因子viii组合物及其制备和使用方法
【专利摘要】本发明涉及包含连接于延伸重组多肽(XTEN)的因子VIII凝血因子的组合物、编码所述组合物的分离的核酸以及含有所述分离的核酸的载体和宿主细胞、以及制备所述组合物和使用所述组合物治疗因子VIII相关疾病、病症和病状的方法。
【专利说明】因子Vl I I组合物及其制备和使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年2月15日提交的美国临时申请序列号61/599, 400的优先权， 所述申请以引用的方式并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有已通过EFS-Web以ASCII格式提交且据此以引用的方式整体并入本 文的序列表。创建于2012年7月11日的所述ASCII拷贝命名为32887346. txt且大小为 13, 344, 768 字节。
[0005] 发明背景
[0006] 因子VIII是内源性凝血级联路径的一种重要组分。在循环中，因子VIII主要与 血管性血友病因子（von Willebrand factor)复合。在由凝血酶（因子IIa)活化后，它自 复合物解离以与因子IXa在内源性凝血级联中相互作用，此又会活化因子X。一旦自血管 性血友病因子复合物移除，活化的因子VIII即由活化的蛋白质C (APC)、因子Xa及因子IXa 蛋白水解失活，且自血流快速清除。当与正常血管性血友病因子蛋白复合时，因子VIII的 半衰期是约12小时，而在不存在血管性血友病因子的情况下，因子VIII的半衰期降低至2 小时（Tuddenham EG 等，Br J Haematol. (1982) 52 (2): 259-267)。
[0007] 在血友病中，血液凝结受缺乏某些血浆凝血因子干扰。甲型血友病是一种因子 VIII缺乏症，且是一种占血友病病例的80%的隐性性连锁X染色体病症。管理甲型血友病 的护理标准是用重组因子VIII浓缩物进行的补充疗法。患有重度甲型血友病的受试者具 有低于正常值1-2%的循环促凝血因子VIII水平，且通常采用目的在于保持在各剂量之间 因子VIII高于1 %的防治性疗法，此可通常通过一周给予因子VIII两至三次来达成。患有 中等重度血友病（因子VIII水平是正常值的2-5%)的人占25-30%的血友病事件且在轻 微创伤之后显现流血。患有轻度甲型血友病（因子VIII水平是正常值的5-40%)的人占 全部血友病事件的15-20%，且仅在重大创伤或手术之后发展流血。
[0008] 外源供应的因子VIII的体内活性受限于蛋白质半衰期较短与结合因子VIII且减 弱或破坏止血功能的抑制剂两者。
[0009] 多达30%的接受外源供应的因子VIII的甲型血友病患者对因子VIII发动IgG 免疫反应（Towfighi，F.等 Comparative measurement of anti-factor VIII antibody by Bethesda assay and ELISA reveals restricted isotype profile and epitope specificity. Acta Haematol (2005) 114:84-90)，此可导致完全抑制它的促凝血活性 和 / 或促进因子 VIII 更快速清除（Bri5t E 等 High titer inhibitors in severe haemophilia A. A meta-analysis based on eight long-term follow-up studies concerning inhibitors associated with crude or intermediate purity factor VIII products. Throm.Haemost. (1994)72:162-164)。称为 FVIII 抑制剂的 IgG 抗体主要针 对 A2、A3 及 C2 结构域（Scandella D 等 Localization of epitopes for human factor VIII inhibitor antibodies by immunoblotting and antibody neutralization. Blood(1989) 74:1618-1626)，但也可针对A1、B及Cl结构域来产生。因此，用于具有FVIII 抑制剂的患者的治疗选项是有限的。
[0010] 通常静脉内给予如因子VIII的大型蛋白质以使药剂在血流中直接可用。先前已 证明肌肉内注射的未修饰因子VIII产生的最大循环水平仅为正常血浆水平的I. 4% (Pool 等，Ineffectiveness of Intramuscularly Injected Factor VIII Concentrate in Two Hemophilic Patients. New England J. Medicine (1966) 275 (10): 547-548)。可除通过静脉 内途径以外施用的制剂将大大简化它们的使用，增加安全性，且导致大量成本节约。
[0011] 对治疗性蛋白质的化学修饰可改进它的体内清除速率及随后血清半衰期。常见修 饰的一个实例是添加聚乙二醇（PEG)部分，其通常通过PEG上的醛或N-羟基丁二酰亚胺 (NHS)基团与胺基团（例如赖氨酸侧链或N末端）反应来偶联于蛋白质。然而，缀合步骤 可导致形成需要提取、纯化和/或其它进一步过程的异质产物混合物，所述所有过程都不 可避免地影响产物产率及质量控制。此外，如果在凝血因子的结合位点附近的氨基酸侧链 通过聚乙二醇化过程而变得被修饰，那么凝血因子的药理学功能可受阻碍。其它方法包括 使Fc结构域基因融合于治疗性蛋白质，此会增加治疗性蛋白质的尺寸，因此降低通过肾进 行清除的速率。在一些情况下，Fc结构域赋予结合FcRn受体，且通过FcRn受体自溶酶体 再循环的能力，从而导致药代动力学半衰期增加。不幸的是，Fc结构域在重组表达期间不 高效折叠，且倾向于形成称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解且功能性蛋白 质必须自错误折叠的聚集体复性，此为一种耗时、低效且昂贵的过程。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明涉及新型凝血因子VIII融合蛋白组合物及其用途。具体来说，本文提供的 组合物特别用于治疗或改善与甲型血友病、因子VIII缺乏症、流血性病症和凝血病变相关 的病状。在一方面，本发明提供包含因子VIII (FVIII)和一个或多个延伸重组多肽（XTEN) 的分离的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白展现促凝血活性。适用于构建所述融合蛋 白的主题XTEN通常是具有非重复序列和非结构化构象的多肽。在一个实施方案中，一个或 多个XTEN连接于选自天然人因子VIII、因子VIII B结构域缺失序列（"FVIII BDD"）及其 序列变体（全部前述各者总称为"?￥111"或"0?"）的凝血因子？￥111("0?"），从而产生重 组因子VIII-XTEN融合蛋白（"CFXTEN"）。CFXTEN的因子VIII多肽组分包含Al结构域、 A2结构域、Cl结构域、C2结构域和任选B结构域或其部分。在一些实施方案中，通过描绘以 上提及的结构域以包含酸性al、a2和a3间隔子来进一步表征FVIII。在另一实施方案中， 本公开涉及包含融合蛋白的药物组合物及其在用于治疗因子VIII相关病状的方法和方案 中的用途。CFXTEN组合物相较于未连接于XTEN的FVIII具有增强的药代动力学和药理学 性质，此可允许更便利的给药和改进功效。
[0014] 在第一方面，本发明涉及包含因子VIII多肽和一个或多个连接于所述因子VIII 的延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供包含 因子VIII多肽和至少一个延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子 VIII多肽包含含有al酸性间隔子区域的Al结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构域、 含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、Cl结构域、C2结构域和任选B结构域的全部或一部 分，且其中所述至少一个XTEN在以下各处连接于所述因子VIII多肽：（i)所述因子VIII 多肽的C末端；（ii)如果存在B结构域的全部或一部分，那么在所述因子VIII多肽的B结 构域内；（iii)在所述因子VIII多肽的所述Al结构域内；（iv)在所述因子VIII多肽的所 述A2结构域内；(V)在所述因子VIII多肽的所述A3结构域内；(vi)在所述因子VIII多 肽的所述Cl结构域内；(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2结构域内；(viii)在所述因 子VIII多肽的N末端处，或（ix)在所述因子VIII多肽的两个结构域之间，其中相较于未 连接于XTEN的相应因子VIII，当通过体外凝血测定进行测量时，所述融合蛋白保留至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400% 或 500% 的 促凝血活性。在一个实施方案中，在前述重组因子VIII融合蛋白中，至少一个XTEN在于 选自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1至6个氨基酸处或内的位点处连接于所述因子 VIII多肽。在其它实施方案中，本发明提供包含因子VIII多肽和至少第一延伸重组多肽 (XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性间隔子区域的 Al结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、Cl 结构域、C2结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各处连接 于所述因子VIII多肽：（i)所述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B结构域的全 部或一部分，那么在所述因子VIII多肽的所述B结构域内；（iii)在所述因子VIII多肽的 所述Al结构域内；（iv)在所述因子VIII多肽的所述A2结构域内；(V)在所述因子VIII多 肽的所述A3结构域内；(vi)在所述因子VIII多肽的所述Cl结构域内；或（vii)在所述因 子VIII多肽的所述C2结构域内；且当相较于未连接于XTEN的相应因子VIII蛋白时，所述 融合蛋白（a)在本文所述的体外凝血测定或本领域中已知的其它此类测定中，保留至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400% 或 500% 促 凝血活性，和/或（b)在本文所述的体外结合测定或本领域中已知的其它此类测定中，展现 与抗因子VIII抗体的结合降低。在一个实施方案中，在前述重组因子VIII融合蛋白中，至 少一个XTEN在于选自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1至6个氨基酸处或内的位点 处连接于所述因子VIII多肽。在其它实施方案中，本发明提供包含因子VIII多肽和至少 第一延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有 al酸性间隔子区域的Al结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构域、含有a3酸性间隔 子区域的A3结构域、Cl结构域、C2结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述第 一 XTEN在选自表6及表7的插入位点处连接于所述因子VIII多肽且其中相较于未连接于 XTEN的相应因子VIII蛋白，当通过本文所述的体外凝血测定或本领域中已知的其它此类 测定进行测量时，所述融合蛋白保留至少约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、 90%、100%、200%、300%、400%或500%的促凝血活性。未连接于XTEN的因子VIII蛋白 的非限制性实例包括天然FVIII、BDD FVIII、pBC100和来自表1的序列。在重组因子VIII 融合蛋白的另一实施方案中，当最优比对时，因子VIII多肽与选自由以下组成的组的序列 具有至少约80%序列同一性、或约90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约 95%、或约96%、或约97%、或约98%或约99%至约100%序列同一性：表1的序列、图3 中描绘的序列和图4中描绘的序列。在另一实施方案中，融合蛋白包含至少另一在所述因 子VIII多肽的C末端处或在所述因子VIII多肽的B结构域内连接于所述因子VIII多肽 或任选置换所述因子VIII多肽的B结构域的XTEN。在一特定实施方案中，融合蛋白包含至 少一个位于所述因子VIII多肽的B结构域内或任选置换所述因子VIII多肽的B结构域的 XTEN序列。在另一特定实施方案中，融合蛋白包含至少一个在所述因子VIII多肽的C末端 处连接于所述因子VIII多肽的XTEN序列。在一个实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包 含人因子VIII的B结构域缺失的变体，其中关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，所 述B结构域缺失自在约氨基酸残基编号741至约750处的第一位置开始且在于氨基酸残基 编号1635至约1648处的第二位置处结束。在另一实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包 含在所述因子VIII多肽的C末端处连接于所述因子VIII多肽的第一 XTEN序列，和在所述 因子VIII多肽的B结构域内或置换所述因子VIII多肽的B结构域的至少第二XTEN，其中 关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，所述第二XTEN连接于约氨基酸残基编号741 至约750的C末端和氨基酸残基编号1635至约1648的N末端，其中所述XTEN的累积长 度是至少约100个氨基酸残基。在一个实施方案中，在前述融合蛋白中，第二XTEN在N745 至P1640之间、或在S743至Q1638之间、或在P747至V1642之间、或在N745与Q1656之 间、或在N745与S1657之间、或在N745与T1667之间、或在N745与Q1686之间、或在R747 与V1642之间、或在T751与T1667之间连接因子VIII氨基酸。在一个实施方案中，重组 因子VIII融合蛋白包含当最优比对时，相较于选自表21的具有类似长度的序列具有至少 约80%序列同一性、或至少约90%、或至少约91%、或至少约92%、或至少约93%、或至少 约94%、或至少约95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %至约 100%序列同一性的序列。在另一实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、 任选第三XTEN、任选第四XTEN、任选第五XTEN和任选第六XTEN，其中所述第二、第三、第四、 第五或第六XTEN各自在选自由以下组成的组的第二、第三、第四、第五或第六位点处连接 于所述因子VIII多肽：来自表5、表6、表7、表8和表9的插入位点；在成熟因子VIII的氨 基酸残基 32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的6个氨 基酸内的位置；在所述因子VIII多肽的任何两个邻近结构域之间的位置，其中所述两个邻 近结构域选自由Al和A2结构域、A2和B结构域、B和A3结构域、A3和Cl结构域、以及Cl 和C2结构域组成的组；在所述因子VIII多肽的B结构域内的位置，其中所述第二XTEN连接 于天然因子VIII序列的约氨基酸残基编号741至约750的C末端和氨基酸残基编号1635 至约1648的N末端；和所述因子VIII多肽的C末端。在一个实施方案中，第一 XTEN与第 二XTEN相隔至少10个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少200个氨基酸、 至少300个氨基酸或至少400个氨基酸。在包含至少第二XTEN、任选第三XTEN、任选第四 XTEN、任选第五XTEN和任选第六XTEN的重组因子VIII融合蛋白的一个实施方案中，当最 优比对时，各XTEN相较于选自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列组成的组的 具有类似长度的XTEN，具有至少约80%序列同一性、或至少约90%、或至少约91 %、或至少 约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或 至少约98%、或至少约99%、或约100%序列同一性。在重组因子VIII融合蛋白的另一实 施方案中，所述重组因子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、任选第三XTEN、任选第四XTEN、 任选第五XTEN和任选第六XTEN。在优选实施方案中，当向受试者施用时，重组因子VIII融 合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或4小时、或6小时、或12小时、或13小时、或14小 时、或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或96小时、或120小时、或144小时、或7 天、或14天、或21天，其中所述受试者选自人和因子VIII/血管性血友病因子双重敲除小 鼠。另外，在这个段落的实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，融合蛋白展 现与抗因子VIII抗体的结合降低或保留的促凝血活性更大或两者。在一个实施方案中，当 各自通过体外凝血测定加以测定时，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，在抗FVIII抗 体存在下，重组因子VIII融合蛋白的促凝血活性大至少30 %、或40 %、50%、80%、100%、 200%、300%、400%或500%。在一个实施方案中，使用毕提斯达（Bethesda)测定，利用选 自由表10的抗体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者的多克隆抗体组成的组的 抗因子VIII抗体测定融合蛋白与抗因子VIII抗体的降低的结合，其中融合蛋白的结合降 低和促凝血活性保留是由相较于未连接于XTEN的因子VIII的毕提斯达效价，融合蛋白的 毕提斯达效价降低至少约2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200个毕提斯 达单位所证明。
