一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，属于预防兽医学，免疫学领域。
【背景技术】
[0002]小反会兽疫(pestedes petits ruminants, PPR)俗称羊痕，又名小反会兽假性牛痕(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoent- eritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitispneumoenteritis comp 1- ex),是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病,主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征，死亡率高。
[0003]转移因子(TF，Transfer Factor)又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子分子量小、无毒、活性强、无抗原性、不起过敏反应等优点，对于治疗动物病毒性疾病、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤、真菌性疾病时，可以起辅助治疗作用。
[0004]尽管目前已经有一些抗小反刍兽疫的药品和制剂，但由于现有的药品制剂针对性不强，疗效有限，而且治疗性的制剂多是在发病之后才应用的，不能起到根本的治疗作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于:以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
O首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2)淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3)经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
[0007]步骤I)中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
[0008]步骤3)中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100_200mg/L。
[0009]本发明提供的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，采用体外制备方法，减少了生物个体因素的影响，提高了体内制备的特异性、回收率和纯度，这样在临床使用时减少了对机体不必要应激反应，同时起到应有的效应。这种制备方法采用了牛瘟弱毒株作为抗原，不仅可以预防小反刍兽疫也可以防治牛瘟，扩大了抗小反刍兽疫病毒转移因子的使用范围，采用弱毒株作为抗原制备转移因子，不仅因为弱毒株制备容易，来源较多，而且弱毒株免疫原性好，免疫期长，保护率高，安全性高，制备的转移因子出产率高，效能好。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1)首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2)淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3)经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
[0011]步骤I)中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
[0012]步骤3)中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100_200mg/L。
[0013]实施例2
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，心脏采集血液，加入浓度为lmg/mL的肝素钠5mL,制成抗凝血。
[0014]2.淋巴细胞分离:抗凝血与淋巴细胞分离液(购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作)按1:1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min,收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min,收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n，按使用说明操作)80mL充分混匀，然后分装于10mL的细胞培养瓶中，置于5%C02，37°C恒温箱中或者转瓶机中培养，经过2天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
[0015]3.单层淋巴细胞进行传代培养:首先将长成单层淋巴细胞层用0.3%的胰酶37°C短时间消化，吹打分散，加入PH7.0的Hanks液终止，再洗2_3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% C02，37°C恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
[0016]4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n,按使用说明操作)的维持液，同时加入浓度为180mg/L的植物血凝素,小反刍兽疫弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
[0017]5.上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态:3S/3S，300-400W，10 min)破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
[0018]6.过滤除菌，分装，4°C保存。
[0019]7.成品检验:
多肽含量的测定:用Folin-酚法或分光光度法测定多肽，多肽含量0.75g/L。
[0020]蛋白质的测定:采用20%磺基水杨酸方法，提取液没有发生浑浊和沉淀现象，呈阴性，不含蛋白质。
[0021]无菌检测:根据《中华人民共和国兽药典2011版》进行检测，没有细菌生长。
[0022]核糖含量测定:利用分光光度法测定，含量为0.32 g/L。
[0023]外观及pH值测定:黄色澄明液体，酸度值为7.0-7.5之值。
[0024]实施例3
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，静脉取血，加入浓度为lmg/mL的肝素钠5mL,制成抗凝血。
[0025]2.淋巴细胞分离:抗凝血与淋巴细胞分离液(购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作)按1:1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min,收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min,收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n，按使用说明操作)80mL充分混匀，然后分装于10mL的细胞培养瓶中，置于5%C02，37°C恒温箱中或者转瓶机中培养，经过3天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
[0026]3.单层淋巴细胞进行传代培养:首先将长成单层淋巴细胞层用平H7.2的0.32%的胰酶37°C短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗2_3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% C02，37°C恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
[0027]4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n,按使用说明操作)的维持液，同时加入浓度为100mg/L的植物血凝素,牛痕弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过3天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
[0028]5.上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态:3S/3S，300-400W，10 min)破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
[0029]6.过滤除菌，分装，4°C保存。
[0030]实施例4
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，心脏取血，加入浓度为lmg/mL的肝素钠5mL,制成抗凝血。
[0031]2.淋巴细胞分离:抗