小反刍兽疫病毒通用/强毒双重荧光定量rt-pcr检测试剂、检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明设及一种小反当兽疫病毒通用/强毒双重巧光定量RT-PCR检测试剂、检测 试剂盒及检测方法，属于动物检疫技术领域。
【背景技术】
[0002] 小反当兽疫被世界动物卫生组织（0IE)规定必须申报的动物传染病，在我国《法 定动物疫病病种名录》中规定为一类动物疫病，属于危害严重，需要采取紧急严厉的强制预 防，控制和扑灭的动物疫病之一。小反当兽疫具有高发病率和高死亡率等特点，发病率可达 至IJ100%，死亡率50%~90%，严重爆发时死亡率甚至100%，属于危害严重，需严厉防控 的重大动物传染病之一。该病一旦发生将给小反当动物（山羊、绵羊）饲养国家的内外贸经 济带来巨大的损失。
[0003] 2007年7月8日国家外来动物疫病诊断中屯、接到西藏阿里地区发生不明山羊疫病 的报告并收到采集的样品。病羊主要症状：眼炎，甚至失明；浆液性和脈性鼻液：体溫高达 40-4rC:严重腹泻。剖检变化：肺炎变化、支气管和肺脏出现干酪样病灶.肺脏表面、支 气管黏膜、肾脏、肠系膜等有出血点。绵羊很少发病。国家外来动物疫病诊断中屯、接到样品 后即启动病原学和血清学检测，结果表明本次疫情由小反当兽疫病毒引起，运是我国历史 上首次爆发小反当兽疫。
[0004]自西藏爆发小反当兽疫W来，新疆、甘肃、内蒙古、宁夏、安徽、重庆、迂宁、山东、湖 南等地相继爆发，给我国的养羊业造成重大损失，农业部出台防控措施，严防疫情的蔓延。 防控小反当兽疫的措施之一是早发现、早诊断，要做到运点，需要快速灵敏的检测方法。
[0005]目前新型的核酸扩增检测方法发展快速，由于其简便快捷，结果准确，已经在临床 检疫中广泛应用，取得了良好的效果，已有替代传统检测方法的趋势。尽管在小反当兽疫 暴发后，国内外很多学者研究建立了巧光RT-PCR检测方法，但是小反当兽疫通用/强毒双 重巧光定量RT-PCR检测方法还未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是建立同时检测小反当兽疫病毒和强毒的双重巧光定量RT-PCR检 测试剂及双重巧光RT-PCR检测方法，为快速鉴别强毒与疫苗毒提供一种简便方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案： 一种小反当兽疫病毒通用/强毒双重巧光定量RT-PCR检测试剂，含有 通用-上游引物：5'GCCAACYGCTYCYGGARATCA3'，如沈QIDNO. 1 所示， 通用-下游引物：5'ATRGCYTGCAGCCTGAAGA3'，如沈QIDNO. 2 所示， 通用-探针：5,FAM-CCCTCGTGAGGCYCARAGRTCGGC-TMARA3，，如沈QIDNO. 3 所示； 强毒-上游引物：ATCCTGGATAGAGAACGCTTGGTC，如沈QIDNO. 4 所示， 强毒-下游引物：GCYCGGTGAAGCCTGATC，如沈QIDNO. 5所示， 强毒-探针：5' 肥X-CCAGCAGYCCGATTAGACTCAGRAACA-TAMRA3'，如沈QIDNO. 6 所示。
[0008] -种小反当兽疫病毒通用/强毒双重巧光定量RT-PCR检测试剂，由巧光RT-PCR 反应液和酶混合物按照15:1的体积比组成； 巧光RT-PCR反应液：由1体积浓度为10ymol/L的通用-上游引物、1体积浓度为 10ymol/L的通用-下游引物、0. 5体积浓度为10ymol/L的通用-探针、1. 25体积浓度为 10ymol/L的强毒-上游引物、1. 25体积浓度为10ymol/L的强毒-下游引物、0. 75体积 浓度为10μmol/L的强毒-探针、3体积5xRT、1. 5体积10XPCR、1. 5体积浓度为25mmol/L 的MgCl2、2体积浓度为2. 5mmol/L的dNTP和1. 25体积DEPC水组成； 所述酶混合物由200υ/μL的M-MLV反转录酶、5υ/μL的化qDNA聚合酶、40υ/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
[0009] 所述DEPC水：自来水两次蒸馈，经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化，收 取电阻率>18.0MQ.cm的水，得Millipore-Q纯化水；然后向Millipore-Q纯化水中加 入DEPC至终浓度为0. 1%，37°C揽拌处理12虹，15化f7in2 (1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌 15分钟，即可。