[0015] 在一个实施方案中，重组因子VIII融合蛋白可例如包含一个或多个XTEN，其中当 最优比对时，所述XTEN相较于一个或多个选自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有 类似长度的XTEN具有至少约80 %序列同一性、或约90 %、或约91 %、或约92 %、或约93 %、 或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%或约99%至约100%序列同一性。
[0016] 在另一方面，本发明涉及包含呈特定N末端至C末端构型的FVIII和一个或多个 XTEN的重组因子VIII融合蛋白。在CFXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供一种式 I的重组因子VIII融合蛋白：
[0017] (XTEN) X-CF- (XTEN) y I
[0018] 其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括与来自表1的序列 具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约 98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列；X是0或1且y是0或1，其中x+y彡1 ;且 XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80%、 或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约 99%或100%序列同一性的序列。因此，CFXTEN融合组合物可具有XTEN-CF、XTEN-CF-XTEN 或CF-XTEN构型。
[0019] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式II的重组因子VIII融合 蛋白：
[0020] (XTEN) x- (S) x- (CF) - (XTEN) y II
[0021] 其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括与表1中阐述的序 列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少 约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸 残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；X是〇或1且y 是0或1，其中x+y彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐 述的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、 或至少约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列。
[0022] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种重组因子VIII融合蛋白，其 中所述融合蛋白具有式III :
[0023] (XTEN) x- (S) x- (CF) - (S) y- (XTEN) y III
[0024] 其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括与表I中阐述的序 列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少 约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸 残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；X是〇或1且y 是O或1，其中x+y彡I ;且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐 述的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、 或至少约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列。
[0025] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IV的重组因子VIII融合 蛋白：
[0026] (Al) - (XTEN) u- (A2) - (XTEN) v- (B) - (XTEN) w- (A3) - (XTEN) x- (Cl) - (XTEN) y- (C2)-(XTEN) JV
[0027] 其中就各次出现独立而言，Al是FVIII的Al结构域;A2是FVIII的A2结构域； A3是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域，其可为所述B结构域的片段或剪接变体； Cl是FVIII的Cl结构域；C2是FVIII的C2结构域；v是0或I 是0或I ;x是0或I ;y 是〇或I ;y是〇或1，前提是u+v+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括 但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约 96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列。
[0028] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式V的重组因子VIII融合 蛋白：
[0029] (XTEN) t- (S) a- (Al) - (S) b- (XTEN) a- (S) b- (A2) - (S) c- (XTEN) v- (S) c- (B) - (S) d- (XTEN) w- (S) d- (A3) - (S) e- (XTEN) x- (S) e- (CI) - (S) f- (XTEN) y- (S) f- (C2) - (S) g- (XTEN) z V
[0030] 其中就各次出现独立而言，Al是FVIII的Al结构域;A2是FVIII的A2结构域;A3 是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域，其可为所述B结构域的片段或剪接变体；Cl 是FVIII的Cl结构域；C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残 基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；a是0或I ;b是0或 1;(：是0或1;(1是0或1;6是0或1汀是0或1出是0或14是0或1 ;11是0或1;￥是 〇或I ;W是0或l，x是0或I ;y是0或I ;z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN 是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80%、或至 少约90 %、或至少约95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %或 100%序列同一性的序列。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11和 12的序列。
[0031] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VI的重组因子VIII融合 蛋白：
[0032] (XTEN) u- (S) a- (Al) - (S) b- (XTEN) v- (S) b- (A2) - (S) c- (XTEN) w- (S) c- (A3) - (S) d- (XTEN) x- (S) d- (Cl) - (S) c- (XTEN) y- (S) c- (C2) - (S) f- (XTEN) z VI
[0033] 其中就各次出现独立而言，Al是FVIII的Al结构域;A2是FVIII的A2结构域;A3 是FVIII的A3结构域；Cl是FVIII的Cl结构域；C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至 约50个之间的氨基酸残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子 序列；a是0或l;b是0或l;c是0或l;d是0或l;e是0或l;f是0或l;u是0或l;v 是0或I ;w是0或l，x是0或I ;y是0或I ;z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN 是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80%、或至 少约90 %、或至少约95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %或 100%序列同一性的序列。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11和 12的序列。
[0034] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VII的重组因子VIII融 合蛋白：
[0035] (SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S) x-( FV III_l-745)-(S)y-(XTEN)y-(S) y- (FVII I_1640-2332) - (S) z- (CS) z- (XTEN) z VII
[0036] 其中就各次出现独立而言，SP是信号肽，优选具有序列MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO :1611)，CS是表12中所列的裂解序列，S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的 可任选包括可与限制位点相容的氨基酸的间隔子序列，"FVIII_l-745"是因子FVIII的残 基 1-745 且"FVIII_1640-2332"是 FVIII 的残基 1640-2332，x 是 0 或 l，y 是 0 或 1，且 z 是 0或1，其中x+y+z > 2 ;且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐 述的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、 或至少约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列。在式VII的一个实施方案中，间 隔子序列是GPEGPS (SEQ ID NO :1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或 选自表11和12的序列。
[0037] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VIII重组因子VIII融合 蛋白：
[0038] (Al) - (S) a- (XTEN) v-⑶ a- (A2) - (BI)-⑶ b- (XTEN) w-⑶ b- (B2) - (A3) - (S) c- (XTEN) x- (S) c- (Cl) - (S) d- (XTEN) y- (S) d- (C2) - (S) e- (XTEN) z VIII
[0039] 其中就各次出现独立而言，Al是FVIII的Al结构域；A2是FVIII的A2结构域；BI 是B结构域的可具有FVIII的残基741至743-750或者FVIII的约残基741至约残基745 的片段；B2是B结构域的可具有FVIII的残基1635-1686至1689或者FVIII的约残基1640 至约残基1689的片段；A3是FVIII的A3结构域；Cl是FVIII的Cl结构域；C2是FVIII的 C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可任选包括可与限制位点相容的裂 解序列或氨基酸的间隔子序列；a是0或l;b是0或l;c是0或l;d是0或l;e是0或1; f是0或l;u是0或l;v是0或l;w是0或l，x是0或l;y是0或I ;z是0或1，前提是 u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序 列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少 约98%、或至少约99%或100%序列同一性的序列。在式VIII的一个实施方案中，间隔子 序列是GPEGPS (SEQ ID NO: 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自 表11和12的序列。
[0040] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IX的重组因子VIII融合 蛋白：
[0041] (AIn) - (S) a- (XTEN) t- (S) b- (Alc) - (A2N) - (S) c- (XTEN) u- (S) d- (A2C) - (Bn) - (S) e- (XTEN) v- (S) f- (Bc) - (A3N) - (S) g- (XTEN) w- (S) b- (A3C) - (C1N) - (S)厂（XTEN) x- (S) 厂（Clc) - (C2N)-⑶ k- (XTEN) y-⑶ f (C2c)-⑶ m- (XTEN) JX
