一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸及制备方法。本发明的金标试纸，含有底板和底板上依次衔接的加样吸收垫、由吸附有金标抗原的玻璃纤维素膜构成的免疫金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫，在硝酸纤维膜上含有检测线和质控线，免疫金标垫上检测线由原核表达经优化后N基因部分重组蛋白N1-N4构成，质控线为抗N1-N4重组蛋白的兔IgG抗体。本发明具有快速、简便、直观、灵敏、准确、检测成本相对较低的特点。
【专利说明】一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病原体的检测试纸及其制备方法，确切讲本发明涉及一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸及制备方法。
【背景技术】
[0002]小反会兽疫是由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疫病毒属(Morbolivirus)的小反会兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起的，主要感染小反会兽，特别是山羊和绵羊高度易感，是一种烈性、接触性传染病。世界粮农组织(FAO)和世界动物卫生组织(OIE)将小反刍兽疫列为法定报告动物疫病，我国将其划分为I类动物疫病。(龙云凤，刘晓慧，周晓黎，等.小反刍兽疫流行病学及防控研究进展[J].动物医学进展，2012，33(5): 94-98.)。PPRV于1942年在西非科特迪瓦首次发现(Gargadennec L,Lalanne A.La peste des petits ruminants.Bull Serv Zoo AOF, 1942, 5: 15-21.),近年来，小反刍兽疫((PPR)呈扩散的趋势，成为重要的跨国动物传染病之一，并且我国周边国家频繁暴发该病，2007年7月，我国西藏自治区阿里地区日土县发生小反刍兽疫疫情，造成了巨大的经济损失(王志亮，包静月，吴晓东，等我国首例小反当兽疫诊断报告[[J].中国动物检疫，2007，24 (8):24-26.)。小反当兽疫(PPR)具有很高病死率，在初次发病动物群中病死率可高达50%?80%，羊在我国畜牧养殖中占了不小的比重，因此，预防和控制小反刍兽疫的发生对我国的畜牧业健康的发展具有重要的意义(Banvard A C，Parida S，Batten C， et al.Global distribution of peste des petits ruminants virus andprospects for improved diannosis and control.J Gen Virol, 2010, 91 (Pt 12):2885-2897.)。目前本病控制主要是通过早期诊断和免疫预防(Chauhan H C，Lambade P,Sen S，et al.The use of patholoaiealand histopatholoaicaltechniques in thediagnosis of peste des petits ruminants in India[J].Veterinaria Italiana,2011，47(1): 41-47.)。
[0003]小反当兽疫防控主要采用免疫接种及血清学监测和疫情发生后扑杀策(黄华欣，李刚，史利军，等。小反刍兽疫病毒M蛋白主要抗原表位区的原核表达及鉴定[J].中国兽医科学，2013,43 (03):266-270.)。在血清学检测方法中，病毒中和试验(VNT)是国际贸易中检测金标准，其灵敏度高、特异性强，但非常耗时(龙云凤，刘晓慧，周晓黎，等.小反刍兽疫流行病学及防控研究进展[J].动物医学进展，2012，33 (5):94-98.)。ELISA是口前PPR最常用血清学检测方法，敏感性和特异性较高。目前，国内外建立的检测PPRV的ELISA方法主要是以PPRV N (邱文英，李伟，李刚，等.小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELIAS方法的建立[J].农业生物技术学报，2011，19 (5) =967-972.)、PPRV H(Singh R P, Sreenivasa B P, Dhar P, et al.Development of a monoclonal antibodybased competitive—ELISA for detection and titration ol antibodies to peste despetits ruminants (PPR) virus [J].Vet Microbial, 2004, 98 (I): 3-15.)、PPRV F(田康乐，李刚，邱文英，等。小反当兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备[J].中国生物制品学杂志，2012，25 (9):1185-1189.)和中国发明专利申请CN102967710A公开的一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒及其制备方法，这些方法主要是以重组蛋白作为诊断抗原的检测技术，而 Brning-Richardson A 等(Bruning-Richardson A, AkerblomI，Klingeborn B，et al.1mprovement and development ο I rapid chromatographicstrip tests for the diagnosis ol rinderpest and peste des petits ruminantsviruses [J].Virol Methods, 2011，174(1-2):42-46.)在制备特异性单克隆抗体的基础上建立了一种层析试纸条快速检测PPRV的方法，给小反刍兽疫的检测带来了革命性的飞跃。我国对小反刍兽疫的抗体检测方法和技术仍处于试验和摸索的阶段，用小反刍兽疫全病毒作为抗体诊断试剂，虽然在特异性和灵敏性上较好，但全病毒的获得较为困难，且成本较高。而用分子生物学构建表达的蛋白具有很好的优势。面对我国基层检测机构条件简陋并且缺乏相应的技术人员的现实，发展一种快速、简便、检测成本相对较低、无需要专业人员，可在检测现场操作的新型诊断方法已成为要面对的任务。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种可克服现有技术不足的，可用于检测小反刍兽疫抗体检测金标试纸条。
