基于ipma的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明提供一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒能够高特异性高 灵敏度地检测小反刍动物体内是否存在小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)抗体，从而达到疫苗抗体检测或疾病诊断的目的。
【背景技术】
[0002] 小反合兽疫是小反合兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)感染 引起的一种严重的烈性、接触性传染病，会造成重大的经济损失。该病为FA0/0IE规定的A 类烈性传染病，我国规定的一类动物疫病。
[0003] 其病原是副粘病毒科麻瘆病毒属的成员，基因组为不分节段的单股负链RNA。与 牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、 Vero细胞上增殖，并产生细胞病变（CPE)，形成合胞体。只有一个血清型，但从遗传演化上， 可分为4个系。
[0004] 该病自1942年在西非象牙海岸首次报道以来，目前主要流行于非洲西部、中东部 和亚洲的部分地区。2007年首次由境外传入我国西藏，次年西藏又有传染来源不明的疫情， 2013年底新疆再次发生，目前已有20各省市区出现疫情。传染途径主要为直接、间接接触 或呼吸道飞沫传播。传染源主要为患病动物和隐性感染动物，处于亚临床型的病羊尤为危 险。其中病畜的分泌物和排泄物均能携带病毒。
[0005] PPRV主要感染小反刍兽，山羊比绵羊更易感，其它野生动物也可发生。临床上以发 热、眼鼻分泌物、口炎、腹泻和肺炎为特征。发病率和死亡率分别可高达100%和90%，其中 幼畜一般高于成年家畜。还常伴有继发的呼吸道和胃肠道感染。
[0006] 对患畜尸体剖检，可见结膜炎、坏死性口炎，严重病例可蔓延到硬腭及咽喉部。皱 胃、肠（尤其结直肠结合处）常出现糜烂、出血。淋巴结肿大，脾有坏死性病变。在鼻甲、喉、 气管等处有出血斑。
[0007] 该病的初步诊断，可根据临床症状和病理变化作出判断，而确诊需进行实验室检 查。其中，血清学诊断方法仍为常规采用的方法，包括：琼脂扩散试验（AGID)、沉淀抑制试 验（CIEP)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、间接荧光抗体试验（IFA)和病毒中和试验（VNT)、 RT-PCR-ELISA等。其中，VNT和ELISA两种方法最为重要，在国际贸易中，前者为指定方法， 后者为替代方法。
[0008] VNT虽是敏感特异的检测方法，但也存在一些缺点，如⑴费时，一般10~12天才 能获得结果。（2)条件严格，涉及细胞培养和试验样品的无菌处理，结果判定要有经验等，在 发展中国家，尤其现地基层，没有条件开展。（3)费力，工作量和劳动强度大，不适合大量样 品的检测。ELISA目前建立有间接、竞争或阻断ELISA等多种方法，检测用抗原有全病毒抗 原或针对核衣壳蛋白（N)、血凝素蛋白（H)的重组表达抗原，它们之间在敏感性和特异性上 存在差异。由于羊血清往往存在背景值偏高的问题，因此，基于核衣壳蛋白（N)和血凝素蛋 白（H)的单克隆抗体，建立了竞争或阻断ELISA方法。目前英法两国的小反刍兽疫参考实 验室虽有商品化的ELISA试剂盒面世，但仍存在敏感性和特异性不足的问题，尚不能取代 黄金标准的VNT方法，加之使用价格比较昂贵。
【发明内容】
[0009] 本发明人基于免疫组织化学原理，建立了基于免疫过氧化物酶细胞单层试验 (immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反合兽疫病毒抗体检测试剂盒，可以用 于检测病毒蛋白（细胞内抗原）相应的抗体，并且具有敏感特异、简便快速、判读直观，适合 大量样品与溯源检测的特点。本发明人建立的基于IPMA检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂 盒和方法，为国内外首次报道；同时，所述试剂盒能够取代国外价格昂贵的ELISA试剂盒， 应用于我国对小反刍兽疫的防控实践中。
[0010] 在第一方面，本发明提供基于IPMA的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，所述试剂 盒包括：包含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板、阳性对照血清、阴性对照血 清、样品稀释液、盐水洗涤液、HRP标记鼠抗羊McAb、二组分AEC显色液、终止液、血清稀释板 和使用说明书。其中，所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM 细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞。所述阳性对照血 清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N75/1免疫山羊后采血，分离获得的免疫阳性血清，中和 效价在1 : 160以上。所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性山羊未经免疫直接采血，分离 获得的阴性血清。优选地，其中所述BHK-gSLAM细胞为保藏号为CGMCC No. 10587的细胞。