[0042] 其中就各次出现独立而言，八^是八丨结构域的自至少残基编号1(相对于天然成熟 FVIII加以编号）至至多残基编号371的片段，A1。是Al结构域的自至少残基编号2至至 多残基编号372的片段，前提是所述AI n片段的序列在所述Al。片段中不重复;A2 1<是A2结 构域的自至少残基编号373至至多残基编号739的片段，A2。是A2结构域的自至少残基编 号374至至多残基编号740的片段，前提是所述A2N片段的序列在所述A2。片段中不重复； 81<是B结构域的自至少残基编号741至至多残基编号1647的片段，B。是B结构域的自至少 残基编号742至至多残基编号1648的片段，前提是所述B n片段的序列在所述B。片段中不 重复；八31^是A3结构域的自至少残基编号1649至至多残基编号2019的片段，A3。是A3结构 域的自至少残基编号1650至至多残基编号2019的片段，前提是所述A3 N片段的序列在所述 A3。片段中不重复；Cl 1<是Cl结构域的自至少残基编号2020至至多残基编号2171的片段， C1。是Cl结构域的自至少残基编号2021至至多残基编号2172的片段，前提是所述Cl N片段 的序列在所述C1。片段中不重复；C2 1<是C2结构域的自至少残基编号2173至至多残基编号 2331的片段，C2。是C2结构域的自至少残基编号2174至至多残基编号2332片段，前提是所 述C2 N片段的序列在所述C2。片段中不重复；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的 可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；a是0或I ;b是0或I ;c 是0或l;d是0或l;e是0或l;f是0或l;g是0或l;h是0或l;i是0或l;j是0或 1冰是0或1;1是0或1;111是0或14是0或1 ;11是0或1;￥是0或1#是0或1，1是0 或l;y是〇或l;z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重组 多肽，包括但不限于相较于一个或多个选自表4的具有类似长度的XTEN，具有至少约80% 序列同一性、或约90%、或约91%、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、 或约97%、或约98%或约99%至约100%序列同一性的序列。在式IX的一个实施方案中， 间隔子序列是GPEGPS (SEQ ID NO: 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸 或选自表11和12的序列。在式IX的另一实施方案中，Z是1。在式IX的融合蛋白的另一 实施方案中，V是1且关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，XTEN连接于约氨基酸残 基编号741至约750的C末端和氨基酸残基编号1635至约1648的N末端。在式IX的融 合蛋白的另一实施方案中，t、u、v、w、x、y和z的总和等于2、3、4、5或6。在式IX的另一实 施方案中，t、u、v、w、X、y和z的总和等于2,且V是1且z是1。在式IX的融合蛋白的另 一实施方案中，t、u、v、w、X、y和z的总和等于3, V和z各自等于1，且t、u、w、X或y的任 一者是1。在式IX的另一实施方案中，t、u、v、w、x、y和z的总和等于4, V和w和z各自等 于1，且t、u、X或y的两者是1。在式的IX融合蛋白的另一实施方案中，XTEN的累积长度 在约84个至约3000个氨基酸残基之间。在式IX的另一实施方案中，至少一个XTEN是紧 靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨 基酸残基编号 32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在式1父 的融合蛋白的另一实施方案中，各XTEN在选自表5、表6、表7、表8和表9的位点处连接于 所述融合蛋白。在式IX的融合蛋白的另一实施方案中，当最优比对时，各XTEN相较于选自 由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列组成的组的具有类似长度的XTEN具有至 少约80%、或约90%、或至少约91%、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至 少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%、或约100%序列 同一I"生。
[0043] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式X的第一重组因子VIII 多肽：
[0044] (Al)-al-(A2)-a2-[B] X
[0045] 和一种包含式XI的第二多肽：
[0046] a3-(A3)-(Cl)-(C2) XI
[0047] 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在；其中Al是因子 VIII的Al结构域；A2是因子VIII的A2结构域；[B]是因子VIII的B结构域、其片段或被 缺失;A3是因子VIII的A3结构域；Cl是因子VIII的Cl结构域；C2是因子VIII的C2结 构域；al、a2和a3是酸性间隔子区域；其中所述Al结构域包含XTEN容许环-I (Al-I)区域 和XTEN容许环-2(Α1-2)区域；其中所述A2结构域包含XTEN容许环-1(A2-1)区域和XTEN 容许环-2 (A2-2)区域；其中所述A3结构域包含XTEN容许环-I (A3-1)区域和XTEN容许 环-2(A3-2)区域；其中XTEN序列插入区域Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l或A3-2的至少一 者中；且其中所述重组因子VIII蛋白展现促凝血活性。在异二聚体的一个实施方案中，第 一多肽和第二多肽形成包含式（Al) - al - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的 单一多肽链。在一个前述实施方案中，"融合"是指肽键。
[0048] 在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式X的第一重组因子VIII 多肽：
[0049] (Al)-al-(A2)-a2-[B] X
[0050] 和一种包含式XI的第二多肽：
[0051] a3-(A3)-(Cl)-(C2) XI
[0052] 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在；其中Al是因子 VIII的Al结构域;A2是因子VIII的A2结构域；[B]是因子VIII的B结构域、其片段或 被缺失;A3是因子VIII的A3结构域；Cl是因子VIII的Cl结构域；C2是因子VIII的C2 结构域；al、a2和a3是酸性间隔子区域；其中XTEN序列插入a3中；且其中所述重组因子 VIII蛋白展现促凝血活性。在异二聚体的一个实施方案中，第一多肽和第二多肽形成包含 式（Al) - al - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的单一多肽链。在一个前述实施 方案中，"融合"是指肽键。
[0053] 在前述式X和XI多肽的实施方案中，XTEN容许环包含在表面暴露的可挠性环结构 内，且其中根据以DSSP数据库的登录号2R7E储存的成熟因子VIII的二级结构，Al-I位于 β链1与β链2之间，A1-2位于β链11与β链12之间，A2-1位于β链22与β链23 之间，Α2-2位于β链32与β链33之间，Α3-1位于β链38与β链39之间且Α3-2位 于β链45与β链46之间。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含Al-I的表面 暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸15至约氨基酸45的区域。 在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，Al-I对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸 18至约氨基酸41的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含Α1-2的表面暴 露的可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸201至约氨基酸232的区域。 在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，Α1-2对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸 218至约氨基酸229的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含Α2-1的表面暴 露的可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸395至约氨基酸421的区域。 在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，Α2-1对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸 397至约氨基酸418的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含Α2-2的表面 暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸577至约氨基酸635的区 域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，Α2-2对应于天然成熟人因子VIII中自约氨 基酸595至约氨基酸607的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含A3-1的 表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸1705至约氨基酸1732 的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，A3-1对应于天然成熟人因子VIII中自 约氨基酸1711至约氨基酸1725的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，包含 A3-2的表面暴露的可挠性环结构对应于天然人成熟人因子VIII中自约氨基酸1884至约 氨基酸1917的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，A3-2对应于天然成熟人因 子VIII中自约氨基酸1899至约氨基酸1911的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施方 案中，XTEN序列插入区域41-131-2^2-1、42-2^3-1或43-2的至少两者中。在前述式父 和XI多肽的其它实施方案中，XTEN序列是紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下 组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、220、224、336、339、399、416、 603、1656、1711、1725、1905 和1910。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，另一XTEN 序列插入a3酸性间隔子区域中。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，另一 XTEN序列 插入紧靠对应于氨基酸1656的氨基酸的下游的a3酸性间隔子中。在前述式X和XI多肽 的其它实施方案中，Al结构域包含XTEN容许环-I(Al-I)区域和XTEN容许环-2 (A1-2)区 域，其中A2结构域包含XTEN容许环-1(A2-1)区域和XTEN容许环-2(A2-2)区域，且其中 A3结构域包含XTEN容许环-I (A3-1)区域和XTEN容许环-2 (A3-2)区域，且其中另一 XTEN 序列插入区域41-131-2、42-132-2、43-1或43-2的至少一者中。在前述式乂和乂1多肽 的其它实施方案中，另一 XTEN序列是紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成 的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、220、224、336、339、390、399、416、 603、1656、1711、1725、1905和1910。在式乂和乂1多肽的前述实施方案中，融合蛋白展现未 连接于XTEN的相应因子VIII的促凝血活性的至少约30%、40%、50%、60%、70%或80% 或90%，其中所述促凝血活性是通过体外凝血测定加以测定。
[0054] 在所有实施方案中，当在细胞培养基中表达且通过体外凝血测定加以测定时，多 肽可例如展现体外促凝血活性超过0. 5IU/ml或I. 0或1. 5或2. 0IU/ml。促凝血活性可通 过显色测定、单级凝结测定（例如aPTT)或两者测量。
[0055] 在一些实施方案中，其中重组因子VIII融合蛋白包含因子VIII以及至少第一和 第二XTEN，所述至少第一 XTEN与所述至少第二XTEN相隔至少10个氨基酸、至少50个氨基 酸、至少100个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸或至少400个氨基酸。
[0056] 在优选实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包含因子VIII以及至少第一 XTEN 和任选至少第二、或任选至少第三、或任选至少第四XTEN，所述融合蛋白相较于未连接于 XTEN的相应因子VIII展现与抗因子VIII抗体的结合降低。可体内或通过体外测定评估降 低的结合。在一个实施方案中，体外测定是ELISA测定，其中相较于未连接于XTEN的FVIII， 抗FVIII抗体与融合蛋白的结合降低至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或至少 约40 %或更多。在另一实施方案中，体外测定是毕提斯达测定，其中融合蛋白的结合降低是 由相较于未连接于XTEN的因子VIII的毕提斯达效价，融合蛋白的毕提斯达效价降低至少 约2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200个毕提斯达单位所证明。在体外 测定中，抗因子VIII抗体选自表10的抗体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者 的多克隆抗体。在展现与因子VIII抑制剂抗体的结合降低的包含因子VIII以及至少第一 和第二XTEN的重组因子VIII融合蛋白的特定实施方案中，所述第一XTEN在所述因子VIII 多肽的C2结构域内连接于所述因子VIII多肽，且所述第二XTEN在所述因子VIII多肽的 Al或A2结构域内连接于所述因子VIII多肽，其中相较于未连接于XTEN的相应因子VIII， 所述融合蛋白展现与因子VIII抑制剂抗体的结合降低，其中所述因子VIII抑制剂抗体能 够结合位于所述A1、A2或C2结构域内的表位，且此外，其中所述融合蛋白展现促凝血活性。 在前述融合蛋白的一个实施方案中，第二XTEN在因子VIII多肽的A2结构域内连接于所述 因子VIII多肽且因子VIII抑制剂抗体结合因子VIII多肽的A2结构域。在前述融合蛋白 的另一实施方案中，第二XTEN在因子VIII多肽的C2结构域内连接于所述因子VIII多肽且 因子VIII抑制剂抗体结合因子VIII多肽的C2结构域。相较于未连接于XTEN的相应因子 VIII，当通过ELISA测定加以测定时，抗因子VIII抗体与融合蛋白的结合降低至少约5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%，其中所述抗因子VIII抗体选自由表10中的抗 体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病受试者的多克隆抗体组成的组。前述融合蛋 白可进一步包含至少三个XTEN，其中至少第三XTEN在选自以下的位点处连接于因子VIII : 在B结构域内或置换B结构域、在C末端处、以及在选自表7或表9的插入位点的1、2、3、 4、5或6个氨基酸处或内。在与抗因子VIII抗体的结合降低的实施方案中，相较于未连接 于XTEN的相应因子VIII，当通过体外凝血测定（例如显色或单级凝结测定）加以测定时， 融合蛋白在抗FVIII抗体存在下的促凝血活性大至少10%、20%、30%、40%、50%、80%、 100%、200%、300%、400%或 500%或更多。