[0005]本发明的一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸，含有底板和底板上依次衔接的加样吸收垫、由吸附有金标抗原的玻璃纤维素膜构成的免疫金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫，在硝酸纤维膜上含有检测线和质控线，其中免疫金标垫上检测线由原核表达经优化后N基因部分重组蛋白N1-N4构成，质控线为抗N1-N4重组蛋白的兔IgG抗体。
[0006]本发明的检测小反刍兽疫抗原的金标试纸制备方法是:以pUC57-Simple-N为模板、以引物SEQ ID Na USEQ ID Na2,SEQ ID Ns3和SEQ ID Ns4扩增得到pMD19_T Simple-NjPpMD19-T Simple- N4 和 pMD19_T Simple-N1-N4JfpMDig-T Simple-N1-M 质粒双酶切后，克隆至经过同样酶切处理的原核表达载体pET-32a中，获得重组质粒PETIZa-N1-N4 ；将重组质粒PETIZa-N1-N5表达宿主菌中表达，将表达蛋白加入胶体金溶液中，再在其中加入缓冲液，然后再将前述溶液喷涂于玻璃纤维素膜上，再将重组N1-N4蛋白，喷于NC膜上为检测带；将兔抗N1-N4蛋白IgG抗体喷于NC膜上为质控带，然后依次将吸水垫、硝酸纤维膜、免疫胶体金垫、样品吸收垫粘贴在PVC底板上，再按要求切条得到检测小反刍兽疫抗原的金标试纸。
[0007]本发明的检测小反刍兽疫抗原的金标试纸制备方法中的pMD19-T Simple- N1质粒制备方法是:以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增NI基因的反应条件分别为:94°C 5min ；94°C 45s, 60°C 45s, 72°C lmin，共 35 个循环，72°C 10min，4°C结束反应，将目的基因进行切胶回收后与PMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因
N10
[0008]本发明的检测小反刍兽疫抗原的金标试纸制备方法中的pMD19-T Simple- N4质粒制备方法是:以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增N4基因的反应条件分别为:94°C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环，72°C 10min，4°C 结束反应，将目的基因进行切胶回收后与PMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因N4。其中优选的方法是以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增N1-N4基因的反应条件分别为:94°C 5min ；94°C I min,60°C lmin, 72°C 90s，共 35 个循环，72°C10min，4°C结束反应，将目的基因进行切胶回收后与pMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因NrN4。
[0009]本发明中，N蛋白是PPRV病毒粒了中主要的结构蛋白，是病毒粒了中含量最丰富且免疫原性最强的结构蛋白(Libeau q Prehaud C，Lancelot R, et al.Development ofa competitive ELISA for detecting antibodies of the peste des petits ruminantsvirus using a recombinant nucleoprotein.Res Vet Sci,1995, 58(1): 50-55.)。PPRV N蛋白序列可以根据其保守性的不同而划分为4个区域，分别为I (I~120 aa)区、II (122 ~145 aa)区、III (146 ~398 aa)区和 IV(421 ~25 aa)区。当 PPRV 感染宿主动物后，宿主的血清中针对N蛋白的抗体占据主导地位(Balamurugan V, SenA, SsrrsvananP, et al.0ne step multiplex RT-PCR assay for the detection of peste des petitsruminants virus in clinical samples.Vet Res Commu, 2006, 30(6): 655-666),虽然该抗体不是中和抗体，不能起到中和病毒粒了的作用，但是可以用于PPRV疫苗的疫苗免疫效果的监测。本发明分别构建了 pET-SZa-N'pET-SZa-N^pET-SZa-N^pET-SZa-N^pET-SSa-N4,并分别进行了表达和免疫印迹检测，结果显示未优化过的N基因构建表达的Ν、ΝρΝ2、Ν3、N4蛋白均为不溶性包涵体，其中只有N、N1、N4蛋白有免疫反应性。通过本发明基因优化构建的PETIZa-N1、pET-32a-N4、PETIZa-N1-N4，表达的蛋白具有免疫反应性且表达的蛋白为可溶性，通过免疫学实验结果显示PET^Za-N1-N4蛋白具有较好的生物学活性，对优化后％、N4, N1-N4基因表达的蛋白分别作为抗原建立小反刍兽疫N蛋白抗体检测金标法，N1-N4蛋白建立的金标法阳性检出率和特异性要明显高于K、N4蛋白。
[0010]本发明的试剂盒制备方法简单，而采用本发明的方法进行小反刍兽疫N蛋白抗体检测时，不需要复杂的仪器设备和专业人员，而且不受检测场所条件的限制，经试验表明，本发明具有快速、简便、直观、灵敏、准确、检测成本相对较低的特点。