[0011] 更具体地，其中所述样品稀释液为含4%马血清和0. 5%吐温80的0. 5M氯化钠溶 液，pH 7. 2 ;
[0012] 所述盐水洗涤液为含0. 5 %吐温80的0. 15M氯化钠溶液；
[0013] 所述二组分AEC显色液由A液和B液按1 : 1的体积比组成，其中A液由下述组 成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2. 5ml N，N-二甲基甲酰胺和47. 5ml醋酸溶液，pH 5. 0 ;B 液由50ml纯水和20 y 1双氧水组成；
[0014] 所述终止液为0? 05M醋酸溶液，pH 5. 0。
[0015] 在一个优选的实施方案中，本发明提供的基于IPMA的小反刍兽疫病毒抗体检测 试剂盒包括：含细胞内阳性抗原与阴性抗原的96孔细胞培养板，96孔/I块/盒；阳性对照 血清，100 y 1/1管/盒；阴性对照血清，100 y 1/1管/盒；样品稀释液，30ml/l瓶/盒；盐水 洗涤液，400ml/l瓶/盒；HRP标记鼠抗羊McAb，12ml/l瓶/盒；二组分AEC显色液（A液： 6ml/l瓶/盒和B液：6ml/l瓶/盒）；终止液，6ml/l瓶/盒；血清稀释板，96孔/I块/盒；说 明书，1份/盒。其中所述细胞内阳性抗原为小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM 细胞，所述细胞内阴性抗原为未感染小反刍兽疫病毒的BHK-gSLAM细胞（保藏号为CGMCC No. 10587)。所述阳性对照血清为小反刍兽疫病毒疫苗株PPRV N75/1免疫山羊后采血，分 离获得的免疫阳性血清，中和效价在1 : 160以上。所述阴性对照血清为小反刍兽疫阴性 山羊未经免疫直接采血，分离获得的阴性血清。所述样品稀释液为含4%马血清和0. 5 %吐 温80的0. 5M氯化钠溶液，pH 7. 2 ;所述盐水洗涤液为含0. 5 %吐温80的0. 15M氯化钠水 溶液；所述二组分AEC显色液由A液和B液按1 : 1的体积比组成，其中A液由下述组成： 50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2. 5ml N，N-二甲基甲酰胺和47. 5ml醋酸溶液，pH 5. 0;B液由 50ml纯水和20 y 1双氧水组成；所述终止液为0. 05M醋酸溶液，pH 5. 0。
[0016] 本发明所述的试剂盒用于小反刍兽疫病毒抗体检测或小反刍兽疫疾病诊断的目 的。
[0017] 在第二方面，本发明提供基于IPMA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法，所述方法包 括下述步骤：
[0018] 1.细胞系BHK-gSLAM的建立：用构建的重组质粒pIRES3-gSLAM转染BHK-21细胞 在选择性培养基上进行细胞克隆，通过克隆后细胞的SLAM蛋白表达检测及病毒rPPRV/GFP 感染试验对阳性克隆进行鉴定，最终获得乳仓鼠肾细胞系BHK-gSLAM。该细胞系于2015年 4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研宄所，邮政编码：100101，http ://www.cgmcc. net) 〇
[0019] 2.细胞内抗原的制备：BHK-gSLAM细胞在96孔细胞培养板内长成单层后，以接种 rPPRV/GFP病毒的细胞作为阳性抗原，同时以未接毒的细胞作为阴性抗原。当接毒孔内受感 染细胞达到15~30%时，弃去细胞板内生长培养液，终止细胞培养。0. 15M盐水溶液洗涤 细胞板后，用预冷的4%多聚甲醛溶液对细胞板室温下固定10分钟，弃去固定液。洗板后， 加入3%鱼皮胶溶液对细胞板37°C封闭2小时，弃去封闭液。37°C干燥1~2小时后，将细 胞板密封，4°C保存或-20°C冻存备用。
[0020] 3?用法与判定：
[0021] 试剂盒所有试剂组分使用前应恢复至室温（18~25°C )，通常室温放置30min即 可，使用后放回2~8°C。使用过程中，各组分应避免交叉污染；同时不同批次之间或不同 试剂盒之间的组分不可交叉使用。
[0022] 3. 1样品处理受试血清样品800Xg离心5分钟后，用样品稀释液（含4%马血清 和0.5%吐温80的0.511氯化钠溶液4117.2)在96孔稀释板上按1:10、1:40、1:160 和1 : 640的浓度对血清样品进行稀释，待用。
[0023] 3.2 -抗孵育
[0024] 将稀释好的血清样品或对照血清，按100y1/孔移入上述步骤2中制备好的细胞 抗原板上，密封后，37°C孵育1小时。弃去液体，盐水洗涤液（含0. 5 %吐温80的0. 15M氯 化钠溶液）洗涤3次。
[0025] 3.3 二抗孵育
[0026] 按100 y 1/孔加入合适浓度的HRP标记鼠抗羊McAb，37°C孵育1小时。弃去液体，