的相关信息
[0031]
[003引根据26个SNP位点的侧翼序列，针对每个SNP位点，采用KrakerT软件在SNP位 点上游设计两条正向引物，下游设计一条反向引物。26个SNP标记的引物序列信息见表2。 [0034]表2用于PCR扩增所述核屯、SNP标记的引物序列信息
[0035]
[0037] 实施例2利用核屯、SNP标记检测待测棉花杂交种'中棉所63'的纯度 [003引检测方法如下：
[0039] 1、DNA提取
[0040] 随机挑取待测'中棉所63'杂交种种子96粒进行DNA制备。
[0041] (1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离屯、管中。
[0042] 似加入 800μ1DNA提取液（1%SDS，0.Olmol/L邸TA8. 0,0. 7mol/L化C1， 0. 05mol/LTris-HCl，0. 5%山梨醇，1%PVP，1%β-琉基乙醇），縱满至充分混匀后，65°C 水浴30min，间隔lOmin左右轻摇一下。
[004引 做水浴结束后，加入等体积800μ1苯酪、氯仿和异戊醇的混合液（体积比 25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层，lOOOOrpm离屯、lOmin。
[0044] (4)将上清液转移到另一 2ml离屯、管中，加入0. 7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静 置30min，絮状DNA成团析出。
[0045] (5)用剪口枪头吸取DM转移至盛有70%乙醇的离屯、管中，洗涂两次。
[0046] (6)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μ1TE(pH8. 0)或(1地2〇,充分溶解备 用。
[0047] 2、采用KASP技术进行基因分型检测
[0048] 将实施例1中编号为CS11的SNP标记组成的特异的KASPPrimermix(正向引 物 1:GATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAA;正向引物 2:ATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAG;反向引物： CAGTCTGTACTGCCAGATTGGGTTA)和通用的KASPMastermix加入到含有DNA样品的 96 孔板 中，封板后进行水浴PCR，然后采用巧光微孔板检测仪读取检测结果。
[0049] 其中，PCR反应体系为：
[0050]
[0053] 3、结果分析
[0054] 通过W上检测，获得96个待测杂交种'中棉所63'种子样品在编号为CS11的SNP 标记基因分型结果，统计结果表明：87个样品表现为杂合基因型AG，9个样品表现为母本基 因型AA，即待测样品母本自交率为9. 4%，杂交种纯度为90. 6%。
[005引实施例3利用核屯、SNP标记鉴定待测棉种是否为杂交种'中棉所72'
[005引检测方法如下：
[0057] 随机挑选待测棉种与'中棉所72'标准样品种子各24粒，按照实施例2的步骤进 行DNA制备，同时使用26个核屯、SNP标记进行基因分型检测。PCR反应同实施例2的描述。
[0058] 结果分析：通过W上检测，获得待测棉种与'中棉所72'在26个SNP位点上的分 型结果，比对分析结果表明：待测杂交种在16个SNP位点与'中棉所72'表现出差异。表 明待测杂交种不是'中棉所72'的真实杂交种。
[005引由于SNP标记检测手段较多，按照检测通量来划分具体情况如下：①传统的低通 量SNP分型方法：包括Sanger测序方法、限制性内切酶酶切法、单链构象多态性技术等。运 些分型方法或许成本较低，但耗时长、自动化程度差、实验条件需反复调试，因此，只适合检 测样品量和位点数目均较少的实验对象。②中通量的SNP分型方法：如SNPlex、SnaPshot、 化qMan、质谱法等。中通量分型方法存在的问题是每个数据的价格较高，性价比低。③高通 量的SNP分型方法：主要包括两类，一类是位点高通量的忍片检测平台，可用于SNP位点前 期筛选，并且可定制不同位点通量的忍片产品；另一类是样品高通量的检测平台，可实现样 品高通量、位点数中低通量检测。KASP技术即属于样品高通量的SNP检测技术，通过筛选与 综合评价，获得一批少量的核屯、SNP位点，可实现对大量样品进行高通量的分型检测，一天 内即可完成几十万个SNP位点的检测，尤其适用于品种纯度的快速检测。
[0060] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核屯、SNP标记，其特征在于，所述核屯、 SNP标记的编号分别为CSOl~CS26,它们的信息如下：2. 根据权利要求1所述的核屯、SNP标记，其特征在于，SNP物理位置是基于陆地棉遗 传标准系TM-I的全基因组序列而确定的，所述陆地棉TM-I全基因组序列的版本号为NBI G.hirsutumgenome。3. 用于PCR扩增权利要求I或2所述核屯、SNP标记的引物，其特征在于，所述引物序列 信息如下：4. 权利要求I或2所述核屯、SNP标记在棉花杂交种鉴定中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括W下步骤： 1) 提取待测棉花样品的DNA; 2) 向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix,进行PCR扩增； 3)采用巧光检测仪分析PCR产物； 所述KASPPrimermix含有S种特异性的引物：正向引物1、正向引物2和反向引物； 所述引物序列信息如下：所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的FRETcassette巧光引物，ROX内参染 料，KlearhqDNA聚合酶，dNTP和MgClz。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，PCR反应体系如下：PCR反应条件为：94°C15分钟；94°C20秒，61-55°C60秒（每个循环降低0. 6°C)，10 个循环；94°C20秒，55°C60秒，26个循环。
【专利摘要】本发明提供了一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记，这些SNP标记分布于棉花四倍体基因组26条染色体上，每条染色体各1个SNP标记，共26个SNP标记。基于这套核心SNP标记，可实现对棉花杂交种进行高通量的SNP分型检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105368830
【申请号】CN201510807650
【发明人】匡猛, 魏守军, 杨伟华, 王延琴, 周大云, 马磊, 方丹, 徐双娇, 单峰
【申请人】中国农业科学院棉花研究所
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月19日