[0057] 在所有实施方案中，融合蛋白的XTEN的特征可例如在于XTEN包含至少36、或至 少42、或至少72、或至少96、或至少144、或至少288、或至少400、或至少500、或至少576、 或至少600、或至少700、或至少800、或至少864、或至少900、或至少1000、或至少2000至 约3000个氨基酸残基或甚至更多残基；甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、谷 氨酸（E)和脯氨酸⑵残基的总和占 XTEN的总氨基酸残基的至少约80%、或至少约90%、 或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99% ;XTEN大致 上是非重复的以致（i)XTEN不含有三个相同连续氨基酸，除非氨基酸是丝氨酸；（ii)至少 约80%的XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述序列基序各自包含约9至约14、或约12 个由四至六个选自甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、谷氨酸（E)和脯氨酸 (P)的氨基酸组成的氨基酸残基，其中在各非重叠序列基序中，任何两个连续氨基酸残基 都不出现超过两次；或（iii)XTEN序列的子序列计分小于10 ;XTEN具有大于90%、或大于 95%、或大于99%无规卷曲形成率（如通过GOR算法所确定）；XTEN具有小于2% α螺旋 和2% β折叠（如通过Chou-Fasman算法所确定）；当通过ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析时，XTEN缺 乏预测的T细胞表位，其中关于通过所述算法进行所述预测的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ阈值计分的阈值 是-9,且其中所述融合蛋白展现终末半衰期长于至少约12小时、或至少约24小时、或至 少约48小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或至少约144小时、 或至少约21天或更长。在一个实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包含可与另一 XTEN相 同或不同的至少第二、或至少第三、或至少第四ΧΤΕΝ。根据一种不同方法，当最优比对时， CFXTEN融合蛋白的至少一个、至少第二、或至少第三、或至少第四XTEN相较于一个或多个 选自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有类似长度的XTEN各自具有至少约80% 序列同一性、或约90%、或约91%、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、 或约97%、或约98%或约99%至约100%序列同一性。在另一不同方法中，CFXTEN融合蛋 白的至少一个、至少第二、或至少第三、或至少第四XTEN相较于选自以下的序列各自具有 至少90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、 或约 98 %、或约 99 %至约 100 %序列同一'注：AE42_1、AE42_2、AE42_3、AG42_1、AG42_2、 AG42_3、AG42_4、AE144_1 A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、 AE144_5A、AE144_6B、AG144_1、AG144_2、AG144_A、AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、 AG144_4、AE288_1、AE288_2、AG288_1 和 AG288_2。
[0058] 在一个实施方案中，CFXTEN重组因子VIII融合蛋白的因子VIII组分包含一个、两 个或三个选自相对于成熟人因子VIII编号的残基R1648、Y1680和R1689的氨基酸取代，其 中所述取代选自丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。所述取代的非限制性实例包括R1648A、Y1680F 和 R1689A。
[0059] 在另一实施方案中，当通过尺寸排阻色谱或类似方法测量时，CFXTEN融合蛋白展 现表观分子量因子至少约1. 3、或至少约2、或至少约3、或至少约4、或至少约5、或至少约 6、或至少约7、或至少约8、或至少约9、或至少约10。
[0060] 在CFXTEN融合蛋白的一些实施方案中，一个或多个XTEN将通过一个或两个各自 可由选自由因子XIa、因子Xlla、激肽释放酶（kallikrein)、因子Vila、因子IXa、因子Xa、 因子 IIa(凝血酶）、弹性蛋白酶-2 (Elastase-2)、MMP-12、MMP13、MMP-17 和 MMP-20 组成的 组的哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接于FVIII，其中由所述哺乳动物蛋白酶在所述裂 解序列处进行的裂解使因子VIII序列自XTEN序列释放，且其中释放的因子VIII序列相较 于未裂解融合蛋白展现促凝血活性增加。在一个实施方案中，裂解序列可由因子XIa裂解。
[0061] 根据一种不同方法，CFXTEN融合蛋白包含至少三个位于因子VIII多肽的不同位 置处的XTEN，其中所述不同位置选自：在来自选自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1至 6个氨基酸处或内的插入位置；在成熟因子VIII的氨基酸残基32、220、224、336、339、390、 399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的1至6个氨基酸处或内的位置；在因子￥111 序列中任何两个邻近结构域之间的位置，其中所述两个邻近结构域选自由Al和A2、A2和B、 B和A3、A3和Cl、以及Cl和C2组成的组；关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，在 自在约氨基酸残基编号741至约750处的第一位置开始且在于氨基酸残基编号1635至约 1648处的第二位置处结束的内部B结构域缺失内的位置；和因子VIII序列的C末端，其中 多个XTEN的累积长度是至少约100至约3000个氨基酸残基且其中融合蛋白相较于未连接 于XTEN的相应因子VIII保留至少约30%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约 80%、或约90%的促凝血活性，其中促凝血活性是通过体外凝血测定加以测定。在一个前 述实施方案中，当向受试者施用时，融合蛋白相较于缺乏所述XTEN的相应因子VIII多肽展 现终末半衰期延长，其中当向受试者施用时，所述融合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、 或4小时、或6小时、或12小时、或13小时、或14小时、或16小时、或24小时、或48小时、 或72小时、或96小时、或120小时、或144小时、或7天、或14天、或21天。在一个实施方 案中，受试者选自由人和因子VIII/血管性血友病因子双重敲除小鼠组成的组。在一个前 述实施方案中，融合蛋白不包含选自GTPGSGTASSSP(SEQ ID N0:31)、GSSTPSGATGSP(SEQ ID N0:32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID N0:33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID N0:34)和
[0062] GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP (SEQ ID NO:59)的序列。在另一前述实施方案中，融合蛋白不含有由
[0063] GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID N0:59)、
[0064] PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTAS SS(SEQ ID NO:71)或
[0065] PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS(SEQ ID NO :80)组成的XTEN序列。
[0066] 在另一方面，本发明涉及相较于未连接于XTEN的FVIII具有增强的药代动力学 性质，包括提高的参数的CFXTEN融合蛋白，其中所述增强的性质包括但不限于相较于未连 接于XTEN的FVIII，终末半衰期变长、曲线下面积变大、血液浓度保持在治疗窗内的时间增 力口、导致血液浓度在治疗窗内的连续剂量之间的时间增加、以及以IU计的可施用的剂量随 时间降低，但仍然导致血液浓度高于为促凝血作用所需的阈值浓度。在一些实施方案中，当 向受试者施用时，CFXTEN融合蛋白相较于缺乏所述XTEN的相应因子VIII多肽展现终末半 衰期延长。受试者可为人或小鼠，如因子VIII/血管性血友病因子双重敲除小鼠。在一个前 述实施方案中，当向受试者施用时，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，CFXTEN展现终 末半衰期长至少约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约10倍、或约20倍。在一个实 施方案中，当向受试者施用时，CFXTEN融合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或4小时、或 6小时、或12小时、或13小时、或14小时、或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或 96小时、或120小时、或144小时、或7天、或14天、或21天。在其它实施方案中，实施方案 的融合蛋白的增强的药代动力学性质是相较于未连接于XTEN且以类似剂量向受试者施用 的相应FVIII，维持有需要的受试者中的促凝血融合蛋白的循环血液浓度高于0. 01IU/ml、 或(λ 05IU/ml、或(λ lIU/ml、或(λ 2IU/ml、或(λ 3IU/ml、或(λ 4IU/ml 或(λ 5IU/ml 的阈值浓 度持续的时期长至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、 或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍的性质。半 衰期和高于阈值浓度花费的时间的增加允许相较于未连接于XTEN的相应FVIII，降低给药 频率以及降低向受试者施用的融合蛋白（以摩尔当量计）的量。在一个实施方案中，相较于 未连接于XTEN且使用类似剂量方案向受试者施用的相应FVIII，使用治疗有效剂量方案向 受试者施用主题融合蛋白导致融合蛋白的血液水平的至少两个连续Cmax峰值和/或Cmin 谷底值之间的时间增加至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至 少8倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍或更高。
[0067] 在优选实施方案中，CFXTEN融合蛋白相较于未连接于XTEN的相应因子VIII保留 至少约30 %、或约40 %、或约50 %、或约60 %、或约70 %、或约80 %、或约90 %的促凝血活 性，其中促凝血活性是通过体外凝血测定，如但不限于显色测定或单级或两级凝结测定加 以测定。
[0068] 根据一种不同方法，本发明提供包含因子VIII多肽和至少一个延伸重组多肽 (XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含Al结构域、A2结构域、A3 结构域、Cl结构域、C2结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述至少一个XTEN 在选自残基编号 18-32、或 40、或 211-224、或 336-403、或 599、或 745-1640、或 1656-1728、 或1796-1804、或1900-1912、或2171-2332的插入位点处连接于所述因子VIII多肽；且其 中所述融合蛋白相较于未连接于XTEN的相应因子VIII保留至少约30%、或约40%、或约 50%、或约60%、或约70%、或约80%、或约90%的促凝血活性。在一个前述实施方案中， 融合蛋白包含至少第二XTEN、或至少第三、或至少第四XTEN，其中所述XTEN在于选自表5、 表6、表7、表8和表9的位点的1至6个氨基酸处或内的位点处连接于因子VIII。在另一 实施方案中，本发明提供一种重组因子VIII融合蛋白，其进一步包含在选自表5、表6、表7、 表8、表9的插入位点处、在于来自图8的一个或多个插入位置处的插入位置的N末端或C 末端侧的6个氨基酸处或内、以及在一个或多个来自图9的插入范围内连接于所述FVIII 多肽的至少第二XTEN、或至少第三、或至少第四XTEN，其中至少两个XTEN由具有至少100 至约400个氨基酸的氨基酸序列分隔。
[0069] 本发明提供CFXTEN，其中XTEN的XTEN半径比率是至少2. 3或至少2. 5,且由具有 至少约20个氨基酸残基、或至少约50、或至少约100、或至少约200、或至少约300、或至少 约400个氨基酸残基的氨基酸序列分隔。在其它实施方案中，CFXTEN包含至少四个XTEN， 其中所述XTEN的XTEN半径比率是至少2. 3、或至少2. 5、或至少2. 8，且其中四个XTEN中连 接于融合蛋白的至少三者由具有至少约20个氨基酸残基、或至少约50、或至少约100、或至 少约200、或至少约300、或至少约400个氨基酸残基的氨基酸序列分隔，且第四XTEN连接 在B结构域（或其片段）内或在C结构域（或其末端）内。
[0070] 在一些实施方案中，主题组合物被构造来相较于未连接于XTEN的相应FVIII， 对受试者中的清除受体具有降低的结合亲和力。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白展 现对FVIII的清除受体的结合亲和力在未连接于XTEN的相应FVIII的结合亲和力的约 0. 01% -30%、或约0. 1 %至约20%、或约1 %至约15%、或约2%至约10%的范围内。在另 一实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应FVIII，对清除受体的亲和力降低的融合蛋白 的主动清除降低且半衰期相应增加长至少约2倍、或3倍、或至少4倍、或至少约5倍、或至 少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或 至少约15倍、或至少约17倍、或至少约20倍。
[0071] 在一实施方案中，本发明提供一种包含FVIII和一个或多个XTEN的重组因子VIII 融合蛋白，其中所述融合蛋白相较于未连接于XTEN的FVIII展现在生理条件下的溶解度增 加至少3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或 至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。
[0072] 在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的任何实施方案的融 合蛋白和药学上可接受的载体。
[0073] 在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的凝血病变的方法，其包括向所 述受试者施用包含凝结有效量的药物组合物的组合物。在所述方法的一个实施方案中，在 所述施用之后，促凝血因子VIII的血液浓度维持在约0. 05、或1、或I. 5IU/ml或更高持续 至少所述施用之后48小时。在另一实施方案中，本发明提供一种使受试者的血液凝结的方 法，其包括使凝结有效量的药物组合物与血液接触。
[0074] 在另一实施方案中，本发明提供一种治疗具有因子VIII的循环抑制剂的受试者 的凝血病变的方法，其包括向所述受试者施用包含治疗有效量的CFXTEN的药物组合物的 组合物，其中所述组合物相较于包含未连接于XTEN且使用类似量施用的相应因子VIII的 组合物展现在所述受试者中的促凝血活性更大。在所述方法的一个实施方案中，凝血病变 是甲型血友病。在另一实施方案中，凝血病变是创伤或手术或感染的结果。
[0075] 本发明提供一种治疗受试者的流血事件的方法，其包括向所述受试者施用包含凝 结有效量的CFXTEN药物组合物的组合物，其中所述凝结有效量的融合蛋白相较于未连接 于XTEN且使用类似量向所述受试者施用的相应因子VIII遏止流血事件持续的时期长至少 3倍、或至少4倍、或至少5倍。未连接于XTEN的相应因子VIII的非限制性实例包括天然 FVIII、表 1 的序列、BDD-FVIII 和 pCB0114FVIII。
[0076] 在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗甲型血友病患者的医药方案的 CFXTEN重组因子VIII融合蛋白，所述方案包括包含CFXTEN融合蛋白的药物组合物。在所 述医药方案的一个实施方案中，方案进一步包括确定为在甲型血友病患者中实现止血所需 的包含CFXTEN的药物组合物的量的步骤。在另一实施方案中，用于治疗甲型血友病受试者 的医药方案包括以有效量连续两剂或更多剂向受试者施用药物组合物，其中相较于未连接 于XTEN且使用类似剂量施用的因子VIII，所述施用导致至少一个、两个或三个与甲型血友 病相关的参数较大改善至少10%、或20%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或 80%、或90%。改善的参数的非限制性实例包括促凝血FVIII的血液浓度、活化的部分凝 血酶原（aPTT)测定时间减少、单级或两级凝结测定时间减少、流血事件的发作延迟、显色 测定时间减少、流血测定时间减少、流血事件解决、或相对于天然FVIII的毕提斯达效价降 低。
[0077] 在另一方面，本发明提供编码CFXTEN融合蛋白的任一实施方案的融合蛋白的分 离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸是编码实施方案的CFXTEN融合蛋白的序列 的互补序列。在一个实施方案中，分离的核酸进一步包含编码信号肽的序列，其中所述序列 是ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID N0:1613)或 其互补序列。在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码融合蛋白的核酸或其互补序列 的表达载体。在另一实施方案中，本发明提供一种包含前述表达载体的分离的宿主细胞。在 另一实施方案中，本发明提供一种产生任何实施方案的融合蛋白的方法，其包括提供包含 表达载体的宿主细胞；培养所述宿主细胞以实现所述融合蛋白的产生；以及回收所述融合 蛋白。