【具体实施方式】
`[0011]以下结合实施例对本发明进行解说。
[0012]本发明的小反刍兽疫N基因为基因优化后人工合成的序列，其中N蛋白基因的优化和人工合成，将人工合成的N基因与pUC57-Simple克隆载体相连接后，构建pUC57-Simple-N重组质粒中，pUC57-Simple_N重组质粒由南京金斯瑞合成构建。
[0013]本发明的小反刍兽疫N1-N4的基因是以优化好N基因人工合成的序列进行搭桥PCR法连接，采用的两对连接引物分别为:
SEQ ID Na I JPPRV-N1 - F:CCGGAATTCATGGCGACATTATTAA ；
SEQ ID Na 2 =PPRV-N1 - R:CCGGAGGAACCACCCGCACCACGACTTGCGAAAGT ；
SEQ ID Na 3:PPRV-N4 - F:CGTGGTGCGGGTGGTTCCTCCG ；
SEQ ID Na 4:PRV-N4 - R:ATTTGCGGCCGCGCTCAGCAAGTCCTTATCGTTGT,分别弓丨入 ^boR1、Notl限制性酶切位点，通过酶切方法构建原核表达载体PETjZa-N1-Np
[0014]本发明所述的两对引物是经过大量试验比对，充分考虑了搭桥部分重叠的特异性，使得可以通过一次扩增反应就可以扩增出3段目的基因，分别为％、N4, N1-N4,扩增条件要求低，普通的PCR就能完成，扩增出的基因特异，只扩增出与目的相符的目的基因，获得目的基因的时间仅为传统方法的三分之一，大大节省了时间。pET-32a-Nl-N4蛋白具有较好的生物学活性，对优化后N1、N4、N1-N4基因表达的蛋白分别作为抗原建立小反刍兽疫N蛋白抗体检测金标法，N1-N4蛋白建立的金标法阳性检出率和特异性要明显高于N1、N4蛋白。
[0015]以下是本发明试纸制备与应用的实例。
[0016](一)试纸制备
I)小反刍兽疫N蛋的N1和N4基因的扩增和搭桥PCR法连接
根据pUC57-Simple-N重组质粒中N基因碱基序列分别设计了两对特异的引物用于扩增K、N4, N1-N4片段基因，这两对引物还可以用于搭桥PCR将NI和N4基因相连接，参见表I引物序列。
【权利要求】
1.一种检测小反刍兽疫抗原的金标试纸，含有底板和底板上依次衔接的加样吸收垫、由吸附有金标抗原的玻璃纤维素膜构成的免疫金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫，在硝酸纤维膜上含有检测线和质控线，其特征在于免疫金标垫上检测线由原核表达经优化后N基因部分重组蛋白N1-N4构成，质控线为抗N1-N4重组蛋白的兔IgG抗体。
2.权利要求1所述的检测小反刍兽疫抗原的金标试纸制备方法，其特征在于以pUC57-Simple-N 为模板、以引物 SEQ ID Na USEQ ID Na 2,SEQ ID Ns 3 和 SEQ ID Ns 4 扩增得到 PMD19-T Simple- N1 和 pMD19_T Simple- N4 和 pMD19_T Simple-N1-N4,将 pMD19_TSimple-N1-M质粒双酶切后，克隆至经过同样酶切处理的原核表达载体pET-32a中，获得重组质粒PETIZa-N1-N4 ;将重组质粒PETIZa-N1-N5表达宿主菌中表达，将表达蛋白加入胶体金溶液中，再在其中加入缓冲液，然后再将前述溶液喷涂于玻璃纤维素膜上，再将重组N1-N4j蛋白，喷于NC膜上为检测带；将兔抗N1-N4蛋白IgG抗体喷于NC膜上为质控带，然后依次将吸水垫、硝酸纤维膜、免疫胶体金垫、样品吸收垫粘贴在PVC底板上，再按要求切条得到检测小反刍兽疫抗原的金标试纸。
3.权利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple- N1质粒制备方法，其特征在于以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增NI基因的反应条件分别为:94°C5min ；94°C 45s, 60°C 45s, 72°C lmin，共 35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应，将目的基因进行切胶回收后与PMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因K。
4.权利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple- N4质粒制备方法,其特征在于以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增N4基因的反应条件分别为:94°C5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应，将目的基因进行切胶回收后与PMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因N4。
5.权利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple-N1-N4质粒制备方法，其特征在于以pUC57-Simple-N重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增N1-N4基因的反应条件分别为:94°C5min ；94°C I min,60°C lmin,72°C 90s，共 35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应，将目的基因进行切胶回收后与PMD19-T Simple Vector进行连接，克隆出目的基因NrN4。
【文档编号】G01N33/68GK103760364SQ201410013609
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】祁光宇, 蒋韬, 刘斌, 王超英, 牟克斌, 刘学荣, 杜平, 董金杰, 智晓莹, 武发菊 申请人:祁光宇