[0010] 本发明还提供了一种含有上述小反当兽疫病毒通用/强毒双重巧光定量RT-PCR 检测试剂的试剂盒。
[0011] 上述试剂盒，还含有阴性对照、阳性对照和DEPC水； 所述阴性对照：未感染小反当兽疫病毒的组织样品（小反当兽疫病毒阴性组织样品)， 用0.Olmol/L抑7. 2PBS缓冲盐水制成20%悬液，70°C作用1小时，提取RNA。
[0012]阳性对照：为体外转录的、包含N基因和Η基因的非感染性RNA片段。（通用检测 方法的祀区域为Ν基因，强毒检测方法的祀区域为Η基因） 本发明还提供了一种采用上述小反当兽疫病毒通用/强毒双重巧光定量RT-PCR检测 试剂、检测试剂盒的检测方法， (1) 向15μΙ巧光RT-PCR反应液中加入lOul待测样品的RNA，配成25ul的反应体系， 取lOul阳性对照、阴性对照的RNA，分别加入到15μL巧光RT-PCR反应液中，作为阳、阴性 对照，进行巧光定量PCR反应； (2) 巧光定量PCR的反应参数如下设置： 第一阶段：预变性，42°C/30min; 第二阶段：92°C/3min; 第Ξ阶段：94°C/15sec，54°C/25sec，60°C35sec,共 40 个循环； 巧光收集在第Ξ阶段每次循环的60°C延伸时进行； (3) 结果读取：对于多通道PCR仪，利用FAM(465-510)通道和肥X(VIC) (533-580) 读取结果；对于ABI仪器，选择FAM和肥X通道，无巧光泽灭基团读取结果； 阴性：双检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无小反当兽疫病 毒； 双阳性：双检测通道Ct/Cp值均《30. 0,且均出现典型的扩增曲线，表示样品中有小反 当兽疫病毒强毒； 单阳性：如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值《30. 0,而肥X/VIC检测 通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在小反当兽疫病毒疫苗毒。
[0013] 上述检测方法，阴性对照用两个检测通道读取数据时，应均无Ct/Cp值并且无扩 增曲线； 阳性对照用两个检测通道读取数据时，应出现两条相应的特征性扩增曲线，且Ct/Cp值均应小于等于28;如阴性或阳性对照不满足W上条件，此次实验视为无效。
[0014] 上述检测方法，任一通道Ct/Cp值大于30. 0,且出现典型的扩增曲线的样品建议 复验；复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
[0015] 所述无小反当兽疫病毒，是指样品中既没有小反当兽疫病毒强毒，也没有小反当 兽疫病毒疫苗毒。
[0016] 本发明选择小反当兽疫病毒N基因编码区特定序列作为祀区域，在多重序列比对 的基础上，进行小反当兽疫病毒通用引物和探针设计；选择小反当兽疫病毒Η基因编码区 特定序列作为祀区域，在多重序列比对的基础上，进行小反当兽疫病毒强毒引物和探针设 计选择。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%-60%，引物内无二级结构和重复性，弓I 物间和引物内无互补序列，引物间的烙解溫度（Tm值）相差小于5°C。探针的长度在25个 碱基左右，Tm值比引物Tm值高5°C左右。
[0017] 小反当兽疫病毒通用探针序列的5'端标记报告巧光基团FAM(6-carboxy-巧光 素)，3'端标记泽灭基团TAMRA;小反当兽疫强毒探针序列的5'端标记报告巧光基团肥X (5-hexachloro-巧光素)，3'端标记泽灭巧光基团TAMRA。
[0018] 采用化qMan巧光PCR检测技术建立了小反当兽疫病毒通用/强毒双重定量巧光 RT-PCR检测试剂盒，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓 度的优化，引物探针浓度的优化。
[0019] 本发明提供的试剂盒，由提取试剂盒和检测试剂盒组成：提取试剂盒采用柱式 RNA提取方法，相对于化izol提取法，简便、快速，而且提取效率高。
[0020] 所述提取试剂盒的组成，如下:_
BufferA为裂解液，主要由4M异硫氯酸脈、10%十二烷基肌氨酸钢、4. 5%氯化钢、30% 乙醇组成。
[00引]BufferB为洗液，主要由lOmMTris-肥I、lmM邸TA、70%乙醇组成。
[0022]BufferC溶解液，