[0078] 在一个实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其包含当最优比对时，相较 于选自表21的具有类似长度的序列具有至少约80 %序列同一性、或约90 %、或约91 %、或 约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%或约99%至约 100 %序列同一性的多肽。
[0079] 在另一实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序 列：(a)当最优比对时，相较于选自表21的具有类似长度的序列具有至少约80%序列同一 性、或约90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、 或约98%或约99%至约100%序列同一性的序列，或（b) (a)的多核苷酸的互补序列。在 另一实施方案中，分离的核酸包含连接于（a)的核酸的5'末端的序列ATGCAAATAGAGCTCTC CACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID N0:1613)或所述序列的连接于（b) 的3'末端的互补序列。
[0080] 明确涵盖的是重组因子VIII融合蛋白可展现本文公开的性质的一者或多者或任 何组合。
[0081] 以引用的方式并入
[0082] 本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引 用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入 一般。
[0083] 附图简述
[0084] 本发明的特征和优势可通过参照以下详细描述和阐述说明性实施方案的附图加 以进一步说明。
[0085] 图1显示在加工和凝结期间的FVIII构造和结构域的空间排列的图示，且意图表 示天然FVIII与B结构域缺失的变体两者。Al结构域在残基1至372 (编号是相对于成熟 形式的FVIII序列NCBI蛋白质RefSeq NP_000123且涵盖al残基）的范围内，A2结构域 在残基373至740的范围内，B结构域在残基741至1648的范围内，A3结构域在残基1649 至2019 (涵盖a3酸性区域）的范围内，Cl结构域在2020至2172的范围内，且C2结构域 在残基2173至2332的范围内。BDD变体包括在范围741至1648之间的缺失，从而留下 一些剩余残基或不留下剩余残基，其中非限制性BDD剩余序列是SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 1614)。图IA显示在加工之前单链FVIII的结构域构造。箭头指示在残基R372、R740、 R1648和R1689处的在加工和FVIII转化成FVIIIa时被裂解的位点。图IB显示已通过在 R1648残基处裂解加工成异二聚体的FVIII分子，其中A3结构域的a3酸性区域指示在A3 的N末端上。图IC显示通过在R372、R740和R1689残基处裂解加工成FVIIIa异三聚体的 FVIII分子。
[0086] 图2是凝血级联的示意图，其显示通向共同路径的内源性和外源性臂。
[0087] 图3描绘成熟人因子VIII的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1592)。
[0088] 图4描绘缺失一部分B结构域的因子VIII序列（SEQ ID NO: 1593)。
[0089] 图5说明FVIII连接于XTEN的CFXTEN构型的若干实例（XTEN显示为粗波形线）。 在所有情况下，FVIII都可为FVIII的天然或BDD形式，或移除整个B结构域（包括天然裂 解位点）的单链形式。图5A从左到右显示单链因子VIII的三种变化形式，即XTEN连接于 N末端、C末端以及两个XTEN连接于N末端和C末端。图5B从左到右显示成熟异二聚体 FVIII的六种变化形式，即XTEN连接于Al结构域的N末端；XTEN连接于C2结构域的C末 端；XTEN连接于Al结构域的N末端和C2结构域的C末端；XTEN连接于Al结构域的N末端 和A3结构域的N末端；XTEN连接于C2结构域的C末端和通过残余B结构域氨基酸连接于 A3结构域的N末端；以及XTEN连接于Al结构域的N末端、通过残余B结构域氨基酸连接 于A2结构域的C末端以及连接于C2结构域的C末端。图5C从左到右显示，单链因子VIII 的三种变化形式=XTEN连接于Al结构域的N末端，XTEN连接在Al结构域的表面环内以及 XTEN连接在A3结构域的表面环内；XTEN连接在A2结构域的表面环内，XTEN连接在C2结 构域的表面环内以及XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连接于Al结构域的N末端和 在Cl结构域的表面环内以及连接于C结构域的C末端。图ro从左到右显示成熟异二聚体 FVIII的六种变化形式，即XTEN连接于Al结构域的N末端，XTEN连接在Al结构域的表面 环内以及XTEN连接在A3结构域的表面环内；XTEN连接在A2结构域的表面环内，和XTEN连 接在Cl结构域的表面环内以及XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连接于Al结构域的 N末端，XTEN连接在Al结构域的表面环内，XTEN连接在A3结构域的表面环内以及XTEN连 接于C2结构域的C末端；XTEN连接于Al结构域的N末端，XTEN通过B结构域的残余氨基 酸连接于A3结构域的N末端以及XTEN连接在C2结构域的表面环内；XTEN连接在A2结构 域的表面环内，XTEN通过B结构域的残余氨基酸连接于A3结构域的N末端，XTEN连接在 Cl结构域的表面环内以及XTEN连接于C2结构域的C末端；以及XTEN连接在B结构域内或 BDD变体的残余B结构域残基之间（且本发明也涵盖以下变化形式：其中XTEN置换连接A2 和A3结构域的B结构域全部（包括所有天然裂解位点），从而产生单链形式的因子VIII)。 这个图也包括其中一个或多个XTEN序列插入在B结构域内且所得融合物在细胞内加工期 间在一个或多个位点处（例如，在R1648位点处）被裂解的所有变化形式。
[0090] 图6是XTEN插入在B结构域内以及连接于C2结构域的C末端的CFXTEN构建体 的图形描绘，其说明XTEN的导致形成可覆盖因子VIII邻近于XTEN的部分的无规卷曲的非 结构化特征。在下图中，图式描绘当XTEN呈无规卷曲时，它可采用产生会阻断因子VIII抑 制剂抗体的结合的空间位阻的构象，所述抗体否则将对邻近于XTEN插入位点的表位具有 亲和力。
[0091] 图7是对FVIII B结构域缺失序列进行的用以鉴定XTEN在FVIII序列内的插 入位点的各种分析的图形描绘。A-H行的各者处于跨越FVIII BDD序列的Y轴值的任 意标度上以使低值表示对XTEN插入物的预测耐受性较高的区域，其中残基编号在X轴 上。A行显示结构域边界；这行中的所有中断都表示可能接受XTEN的边界。B行显示 外显子边界；即所述行中的各阶跃都表示新外显子。C行显示由于在晶体中缺乏次序而 在X射线结构中不可见的区域。标记的D行表示使用相应程序FoldIndex以及RONN计 算的多个次序预测结果，所述FoldIndex见于万维网站点bip. weizmann. ac. il/fldbin/ findex (2011 年2 月 23 日末次访问）上（参见 Jaime Prilusky, Clifford E. Felder, Tzviya Zeev-Ben-Mordehai, Edwin Rydberg, Orna Man, Jacques S. Beckmann, Israel Silman 和 Joel L. Sussman, 2005, Bioinformatics based on the Kyte&Doolitlle algorithm),所 述RONN见于万维网站点strubi. ox. ac. uk/R0NN(2011年2月23日末次访问）上（参见 Yang，Z.R.，Thomson，R.，McMeil，P.和 Esnouf, R.M. (2005)R0NN: the bio-basis function neural network technique applied to the detection of natively disordered regions in proteins Bioinformatics 21:3369-3376)。E 和 F 行是基于可在 GenBank 中 获得的来自11种哺乳动物的FVIII基因的多个序列比对加以计算。E行表示个别残基的 保守性。F行表示FVIII的含3个氨基酸的区段的保守性。G和H行表示在11个哺乳动物 FVIII基因的多个序列比对中观察到的间隙和插入。J行通过氨基酸编号列出基于组合以 上多个测量结果所获得的XTEN插入点。
[0092] 图8描绘使用图8中描绘的信息且如实施例34的测定中所确认，在FVIII B结构 域缺失序列（SEQ ID NO: 1594)中鉴定为XTEN的活性插入点的位点。
[0093] 图9描绘使用图8和或实施例34中描绘的信息外加各插入点周围的被视为适于 插入XTEN的一定跨度的氨基酸，在FVIII B结构域缺失序列（SEQ ID NO: 1595)中被鉴定 用于插入XTEN的位点的范围。
[0094] 图10是通过如对于图7所述鉴定插入点，随后使用分子生物学技术在各个插入点 处插入单一 XTEN(黑色棒条）来产生的CFXTEN文库的装配的示意图。表达并回收构建体， 接着评估FVIII活性和药代动力学性质以鉴定导致性质增强的那些CFXTEN构型。
[0095] 图11是CFXTEN组分文库的装配的示意图，其中单一或连接于各种长度的 XTEN(黑色棒条）的FVIII BDD结构域的区段以组合方式装配成编码CFXTEN的基因的 文库，可接着评估所述文库的FVIII活性和药代动力学性质以鉴定导致性质增强的那些 CFXTEN 构型。
[0096] 图12说明具有XTEN(显示为粗波形线）的CFXTEN构型的若干实例，其中某些XTEN 可通过插入可由促凝血蛋白酶裂解的裂解序列（由黑色三角指示）加以释放。图12A说明 具有两个末端可释放XTEN的scFVIII。图12B说明与图12A相同的构型，但具有连接A3和 Cl结构域的额外非可释放XTEN。图12C说明具有两个末端可释放XTEN的成熟异二聚体 FVIII。图12D说明与IOC相同的构型，但具有连接A3和Cl结构域的额外非可释放XTEN。
[0097] 图13是装配、产生和评估XTEN中的代表性步骤的示意流程图。
[0098] 图14是装配编码融合蛋白的CFXTEN多核苷酸构建体中的代表性步骤的示意流程 图。个别寡核苷酸501退火成序列基序502 (如含12个氨基酸的基序（" 12-mer")），其被 连接于来自文库的其它序列基序以产生涵盖所需长度的XTEN 504的集合，且连接于较小 浓度的含有BbsI和KpnI限制位点的寡聚物503。将连接产物的所得集合进行凝胶纯化且 切割具有所需长度的XTEN的条带，从而产生具有封堵序列（stopper sequence) 505的分离 的XTEN基因。将XTEN基因克隆至填充载体中。在这个情况下，载体编码任选CBD序列506 和GFP基因508。接着用Bbsl/HindllI进行消化以移除507和508且放置终止密码子。接 着将所得产物克隆至Bsal/HindllI消化的含有编码FVIII的基因的载体中，从而产生编码 FVIII-XTEN融合蛋白的基因500。
[0099] 图15是装配编码包含CF和XTEN的融合蛋白的基因、所述基因以融合蛋白形式表 达和回收、以及所述融合蛋白作为候选CFXTEN产物加以评估中的代表性步骤的示意流程 图。
[0100] 图16说明使用供体XTEN序列来产生截短XTEN。图16A提供AG864的序列（SEQ ID NO: 1596)，其中加下划线序列用于产生序列长度576 (SEQ ID NO: 1597)。图16B提供AG864 的序列（SEQ ID NO: 1598)，其中加下划线序列用于产生序列长度288 (SEQ ID NO: 1599)。图 16C提供AG864的序列（SEQ ID N0:1600)，其中加下划线序列用于产生序列长度144(SEQ ID NO: 1601)。图16D提供AE864的序列（SEQ ID NO: 1602)，其中加下划线序列用于产生序 列长度 576(SEQIDN0:1603)。图16E提供AE864 的序列（SEQIDN0:1604)，其中加下划 线序列用于产生序列长度288 (SEQ ID NO: 1605)。图16F提供用于产生四个144长度的序 列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO 1607-1610)的AE864的序列（SEQ ID NO: 1606)(双 下划线指示144序列中的首个氨基酸，其中单下划线表示那个序列的其余部分）。
[0101] 图17是以将XTEN元件引入FVIII编码序列中的不同策略设计因子VIII-XTEN表 达载体的图示。图17A显示编码融合于编码FVIII的序列的3'末端的XTEN的表达载体。 图17B描绘编码插入编码单一 FVIII的编码序列的中部中的XTEN元件的表达载体。图17C 描绘编码两个XTEN元件：一个插入FVIII编码序列的内部，且另一融合于FVIII编码序列 的3'末端的表达载体。
[0102] 图18说明编码XTEN的基因的组合基因装配的过程。在这种情况下，基因自6个 碱基片段装配且各片段可以4种不同密码子形式（A、B、C和D)获得。这允许在装配含12 个氨基酸的基序时实现理论多样性4096。
[0103] 图19显示在皮下或静脉内施用的单剂的连接于不同长度的非结构化多肽的GFP 不同组合物之后，在食蟹猕猴中的药代动力学分布图（血浆浓度），如实施例41中所述。组 合物是 GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576 和 XTEN_AD836-GFP。在注射之后 各种时间分析血液样本且使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和相同多克隆抗体的用 于检测的生物素化制剂，通过ELISA测量血浆中的GFP的浓度。结果呈现为在给药之后相 对于时间（小时）的血浆浓度，且特别显示XTEN_AD836-GFP (即XTEN序列长度最长的组合 物）的半衰期可观增加。序列长度最短的构建体GFP-L288具有最短半衰期。
[0104] 图20显示来自XTEN_AE864融合于GFP的N末端的融合蛋白的稳定性研究的样本 的SDS-PAGE凝胶（参见实施例42)。在37°C下在食蟹猕猴血浆和大鼠肾溶解产物中孵育 GFP-XTEN多达7天。此外，也评估向食蟹猕猴施用的GFP-XTEN。在0、1和7天取样且通过 SDS PAGE分析，然后用针对GFP的抗体使用蛋白质印迹分析进行检测。
[0105] 图21显示对相对于分子量已知的蛋白质标准物测量的胰高血糖素-XTEN构建 体样本的尺寸排阻色谱分析的结果，其中图输出为吸光度对滞留体积，如实施例40中所 述。胰高血糖素-XTEN构建体是1)胰高血糖素-Y288 ;2)胰高血糖素 Y-144 ;3)胰高血糖 素-Y72 ;和4)胰高血糖素-Y36。结果指示表观分子量随XTEN部分的长度增加而增加（对 于数据，参见实施例40)。
[0106] 图22显示由用如所指定的构建体转化的细胞的细胞培养物表达的蛋白质的蛋 白质印迹的结果（实施例25)。泳道1-12中的样本分别是：丽标准物、FVIII (42. 5ng)、 pBCOlOOB、pBC0114A、pBCOlOO、pBC0114、pBC0135、pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0149 和 PBC0146。泳道8、9和12显示与估计MW是95kDa的具有C末端XTEN288的FVIII -致的 条带。泳道7和11显示与估计丽是175kDa的具有C末端XTEN42的FVIII -致的条带。 泳道2-6显示与FVIII和重链一致的条带。泳道10和23显示与重链一致的条带。泳道7 显示与重链和连接的XTEN42 -致的条带。
[0107] 图23显示对自流体动力学注射质粒DNA的FVIII和血管性血友病因子双重敲除 小鼠获得的样本的FVIII测定的结果，如实施例36中所详述。
[0108] 图24是如实施例30中所述向HemA或FVIII/VWF双重敲除小鼠施用的rBDD-FVIII 和纯化CFXTEN融合蛋白pBCO 145和pBCO 146 (具有C末端XTEN)的药代动力学性质的图形 和表格描绘，其显示CFXTEN在两种小鼠品系中的半衰期均增强。
[0109] 图25是使用在HemA小鼠中进行的细胞培养物PK测定，向HemA(图25A)或FVIII/ VWF双重敲除小鼠（图25B)施用的rBDD-FVII I和CFXTEN融合蛋白pSD0050和pSD0062 (具 有内部插入的XTEN)的药代动力学性质的图形和表格描绘。如实施例32中所述，显示剂 量、5分钟回收率和半衰期（T1/2)，从而强调在两种小鼠品系中，相较于阳性对照FVIII， CFXTEN的回收率和半衰期得以增强。
[0110] 图26是使用PBC0114BDD-FVIII和含有三个在残基18、745和2332处的144个氨 基酸的XTEN插入的CFXTEN构建体LSD0049. 002滴定GMA802IFVIII抑制剂的图形描绘。数 据指示相较于FVIII阳性对照，为在50%程度上抑制CFXTEN所需的以μ g/ml计的抗体量 右移约0.7数量级。
