条 带如图2所示，11泳道为H9N2PB2 234化p;2泳道为H9N2PB1234化p;3泳道为H9N2PA 2233bp;4 泳道为H9N2HA1742bp;5 泳道为H9N2NP1565bp;6 泳道为H9N2NA1458bp;7 泳道为H9N2Μ1027bp;8泳道为H9N2NS89化P。将目的条带送交测序或克隆后测序后拼 接。
[012d粉·测例3：
[0127] 采用实施例3提供的方法对册亚型基因组扩增，其节段PCR反应程序如表13所 示，
[0128] 表13基因组8个节段扩增试验及产物长度 阳129]
[0130]将5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，册N8病毒 的凝胶条带如图3所示，Μ泳道为化2000DNAMarker;l泳道为PB2 234化p;2泳道为PB1 234化口；3泳道为口422336口；4泳道为齡177抓口；5泳道为^ 15656口；6泳道为臟14136口； 7泳道为Μ1027bp;8泳道为NS890bp;9泳道为阴性对照。 阳131] 由检测例的结果可知，本发明是可适用于所有禽流感病毒全基因组扩增，既包括 了上述病毒的基因组，还包括了其它亚型禽流感病毒基因组两端极其保守的非编码区，本 专利扩增引物为禽流感病毒通用检测引物及方法，不局限于已知或某个亚型，即通用于 化-H16,NA1-NA10所有亚型；因此，该通用引物和方法可应用于新亚型的预警和不同亚型 的分别和筛查，在流行病学调查和公共卫生方面新亚型的筛查有重要意义和实际应用价 值。
[0132] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能W此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全基因组的引 物对： uaiv-f ：agcraaagcagg；uaiv-r：agtagaaacaagg〇2. 如权利要求1所述的扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，还包括扩增禽流感病毒 8个节段的引物对： PB2-F ：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC； PB2-R ：AGTAGAAACAAGGTCGTTT； PB1-F ：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG； FB1-R ：AGTAGAAACAAGGCATTT； PA-F ：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC； PA-R ：AGTAGAAACAAGGTACTT； HA-F ：AGCRAAAGCAGGGGT； HA-R ：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT； NP-F ：AGCRAAAGCAGGGTT或AGCRAAAGCAGGGTTA ; NP-R ：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT； NA-F ：AGCAAAAGCAGGAGT； NA-R ：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT； M-F ：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG； M-R ：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT； NS-F ：AGCAAAAGCAGGGTGAC； NS-R :AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。3. -种扩增禽流感病毒全基因组的方法，以如权利要求1所述的UAIV-F和UAIV-R为引 物对病毒RNA进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应体系如下：10. Ο μ L病毒RNA、 10. 0 μ L 5*buffer、10. 0 μ L 10mM dNTP、1. 0 μ L Uaiv-F、1. 0 μ L Uaiv-R、1. 0 μ L酶、DEPC Η20 补足50.0yL ; 其中，UAIV-F与UAIV-R的浓度均为lOpmol/ μ L〇5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应条件如下：58°C30min， 94°C预变性3min，然后加入循环：94°C30s，48°C30s，72°C7.Omin;进行35个循环后， 72°C10min〇6. -种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括以下步骤： 1. cDNA的合成：以RT引物AGCRAAAGCAGG为反转录引物，对病毒RNA进行PCR，合成 cDNA； 2) 8个节段的扩增：以cDNA为模板，分别使用权利要求2所述的8个节段的引物对进 行PCR反应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物； 3) 拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序，拼接， 得到禽流感病毒全基因组。7.如权利要求6所述的方法，步骤2)中，PCR反应体系如下：12. 5 μ L Takara premix Ex Taq、0.5yL F引物、0.5yL R引物、cDNA 0.5yL、灭菌双蒸水补足25.0yL; 所述F引物和R引物的浓度均为lOpmol/ μ L。8.如权利要求6所述的方法，其PCR反应条件如下：95°C预变性5min，然后进入循环： 941€3〇8,48-581€3〇8,72。(：1-3111丨11，35个循环后，72。(：1〇11^11。
【专利摘要】本发明提供一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系和方法，具体地，该引物体系包括1对扩增禽流感病毒全基因组的引物对UAIV-F和UAIV-R，以及8个节段引物对；上述引物对均包含正向5ˊ-AGCRAAAGCAGG和反向3ˊ-AGTAGAAACAAG序列。该方法之一为以病毒RNA为模板，用UAIV-F和UAIV-R进行一步法RT-PCR扩增得到禽流感病毒全基因组；该方法之二为以病毒RNA为模板扩增得到cDNA，再分别以8个节段引物对扩增禽流感病毒全基因组8节段。本发明是可适用于所有禽流感病毒全基因组扩增，既包括了上述各亚型禽流感病毒的基因组以及其两端极其保守的非编码区，适用性广。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105368833
【申请号】CN201510932863
【发明人】陈瑞爱, 罗琴芳, 赖汉漳, 黄文科, 刘玉鹏, 张东霞, 张爱国, 刘郁夫
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司, 广东温氏大华农生物科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月14日