基于kasp技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心snp标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体地说，设及一种基于KASP技术开发的用于棉花 杂交种鉴定的核屯、SNP标记。
【背景技术】
[0002] 棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民 生活水平的提高具有重要意义。近年来，随着棉花杂交育种工作的迅速开展，加上杂交种所 表现出的杂种优势，棉花杂交种在我国得到了广泛的推广与种植。棉花杂交种具有高产、优 质、抗逆性强等优良特征特性，一般较常规品种增产15%左右。然而，棉花杂交种生产为劳 动密集型产业，制种成本相对较高，杂交种子棉收购价格一般是普通常规棉种的4-5倍，受 利益的驱动，即使在管理严格的情况下，W常规种（或亲本）冒充杂交种、或其他杂交种冒 充杨销杂交种等渗杂使假的现象仍时有发生。依据形态性状进行杂交种田间鉴定的传统手 段时效性差，且容易受到环境与主观因素的影响，杂交种市场混乱的局面难W得到有效控 制。
[0003] 近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和 蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能掲示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自 动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。国际植物新品种保护联盟0JP0V)于2010年发 布了DNA分子标记选择和数据库构建指南（简称BMT指南），并指出SSR和SNP标记是特别 适用于品种鉴定的方法。SSR标记具有多态性高、呈共显性等优点，在品种鉴定工作中得到 比较成熟且广泛的应用。但在实践过程中，也暴露出其检测位点较少、结果代表性较差、不 宜实现数据共享等难W克服的缺陷。SNP标记作为第Ξ代分子标记，与SSR标记相比具有W 下优势：一是在基因组中密度更高分布更均匀；二是更适合数据库整合和数据共享；Ξ是 与功能基因甚至植物表型关联度高。因此，SNP标记目前被公认是极具应用前景的分子标记 技术。SNP位点有基于测序、忍片及PCR等各种平台的检测方法。其中，KASP(Kompetitive AlleleSpecificPCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹 配来对SNP分型W及检测InDels(InsertionsandDeletions,插入和缺失），可在广泛的 基因组DNA样品中（甚至是一些复杂基因组的DNA样品），对SNPs和特定位点上的InDels 进行精准的双等位基因判断，该技术具有高度稳定性与准确性的特点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核屯、SNP ^|^记。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定 的核屯、SNP标记，所述核屯、SNP标记的编号分别为CS01~CS26,它们的信息见表1 :
[0006] 表1用于棉花杂交种鉴定的核屯、SNP标记的位点信息
[0007]
[οοοδ~~表1中SNP物理位置是基于陆地棉遗传标准系ΤΜ-1的全基因组序列而确定 的，所述陆地棉ΤΜ-1全基因组序列的版本号为ΝΒΙ G. hirsutum genome化ttps://丽W. cottongen.org/)。
[0009] 本发明还提供用于PCR扩增所述核屯、SNP标记的引物，所述引物序列信息见表2:
[0010] 表2用于PCR扩增所述核屯、SNP标记的引物序列信息
[0011]
[0012] 本发明提供的KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASPPrimermix和 通用的KASPMastermix加入到含有DM样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终 结果采用巧光检测仪进行PCR产物分析即可。
[0013] 所述KASPPrimermix含有Ξ种特异性的引物：带有两种通用标签并连接SNP位 点的两条正向引物（正向引物1和2)和一条反向引物。
[0014] 所述KASPMastermix包含通用的FRETcassette巧光引物，R0X内参染料， KlearhqDNA聚合酶，dNTP和MgClz等组分，已预置于优化的缓冲液中。
[0015] 本发明还提供所述核屯、SNP标记在棉花杂交种鉴定中的应用。
[0016] 前述的应用，包括W下步骤：
[0017] 1)提取待测棉花样品的DNA;
[001引 2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix,进行PCR扩增；
[0019] 3)采用巧光检测仪分析PCR产物。
[0020] 其中，PCR反应体系为：
[0021]
[0022] PCR反应条件为：
[0023]
[0024] 本发明提供了一套基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核屯、SNP标记，运 些SNP标记分布于棉花四倍体基因组26条染色体上，每条染色体各1个SNP标记，共26个 SNP标记。基于运套核屯、SNP标记，可实现对棉花杂交种进行高通量的SNP分型检测。
【具体实施方式】
[0025]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0026]W下实施例中使用的KASP Mastermix购自英国LGC公司，货号为邸S-1016-001。
[0027] 实施例1基于KASP技术开发的26个用于棉花杂交种鉴定的核屯、SNP标记
[0028] 基于陆地棉遗传标准系TM-1的全基因组序列，版本号为NBIG.hirsutum genome(https://www.cottongen.org/)进行SNP位点的筛选及定位。
[0029] 本发明中核屯、SNP位点的筛选确定：基于遗传背景具有广泛代表性的样品数据， 利用63k的Illumina棉花全基因组SNP忍片，根据W下特征进行筛选评估：（a)是否为单 位点；化）位点评估分值GenTrainscore是否在0. 6W上；（C)位点多态性，最小等位基 因频率是否在0. 2W上；（d)基因组上的分布情况；（e)杂交种亲本纯合率与杂交种Fi杂合 率；（f)Ξ种基因型cluster是否容易区分等因素。对每个位点进行筛选分析，去除不符合 要求的位点；最终从每条染色体上挑选1个杂交种杂合率高且分型效果理想的核屯、SNP位 点，合计26个。平均杂合率为0.61，平均最小等位频率为0.38,平均Score值为0.88。26 个核屯、SNP的相关信息见表3。
[0030] 表3 26个核屯、SNP