[0111] 图27是算法SegScore的逻辑流程图的不意图。在图中，以下图例适用：i，j-用 于穿过整个序列的控制回路中的计数器；HitCount-这个变量是记录子序列在嵌段中遇到 相同子序列多少次的计数器；SubSeqX-这个变量保存被检查冗余度的子序列；SubSeqY-这 个变量保存SubSeqX被检查所针对的子序列；BlockLen-这个变量保存使用者确定的嵌段 长度；SegLen-这个变量保存区段长度。程序被硬编码来产生长度是3, 4, 5, 6, 7, 8, 9和10 的子序列的计分；Block-这个变量保存一串长度BlockLen。所述串主要由来自输入XTEN 序列的字母组成且由i计数器的位置所确定；SubSeqList-这是保存所有产生的子序列计 分的清单。
[0112] 图28描绘对11个氨基酸的假设XTEN(SEQ ID NO: 1591)应用算法SegScore以确 定重复性。由N个氨基酸组成的XTEN序列被分成Ν-S+l个长度是S的子序列（在这个情 况下S = 3)。对所有子序列进行逐对比较且计算相同子序列的平均数目以产生子序列计分 1. 89。
[0113] 图29是在暴露于针对FVIII的GMA8021抗体之后，测定的CFXTEN中的FVIII活 性与PBC114FVIII阳性对照的FVIII活性的个别构建体比率值的图，分组是根据构建融合 蛋白中的XTEN的数目（参见实施例28)。结果显示CFXTEN保留FVIII活性的能力与并入 的XTEN的数目增加基本上成线性关系。
[0114] 图30描绘成熟B结构域缺失的（BDD)人FVIII构建体的一级序列和结构域结构 (实施例46)。显不引入的NheI和ClaI限制位点的位置。应注意氨基酸编号对应于成熟 FVIII的一级序列中的氨基酸位置（图30)。个别结构域是通过灰色线/框加以限定，其中 用灰色文本鉴定结构域。酸性区域（al、a2、a3)用虚线框指示。实心楔/三角指示FVIII 活化成FVIIIa时的凝血酶裂解位点。空心楔/三角指示细胞内蛋白水解加工成双链形式 的FVIII的位点。六角形指示N连接的糖基化的位点。圆圈指示Tyr硫酸化的位点。引入 cDNA中以有助于XTEN插入/重组的独特非天然限制位点（NheI，GCTAG ;ClaI，ATCGAT)用 灰色以双下划线加以突出。
[0115] 图31提供图30中所述的FVIII构建体的图解表示，其指示结构域组构以及天然 和非天然限制位点的位置。
[0116] 图32显示结构数据集2R7E、3⑶Z和PM0076106的图示ASAView输出结果。显 示结构域AU A2、A3、Cl和C2中的氨基酸的可及溶剂面积（ASA)。对存放在由结构生物 信息学研究合作协会（Res earch Collaboratory for Structural Bioinformatics) (RCSB; http://www.rcsb.org/pdb)维护的蛋白质数据库（Protein Data Bank)中的 X 射线结晶坐标 3CDZ (Ngo 等，Structure 16:597-606 (2008))和 2R7E (Shen 等，Blood 111:1240-1247(2008))、以及对存放在由 Consorzio Interuniv ersitario per Ie Applicazioni di Supercalcolo per University e Riserc a(CASPUR)和罗马大学生物 化学科学系（Department of Biochemical Sciences of the University of Rome)维 护的蛋白质模型数据库（Protei n Model Database) (http://mi.caspur.it/PMDB/main. php)中的由分子动力学模拟研究获得的预测细化FVIII结构的原子坐标PM0076106(Ven kateswarlu, BMC Struct. Biol. 10:7(2010))进行分析。
[0117] 图33显示XTEN插入位点的位置的结构示意图。对应于FVIII的晶体结构（PDB : 2R7E)的中心图式由结构域A1、A2、A3、C1和C2的详细视图围绕。β链和α螺旋显示为 条带表示。环显示为α碳管。在XTEN插入位点处的氨基酸显示为CPK球形表示。各图中 的编号指示根据图30中的编号的XTEN插入位点的位置。
[0118] 图34显示图33中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图，其中所得重组 FVIII蛋白显示FVIII活性。
[0119] 图35显示图34中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图，其中所得重组 FVIII蛋白显示FVIII活性。
[0120] 图36显示图35中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图，其中所得重组 FVIII蛋白显示FVIII活性。
[0121] 图37显示FVIII的结构域AU Α2、A3、Cl和C2的ClustalW多个序列比对，其显 示导致重组FVIII蛋白显示FVIII活性（黑色框、白色文本）或不显示FVIII活性（灰色 框、粗体文本）的XTEN插入位置。
[0122] 图38显示对以标识符2R7E存放在蛋白质数据库处的天然活性人FVIII晶体结构 中的两条多肽链的二级结构的DSSP图解表示（参见实施例47)。氨基酸序列编号与图30 中的蛋白质序列相同。β折置区域显不为实心箭头且指定为β?至β66。XTEN容许环的 位置由交叉影线框表示。结构域AlXTEN容许环指定为环Al-I和环Α1-2。结构域Α2ΧΤΕΝ 容许环指定为环Α2-1和环Α2-2。结构域Α3ΧΤΕΝ容许环指定为环Α3-1和环Α3-2。
[0123] 图39显示对以标识符2R7E存放在蛋白质数据库处的天然活性人FVIII晶体结构 中的两条多肽链的二级结构的DSSP图解表示（参见实施例47)。氨基酸序列编号与图30 中的蛋白质序列相同。β折置区域显不为实心箭头且指定为β?至β66。XTEN容许环的 位置由交叉影线框表示。结构域AlXTEN容许环指定为环Al-I和环Α1-2。结构域Α2ΧΤΕΝ 容许环指定为环Α2-1和环Α2-2。结构域Α3ΧΤΕΝ容许环指定为环Α3-1和环Α3-2。
[0124] 图40显示FVIII的结构域AU Α2、A3、Cl和C2的ClustalW多个序列比对，其显 示导致重组FVIII蛋白显示FVIII活性（黑色框、白色文本）或不显示FVIII活性（灰色 框、粗体文本）的XTEN插入位置。XTEN容许环的位置由虚线矩形指示（参见实施例47)。
[0125] 图41.图41A呈现人FVIII(roB:2R7E)的前视结构示意图，其显示结构域A1、A2、 A3、Cl和C2的位置（用虚线加圆圈）和以CPK球形表示加以突出的XTEN容许环A1-1、 A1-2、A2-1、A2-2、A3-1和A3-2的位置。图41B呈现人FVIII(PDB:2R7E)的侧视结构示意 图，其显示结构域AU A2、A3、Cl和C2的位置（用虚线加圆圈）和以CPK球形表示加以突 出的XTEN容许环Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l和A3-2的位置。
[0126] 图42显示分离的人FVIII(roB:2R7E)A结构域的顶视结构示意图，其显示 以CPK球形表示加以突出的XTEN容许环的位置。图42B、42D和42F显示分离的人 FVIII (H)B: 2R7E) A结构域的侧视结构示意图，其显示以CPK球形表示加以突出的XTEN容许 环的位置。
[0127] 图43显示各种因子VIII B结构域缺失和个别突变的序列。4-10行显示各种B结 构域缺失，其中指示的XTEN连接侧接B结构域残余残基或A3结构域残基。R1648A突变由 箭头在5和8行中指示，而Y1680F突变由箭头在8-10行中指示。
[0128] 图44是具有单一 XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT测定活性的条形图 (实施例49)。
[0129] 图45是具有2个XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT测定活性的条形图 (实施例49)。
[0130] 图46是具有3个XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT测定活性的条形图 (实施例49)。
[0131] 图47是相较于BDD-FVIII对照，施用的各种具有单一 XTEN插入物的CFXTEN在 DKO小鼠中的血浆水平的图，其显示通过在各个位置处插入XTEN实现半衰期长10至20倍 (实施例50)。
[0132] 图48是相较于BDD-FVIII对照，施用的各种具有一个、两个和三个XTEN插入物 的CFXTEN在DKO小鼠中的血浆水平的图，其显示相较于单一或两个插入物，通过包括额外 XTEN插入物实现半衰期增加（实施例51)。
[0133] 图49是在毕提斯达测定中用实施例52中所述的三种血友病患者血清（图49A-C) 或绵羊抗FVII (图49D)测定的样本中的剩余因子VIII促凝血活性的绘制抑制曲线的图， 其显示相较于未连接于XTEN的FVIII，两个CFXTEN分子的抑制曲线明显左移。
[0134] 发明详述
[0135] 在描述本发明的实施方案之前，应了解所述实施方案是仅通过举例方式提供，且 本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。众多变化、改变和替代 在不脱离本发明的情况下现将被本领域技术人员所想到。
[0136] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域 的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在实施或测试本发明时可使用与本文所述的 那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述适合的方法和材料。在起冲突的情 况下，以包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅具有说明性而非意图具有 限制性。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的情况下现将被本领域技术人员所想到。
[0137] 定义
[0138] 在本申请的情形下，除非另外指定，否则以下术语具有归于它们的含义：
[0139] 除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求中所用，单数形式"一个" 和"所述"包括复数个提及物。举例来说，术语"一个细胞"包括复数个细胞，包括其混合物。
[0140] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换用于指代任何长度的氨基酸聚合 物。聚合物可为线性或分支的，它可包含修饰的氨基酸，且它可被非氨基酸打断。所述术语 也涵盖已例如通过形成二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作（如与 标记性组分缀合）加以修饰的氨基酸聚合物。
[0141] 如本文所用，术语"氨基酸"是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于D 或L两种光学异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。标准单字母代码或三字母代码用于 指定氨基酸。
[0142] 术语"结构域"在关于因子VIII多肽使用时是指全长结构域或其功能性片段，例 如因子VIII的Al结构域、A2结构域、A3结构域、B结构域、Cl结构域和/或C2结构域的 全长或功能性片段。
[0143] 术语"天然L-氨基酸"是指甘氨酸（G)、脯氨酸（P)、丙氨酸（A)、缬氨酸（V)、亮氨 酸（L)、异亮氨酸（I)、甲硫氨酸（M)、半胱氨酸（C)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)、 组氨酸（H)、赖氨酸（K)、精氨酸（R)、谷氨酰胺（Q)、天冬酰胺（N)、谷氨酸（E)、天冬氨酸 (D)、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)的L光学异构体形式。
[0144] 如应用于序列以及如本文所用的术语"非天然存在"是指不具有哺乳动物中所见 的野生型或天然存在的序列的对应物、不互补于哺乳动物中所见的野生型或天然存在的序 列、或不与哺乳动物中所见的野生型或天然存在的序列具有高度同源性的多肽或多核苷酸 序列。举例来说，当适合地比对时，非天然存在的多肽或片段相较于天然序列可共有至多 99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%或甚至更小氨基酸序列同一性。
[0145] 术语"亲水性"和"疏水性"是指物质与水具有的亲和程度。亲水性物质对 水具有强烈亲和力，倾向于溶解于水中，与水混合，或由水湿润，而疏水性物质大致上 对水缺乏亲和力，倾向于排斥而非吸收水且倾向于不溶解于水中或与水混合或由水湿 润。氨基酸可基于它们的疏水性加以表征。已开发许多尺度。一个实例是由Levitt，M 等，J Mol Biol(1976) 104:59 开发的尺度，其列于 Hopp, TP 等，Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中。"亲水性氨基酸"的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸以及丝氨酸和甘氨酸。"疏 水性氨基酸"的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
[0146] "片段"在应用于蛋白质时是天然生物活性蛋白质的保留至少一部分治疗和/或生 物活性的截短形式。"变体"在应用于蛋白质时是与天然生物活性蛋白质具有序列同源性 的保留生物活性蛋白质的至少一部分治疗和/或生物活性的蛋白质。举例来说，相较于参 照生物活性蛋白质，变体蛋白质可共有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%氨基酸序列同一性。如本文所用，术语"生物活性蛋白质部分"包括如例如通过 定点诱变、合成编码基因、插入而故意地修饰的蛋白质或通过突变而偶然地修饰的蛋白质。
[0147] 术语"序列变体"是指相较于它们的天然或原始序列，已通过插入、缺失或取代一 个或多个氨基酸加以修饰的多肽。插入可位于蛋白质的任一末端或两个末端处，和/或可 位于氨基酸序列的内部区域内。一个非限制性实例是在生物活性有效负载蛋白质的序列内 插入XTEN序列。在缺失变体中，移除如本文所述的多肽中的一个或多个氨基酸残基。因此， 缺失变体包括有效负载多肽序列的全部片段。在取代变体中，移除且用替代残基置换多肽 的一个或多个氨基酸残基。在一方面，取代在性质上是保守性的且这个类型的保守性取代 在本领域中是熟知的。
[0148] 如本文所用，"内部XTEN"是指已插入凝血因子的序列中的XTEN序列。内部XTEN 可通过将XTEN序列插入如FVIII的凝血因子的序列中来构建，所述插入是通过在凝血因子 的结构域内的两个邻近氨基酸之间（"结构域内"）或在两个结构域之间（"结构域间"）插 入来实现或其中XTEN置换凝血因子的部分内部序列。
[0149] 如本文所用，"末端XTEN"是指已融合于凝血因子的N末端或C末端或融合在凝血 因子的N末端或C末端中或融合于凝血因子的N末端或C末端的蛋白水解裂解序列或接头 的XTEN序列。末端XTEN可融合于凝血因子的天然末端。或者，末端XTEN可置换凝血因子 的一部分末端序列。
[0150] 术语"XTEN释放位点"是指CFXTEN融合蛋白中可由哺乳动物蛋白酶识别且裂解， 从而实现XTEN或XTEN的一部分自CFXTEN融合蛋白释放的裂解序列。如本文所用，"哺乳 动物蛋白酶"是指通常存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可被 工程化来由各种哺乳动物蛋白酶（也称为"XTEN释放蛋白酶"）裂解，所述哺乳动物蛋白酶 如FXIa、FXIIa、激肽释放酶、？￥111 &、？￥111&4乂&411&(凝血酶）、弹性蛋白酶-2、丽?-12、 MMP13、MMP-17、MMP-20或在凝结事件期间存在的任何蛋白酶。可利用能够识别确定裂解位 点的其它等效蛋白酶（内源性或外源性）。可针对所用蛋白酶调整和定制裂解位点。
[0151] 当提及第一多肽连接于第二多肽时，术语"在…内"涵盖分别使所述第一或第二多 肽的N末端连接于所述第二或第一多肽的C末端的连接，以及将所述第一多肽插入所述第 二多肽的序列中。举例来说，当XTEN "在因子VIII多肽的结构域内"连接时，所述XTEN可 连接于N末端、C末端，或可插入所述结构域中。
[0152] 如本文所用，术语"位点"在用于指代XTEN插入在如因子VIII的生物多肽内或向 如因子VIII的生物多肽插入的位点时表示连接所述XTEN所处的氨基酸位置。当描述编号 位点，如XTEN插入在因子VIII内或向因子VIII插入的第一、第二、第三、第四、第五或第六 位点时，各位点将理解为表示因子VIII中的不同位点；例如，所述第二位点是与所述第一 位点不同的因子VIII位置，所述第三位点不同于所述第二和所述第一位点等。
[0153] 如应用于本文提供的CFXTEN多肽的一种或多种形式的"活性"或"促凝血活性"是 指无论通过体外、离体或体内测定所测量，都能够结合靶标凝血蛋白底物或辅因子且促进 凝结事件的能力。所述测定包括但不限于单级凝结测定、两级凝结测定、显色测定和ELISA 测定。"生物活性"是指体外或体内生物功能或作用，包括但不限于受体或配体结合、或 FVIII凝血因子对在本领域中通常已知的凝血的作用、或细胞、生理或临床反应,包括遏止 流血事件。
[0154] 如本文所用，术语"ELISA"是指如本文所述或如本领域中另外已知的酶联免疫吸 附测定。
[0155] "宿主细胞"包括可为或已为主题载体的接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细 胞包括单一宿主细胞的子代。由于天然、偶然或故意突变，子代可不必与原始亲本细胞完全 相同（在形态方面或在总DNA互补序列的基因组方面）。宿主细胞包括用本发明的载体体 内转染的细胞。
[0156] "分离的"在用于描述本文公开的各种多肽时是指已被鉴定且与它的天然环境的 组分分离和/或自所述天然环境的组分回收的多肽。它的天然环境的污染物组分是将通常 干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。如为 本领域技术人员显而易知，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要 "分离"以将它与它的天然存在的对应物区分。此外，"浓缩的"、"分离的"或"稀释的"多核 苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与它的天然存在的对应物区分，因为每体积分子的 浓度或数目通常大于它的天然存在的对应物的浓度或数目。一般来说，通过重组手段制备 且在宿主细胞中表达的多肽被视为"分离的"。
[0157] "分离的"多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是被鉴定且与在多肽编 码核酸的天然来源中它通常与之缔合的至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子。分离的 多肽编码核酸分子不同于它在自然界中所见的形式或配置。因此，分离的多肽编码核酸分 子不同于当它存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子。然而，分离的多肽编码核酸 分子包括通常表达多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，在所述细胞中，例如核酸分子 在不同于天然细胞的位置的染色体或染色体外位置中。
[0158] "嵌合"蛋白含有至少一种在序列中不同于在自然界中存在的位置的位置中包含 至少一个区域的融合多肽。所述区域可通常以单独蛋白质形式存在且在融合多肽中集合在 一起；或它们可通常以相同蛋白质形式存在，但以新型排列置放在融合多肽中。可例如通过 化学合成，或通过产生并翻译其中以所需关系编码肽区域的多核苷酸来产生嵌合蛋白。
[0159] "缀合的"、"连接的"、"融合的"和"融合"在本文中可互换使用。这些术语是指通 过无论什么手段（包括化学缀合或重组手段）将两种或更多种化学元素、序列或组分接合 在一起。举例来说，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么使它可操作地连接于编码序 列。通常，"可操作地连接"是指所连接的DNA序列是连续的，且在阅读相中或框内。"框内 融合"是指以维持原始ORF的正确阅读框的方式接合两个或更多个开放阅读框（ORF)以形 成连续较长0RF。因此，所得重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多 肽的区段的单一蛋白质（所述区段在自然界中通常不这样接合）。
[0160] 在多肽的情形下，"线性序列"或"序列"是多肽中呈氨基末端至羧基末端方向的 一定顺序的氨基酸，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。"部分序 列"是多肽的一部分的已知在一个或两个方向上包含其它残基的线性序列。
[0161] "异源"是指源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之比较的实体的其 余部分。举例来说，自它的天然编码序列移除且可操作地连接于除天然序列以外的编码序 列的甘氨酸富集序列是异源甘氨酸富集序列。如应用于多核苷酸、多肽的术语"异源"是指 多核苷酸或多肽源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之比较的实体的其余部 分的基因型。
[0162] 术语"多核苷酸"、"核酸"、"核苷酸"和"寡核苷酸"可互换使用。它们是指任何长度 的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸 可具有任何三维结构，且可执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例： 基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座（loci)(基因座（locus))、 外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支 多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针 和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，那么 可在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可由非核苷酸组分打 断。可在聚合之后，如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。
[0163] 术语"多核苷酸的互补序列"表示相较于参照序列，具有互补碱基序列和逆向定 向，以致它可以完全保真度与参照序列杂交的多核苷酸分子。
[0164] 如应用于多核苷酸的"重组"是指多核苷酸是体外克隆、限制和/或连接步骤、以 及产生可潜在于宿主细胞中表达成重组蛋白的构建体的其它程序的各种组合的产物。
[0165] 术语"基因"和"基因片段"在本文中可互换使用。它们是指含有至少一个能够在 转录和翻译之后，编码特定蛋白质的开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可为基因组 的或cDNA，只要多核苷酸含有至少一个可涵盖整个编码区或其区段的开放阅读框即可。"融 合基因"是由至少两种连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。
[0166] "同源性"或"同源"或"序列同一性"是指两个或更多个多核苷酸序列之间或两 个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用如BestFit的程序来确定两 个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可使用缺省设置，或可选择如 blosum45或blosum80的适当计分矩阵来使一致性、相似性或同源性计分最优化。优选地， 同源的多核苷酸是在如本文定义的严格条件下杂交且相较于那些序列具有至少70%、优选 至少80 %、更优选至少90 %、更优选95 %、更优选97 %、更优选98 %、以及甚至更优选99 % 序列同一性的那些多核苷酸。同源的多肽优选具有至少70%、优选至少80%、甚至更优选 至少90 %、甚至更优选至少95-99 %、以及最优选100 %相同的序列同一性。
[0167] "连接"是指在两个核酸片段或基因之间形成将它们连接在一起的磷酸二酯键的 过程。为将DNA片段或基因连接在一起，DNA的末端必须可彼此相容。在一些情况下，在核 酸内切酶消化之后，末端将直接可相容。然而，可能必要的是首先使通常在核酸内切酶消化 之后产生的交错末端转化成钝末端以使得它们对于连接可相容。
[0168] 术语"严格的条件"或"严格的杂交条件"包括涉及多核苷酸将在比与其它序列更 大的可检测程度上（例如，超过背景至少2倍）与它的靶标序列杂交所处的条件。通常，部 分地关于进行洗涤步骤所处的温度和盐浓度来表述杂交的严格性。通常，严格条件将为以 下条件：其中在pH 7.0至8. 3下，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01至LOM Na离 子浓度（或其它盐）且温度是至少约30°C (对于短多核苷酸（例如10至50个核苷酸）而 言）和至少约60°C (对于长多核苷酸（例如大于50个核苷酸）而言）一举例来说，"严格 条件"可包括在37°C下在50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中杂交，以及在60°C至65°C下在 0· I X SSC/1 % SDS中洗涤3次，各次15分钟。或者，可使用温度约65°C、60°C、55°C或42°C。 SSC浓度可自约0. 1至2X SSC变化，其中SDS是以约0. I %存在。所述洗涤温度通常选择为 低于特定序列在确定离子强度和PH下的热熔点约5°C至20°C。Tm是50%靶标序列杂交于 完全匹配探针所处的温度（在确定离子强度和PH下）。用于计算Tm的等式和用于核酸杂交 的条件是熟知的且可见于 Sambrook, J.等，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual," 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001中。通常，阻断试剂用于阻断非特 异性杂交。所述阻断试剂包括例如约100-200 μ g/ml的剪切和变性的鲑鱼精子DNA。有机 溶剂（如在约35-50% v/v浓度下的甲酰胺）也可在特定情况（如RNA = DNA杂交）下使用。 关于这些洗涤条件的适用变化将易于为本领域普通技术人员显而易知。
[0169] 如应用于多核苷酸序列的术语"同一性百分比"、"序列同一性百分比"和"同一 性％"是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间匹配的残基的百分比。所述 算法可以标准化和可复现方式在所比较的序列中插入间隙以使两个序列之间的比对最优 化，且因此实现两个序列的更有意义比较。同一性百分比可在整个确定多核苷酸序列的长 度上加以测量，或可在较短长度，例如在取自较大确定多核苷酸序列的片段（例如具有至 少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段）的长 度上加以测量。所述长度仅是示例性的，且应了解，由本文在表、图或序列表中所示的序列 支撑的任何片段长度都可用于描述在其上测量同一性百分比的长度。序列同一性百分比是 通过以下方式来计算：在比较窗上比较两个最优对准的序列，确定匹配位置（相同残基存 在于两个多肽序列中所处的位置）的数目，用比较窗中的位置总数（即，窗口大小）除匹配 位置的数目，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。当将比较不同长度的序列时， 最短序列限定比较窗的长度。当计算序列同一性时，不考虑保守性取代。
[0170] 关于本文鉴定的多肽序列的"序列同一性百分比（％)"定义为在比对序列且必 要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的 一部分之后，查询序列中与第二参照多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基 的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的 各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软体，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适于测量比对的参数,包括为在所比较序 列的全长上实现最大对准所需的任何算法。同一性百分比可在整个确定多肽序列的长度上 加以测量，或可在较短长度，例如在取自较大确定多肽序列的片段（例如具有至少15、至少 20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段）的长度上加以测量。 所述长度仅是示例性的，且应了解，由本文在表、图或序列表中所示的序列支撑的任何片段 长度都可用于描述在其上测量同一性百分比的长度。
[0171] 如本文在多肽的情形下所用的术语"非重复性"是指在肽或多肽序列中缺乏内部 同源性程度或内部同源性程度有限。术语"大致上非重复"可指例如存在少许或不存在以 下情况：在序列中四个连续氨基酸是相同氨基酸类型；或指多肽具有10或更小的子序列计 分（下文定义）或指以自N末端至C末端的顺序不存在构成多肽序列的序列基序的样式。 如本文在多肽的情形下所用的术语"重复性"是指在肽或多肽序列中的内部同源性的程度。 相反，"重复"序列可含有短氨基酸序列的多个相同拷贝。举例来说，目标多肽序列可分成 n-mer序列且可对相同序列的数目进行计数。高度重复序列含有大部分相同序列，而非重复 序列含有少许相同序列。在多肽的情形下，序列可含有具有确定或可变长度的较短序列或 基序的多个拷贝，其中所述基序自身具有非重复序列，从而致使全长多肽大致上是非重复 的。测量非重复性所处的多肽的长度可自3个氨基酸至约200个氨基酸、约自6个氨基酸 至约50个氨基酸、或自约9个氨基酸至约14个氨基酸变化。在多核苷酸序列的情形下使 用的"重复性"是指序列中的内部同源性程度，例如像给定长度的相同核苷酸序列的频率。 重复性可例如通过分析相同序列的频率来测量。
[0172] "载体"是将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移插入的 核酸分子的核酸分子，优选在适当宿主中自我复制。所述术语包括主要起将DNA或RNA插入 细胞中的作用的载体、主要起复制DNA或RNA的作用的复制载体、和起转录和/或翻译DNA 或RNA的作用的表达载体。也包括提供一种以上上述功能的载体。"表达载体"是在引入适 当宿主细胞中时可转录且翻译成多肽的多核苷酸。"表达系统"通常暗示包含可起产生所需 表达产物的作用的表达载体的适合宿主细胞。
[0173] 如应用于多肽的"血清降解抗性"是指多肽能够抵抗在血液或其组分中的降解的 能力，所述降解通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。血清降解抗性可通过通常在约37°C下 组合蛋白质与人（或视情况小鼠、大鼠、猴）血清或血浆通常持续一定范围的天数（例如 0.25、0.5、1、2、4、8、16天）来测量。这些时间点的样本可进行蛋白质印迹测定且用抗体检 测蛋白质。抗体可针对蛋白质中的标签。如果蛋白质在蛋白质印迹上显示单一条带（其中 蛋白质的尺寸与注射的蛋白质的尺寸一致），那么未发生降解。在这个示例性方法中，如通 过蛋白质印迹或等效技术判断的50%蛋白质降解所处的时间点是蛋白质的血清降解半衰 期或"血清半衰期"。
[0174] 如本文所用的术语"t1/2 "是指计算为In (2) /Kel的终末半衰期。Kel是通过对数浓度 对时间曲线的终末线性部分的线性回归计算的终末消除速率常数。半衰期通常是指为沉积 在活生物体中的一半数量的施用物质由正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语"t1/2 "、 "终末半衰期"、"消除半衰期"和"循环半衰期"在本文中可互换使用。
[0175] "主动清除"是指蛋白质除通过过滤或凝聚以外自循环移除所凭借的机制，且其包 括由细胞、受体、代谢或降解介导的自循环移除蛋白质。
[0176] "表观分子量因子"和"表观分子量"是关于由特定氨基酸序列展现的表观分子量 相对增加或降低的量度的相关术语。表观分子量是使用尺寸排阻色谱（SEC)或类似方法， 通过与球状蛋白质标准物进行比较来测定，且用"表观kD"单位计量。表观分子量因子是表 观分子量与实际分子量之间的比率；后者是通过基于氨基酸组成添加组成中各类型的氨基 酸的计算分子量或通过根据在SDS电泳凝胶中与分子量标准物的比较进行估计来预测。
[0177] 术语"流体动力学半径"或"斯托克斯半径（Stokes radius) "是溶液中分子的有 效半径（Rh，以nm计），其是通过假定物体穿过溶液且由溶液的粘性所抵抗来测量。在本发 明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量结果与作为一种更直观量度的'表 观分子量因子'相关。蛋白质的"流体动力学半径"影响它在水溶液中的扩散速率以及它在 大分子的凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径是通过它的分子量以及通过它的结 构（包括形状和紧密性）来测定。用于测定流体动力学半径的方法在本领域中是熟知的，如 通过使用如美国专利号6, 406, 632和7, 294, 513中所述的尺寸排阻色谱（SEC)。大多数蛋 白质具有球状结构，此是蛋白质具有最小流体动力学半径所可具有的最紧密三维结构。一 些蛋白质采用随机和开放的非结构化或'线性'构象且因此相较于具有类似分子量的典型 球状蛋白质具有大得多的流体动力学半径。
[0178] "生理条件"是指活宿主中的一组条件以及体外条件，包括模拟活受试者的那些条 件的温度、盐浓度、pH。已建立具有生理相关条件的用于体外测定的宿主。通常，生理缓冲 液含有生理浓度的盐且调整至在约6. 5至约7. 8、且优选约7. 0至约7. 5的范围内的中性 pH。多种生理缓冲液列于Sambrook等（2001)中。生理相关温度在约25°C至约38°C、且优 选约35°C至约37°C的范围内。
[0179] "反应性基团"是可偶联于第二反应性基团的化学结构。反应性基团的实例是氨 基、羧基、硫氢基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应性基团可被活化来促进与第二反应性基团 偶联。活化的非限制性实例是羧基与碳二亚胺反应、羧基转化成活化的酯、或羧基转化成叠 氮化物官能团。
[0180] "控制释放剂"、"缓慢释放剂"、"长效制剂（cbpot formulation) "和"持续释放剂" 可互换用于指代相对于在不存在试剂下施用多肽时的释放持续时间，能够延长本发明多肽 的释放持续时间的试剂。本发明的不同实施方案可具有不同释放速率，从而产生不同治疗 量。
[0181] 术语"抗原"、"靶标抗原"和"免疫原"在本文中可互换用于指代抗体片段或抗体 片段基治疗剂与其结合或针对其具有特异性的结构或结合决定簇。
[0182] 如本文所用的术语"有效负载"是指具有生物或治疗活性的蛋白质或肽序列；SP小 分子的药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于凝血因子、细胞因子、酶、激素、以及 血液和生长因子。
[0183] 如本文所用的术语"拮抗剂"包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多 肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽的拮抗剂的方法可包括使天然多肽与候选拮抗剂 分子接触以及测量一种或多种通常与天然多肽相关的生物活性的可检测变化。在本发明的 情形下，拮抗剂可包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或降低生物活性蛋白质的作用的任 何其它分子。
[0184] 术语"激动剂"是以广义使用且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何 分子。适合激动剂分子明确包括天然多肽、肽、小有机分子等的激动剂抗体或抗体片段、片 段或氨基酸序列变体。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可包括使天然多肽与候选激动剂 分子接触以及测量一种或多种通常与天然多肽相关的生物活性的可检测变化。
[0185] 如本文所用，"治疗"或"缓和"或"改善"可互换使用且是指施用药物或生物制剂 以实现治疗益处，治愈现存病状或减轻现存病状的严重性，或实现防治性益处，预防或降低 病状发作的可能性或病状发生的严重性。就治疗益处而言，其是指根除或改善所治疗的潜 伏病状或与潜伏病状相关的一种或多种生理症状以使在受试者中观察到改善，纵使受试者 可能仍然受潜伏病状折磨。
[0186] 如本文所用的"治疗作用"或"治疗益处"是指由施用本发明的融合蛋白产生的生 理作用，包括但不限于减轻、改善或预防人或其它动物的疾病，或另外增强人或动物的身体 或精神良好状态，而非能够诱导产生针对生物活性蛋白质具有的抗原性表位的抗体。对于 防治性益处，可向处于发展特定疾病、所述疾病的病状或症状（例如，诊断有甲型血友病的 受试者的流血）的风险下的受试者，或向尽管可能尚未对这个疾病作出诊断，但报告疾病 的一种或多种生理症状的受试者施用组合物。
[0187] 如本文所用的术语"治疗有效量"和"治疗有效剂量"是指当以一次或重复剂量向 受试者施用时，单独或作为融合蛋白组合物的一部分的药物或生物活性蛋白质能够对疾病 病况或病状的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测有益作用的量。所述作用无 需是绝对有益的。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其鉴于本文提 供的详细公开内容。
[0188] 如本文所用的术语"治疗有效剂量方案"是指用于单独或作为融合蛋白组合物的 一部分连续施用多次剂量（即，至少两次或两次以上）的生物活性蛋白质的时程，其中所述 剂量是以治疗有效量给予以对疾病病况或病状的任何症状、方面、测量参数或特征产生持 续有益作用。
[0189] I). -般技术
[0190] 除非另外指示，否则本发明的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微 生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，所述技术属于本领域的技能。参 见 Sambrook, J.等，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,，'第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 "'Current protocols in molecular biology，'，F. M. Ausubel 等编，1987;丛书"Methods in Enzymology，，'Academic Press，San Diego，CA.; "PCR 2: a practical approach，'，M. J. MacPherson，B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编，Oxford University Press, 1995 "'Antibodies, a laboratory manual，'Harlow, E.和 Lane, D. 编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ;''Goodman&Gilman, s The Pharmacological Basis of Therapeutics, " 第 11 版，McGraw-Hill, 2005 ;以及 Freshney, R. I. , "Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique," 第 4 版,John Wiley&Sons, Somerset, NJ, 2000,其内容以引用的方式整体并入本文。
[0191] II).凝血因子 VIII
[0192] 本发明部分地涉及包含连接于一个或多个延伸重组蛋白（XTEN)的因子VIII凝 血因子（CF)的组合物，从而产生CFXTEN融合蛋白组合物。如本文所用，"CF"是指因子 Vin(FVIII)或FVIII的模拟物、序列变体和截短形式，如下所述。
[0193] "因子VIII"或"FVIII"或"FVIII蛋白"是指凝血因子蛋白质及其物种（包括人、 猪、犬、大鼠或鼠类FVIII蛋白）和序列变体，包括但不限于含有2351个氨基酸的单链前体 蛋白质（具有19个氨基酸的疏水性信号肽）；约270-330kDa的含有2332个氨基酸的成熟 因子VIII辅因子蛋白质，其具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2 ;以及FVIII的非酶"活性" 或辅因子形式（FVIIIa)，其为具有由于在R1648之后进行蛋白水解裂解而形成的两条链 的循环异二聚体，其具有含有氨基酸1-1648(相对于成熟FVIII形式加以编号）的主要由 A1-A2-B组成的重链形式（在90-220kD的范围内）和含有氨基酸1649-2232的80kDa轻链 A3-C1-C2,所述各形式示意性描绘于图1中。此外且如本文所用，AU A2和A3结构域各自 涵盖酸性间隔子区域；分别为al、a2和a3酸性区域。因此，应了解，描述为具有A1、A2、A3、 B、Cl和C2结构域的CFXTEN构建体包括al、a2和a3酸性区域。如本文所用，"因子VIII" 或"FVIII"或"FVIII多肽"也包括变体形式，包括具有取代、添加和/或缺失的蛋白质，只 要变体保留如促凝血活性的所需生物活性即可。数万种功能性FVIII变体已被构建且可用 作如本文所述的重组FVIII蛋白。参见PCT公布号WO 2011/069164A2、W0 2012/006623A2、 TO 2012/006635A2或WO 2012/006633A2,其全部以引用的方式整体并入本文。已知许多功 能性FVIII变体。此外，已在血友病患者中鉴定FVIII中之数百种非功能性突变。参见例 如Cutler等，Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)，其以引用的方式整体并入本文。此外，来自人的 FVIII与来自其它物种的FVIII之间的比较已鉴定可能为功能所需的保守残基。参见例如 Cameron 等，Thromb. Haemost. 79:317-22(1998)和 US 6, 251，632,其以引用的方式整体并 入本文。
[0194] 在一个实施方案中，人因子VIII结构域是由以下氨基酸残基所界定：A1， 残基 Alal-Arg372 ;A2，残基 Ser373-Arg740 ;B，残基 Ser741-Argl648 ;A3，残基 Serl649-Asn2019 ;C1，残基 Lys2020-Asn2172 ;C2,残基 Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2 序列 包括残基Serl649-Tyr2332。在另一实施方案中，残基Arg336-Arg372通常称为al区域，且 Arg372由凝血酶所裂解。在某些实施方案中，a2区域是Al结构域的一部分。在另一实施方 案中，残基Glul649-Argl689称为a3酸性区域。在某些实施方案中，a3酸性区域是A3结构 域的一部分。在另一实施方案中，天然FVIII蛋白具有下式：Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2， 其中Al、A2和A3是结构相关的"A结构域"，B是"B结构域"，Cl和C2是结构相关的"C结构 域"，且al、a2和a3是酸性间隔子区域。在前式中且参照图30中的一级氨基酸序列位置，人 FVIII的Al结构域自Alal延伸至约Arg336，al间隔子区域自约Met337延伸至约Arg372， A2结构域自约Ser373延伸至约Tyr719，a2间隔子区域自约Glu720延伸至约Arg740，B结 构域自约Ser741延伸至约Argl648, a3间隔子区域自约Glul649延伸至约Argl689, A3结 构域自约Serl690延伸至约Asn2019, Cl结构域自约Lys2020延伸至约Asn2172,且C2结构 域自约 Ser2173 延伸至 Tyr2332 (Saenko 等，2005, J Thromb Hemostasis, 1，922-930)。除 特定蛋白水解裂解位点以外，对FVIII的结构域和区域之间的边界的位置的指定在不同参 考文献中可有所不同。因此，本文中指示的边界是通过使用术语"约"来指定为大致边界。
[0195] 所述因子VIII包括截短序列，如其中一部分或大部分B结构域序列缺失的B结 构域缺失的"BDD"序列（如美国专利号6, 818, 439和7, 632, 921中公开或引用的BDD序 列）。BDD FVIII 的一实例是 REFACTO? 或 ΧΥΝΤΗΑΦ>(重组 BDD FVIII)，其包含对 应于图30的氨基酸1至743的第一多肽，融合于对应于图30的氨基酸1638至2332的第 二多肽。可用于产生本发明的重组蛋白的示例性BDD FVIII构建体包括但不限于缺失对 应于成熟人FVIII的氨基酸747-1638 (图30)的氨基酸的FVIII (Hoeben R. C.等丄81〇1· Chem. 265 (13) : 7318-7323 (1990)，其以引用的方式整体并入本文）、以及缺失对应于成熟人 FVIII的氨基酸771 - 1666或氨基酸868-1562(图30)的氨基酸的FVIII (Meulien Ρ.等 Protein Eng. 2 (4) : 301-6 (1988)，其以引用的方式整体并入本文）。
[0196] 此外，涵盖包括异源氨基酸插入或取代（如天冬氨酸取代位置75处的缬氨酸）的 序列、或重链和轻链是由接头共价连接的单链FVIII (scFVIII)。如本文所用，"FVIII"将为 因子VIII分子的具有凝血因子VIII的典型特征的任何功能性形式，所述形式在向例如患 有甲型血友病的受试者的所述受试者施用时能够纠正人因子VIII缺乏。如美国专利或申 请号 4, 757, 006 ;4, 965, 199 ;5, 004, 804 ;5, 198, 349, 5, 250, 421 ;5, 919, 766 ;6, 228, 620 ; 6, 818, 439 ;7, 138, 505 ;7, 632, 921 ;和 20100081615 中所述，已分离、表征和克隆 FVIII 或 序列变体。
[0197] 人因子VIII由存在于X染色体的长臂尖端（q28)的单拷贝基因编码。它包含 接近 186, 000 个碱基对（bp)且占 X 染色体的约 0· 1 % (White, G. C.和511〇611^1^1'，(：· B.，Blood (1989) 73:1-12)。人FVIII氨基酸序列自如美国专利号4, 965, 199中所示的 cDNA加以推断，所述专利以引用的方式整体并入本文。由cDNA序列获得的天然成熟人 FVIII (即，无分泌信号肽但在其它翻译后加工之前）呈现为图3。
[0198] 编码成熟因子VIII mRNA的DNA见于26个大小在69至3, 106bp的范围内的单 独外显子中。分隔外显子的25个插入内含子区域大小在207至32, 400bp的范围内。完 整基因由约9kb外显子和177kb内含子组成。三个重复A结构域具有约30%序列同源性。 B结构域含有约25个预测糖基化位点中的19个，且A3结构域据信含有对血管性血友病因 子的结合位点。串联C结构域在A3结构域之后且彼此具有约37%同源性（White，G.C.和 Shoemaker, C. B.，Blood(1989)73:1-12)。
[0199] 在新合成的前体单链分子中，B结构域分隔天然因子FVIII的A2结构域和 A3结构域。B结构域的准确边界已以不同方式报道为自前体序列的氨基酸712延伸至 1648 (Wood 等，Nature(1984)312:330-337)或报道为氨基酸 741 - 1648 (Pipe, SW, Haemop hilia(2009) 15:1187 - 1196 以及美国专利号 7, 560, 107)或氨基酸 740-1689(1'〇〇16，11· Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5939-5942)。如本文所用，"B 结构域"是指成熟因子 VIII的氨基酸741-1648。如本文所用，"FVIII B结构域缺失"或"FVIII BDD"是指氨基酸 741至1648中的任何氨基酸、片段或全部缺失的FVIII序列。在一个实施方案中，FVIII BDD 变体保留来自N末端（如本文所用的"B1"）和C末端（如本文所用的"B2"）的B结构域 的剩余氨基酸。在一种FVIII BDD变体中，B结构域剩余氨基酸是SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID N0:1614)。在一种 FVIII BDD 变体中，BI 剩余物是 SFS 且B2 剩余物是 QNPPVLKRHQR(SEQ ID N0:1615)。在另一 FVIII BDD变体中，BI剩余物是SFSQN(SEQ ID N0:1616)且B2剩余物是 PPVLKRHQR(SEQ ID N0:1617)。"B 结构域缺失的因子 VIir'、"FVIII BDD" 或 "BDD FVIII" 可具有美国专利号 6, 316, 226、6, 346, 513、7, 041，635、5, 789, 203、6, 060, 447、5, 595, 886、 6, 228, 620、5, 972, 885、6, 048, 720、5, 543, 502、5, 610, 278、5, 171，844、5, 112, 950、 4, 868, 112和6, 458, 563中公开的完全或部分缺失，所述专利各自以引用的方式整体并 入本文。在一些实施方案中，本发明的B结构域缺失的因子VIII序列包含在美国专利号 6, 316, 226 (也在US6, 346, 513中）的第4栏第4行至第5栏第28行以及实施例1-5处公 开的任一缺失。在另一实施方案中，B结构域缺失的因子VIII是S743/Q1638 B结构域缺失 的因子VIII (SQ形式因子VIII)(例如，氨基酸744至氨基酸1637缺失的因子VIII，例如， 具有全长因子VIII的氨基酸1-743和氨基酸1638-2332的因子VIII)。在一些实施方案 中，本发明的B结构域缺失的因子VIII具有在美国专利号5, 789, 203 (以及US 6, 060, 447、 US 5, 595, 886和US 6, 228, 620)的第2栏第26-51行以及实施例5-8处公开的缺失。在一 些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII具有以下中所述的缺失：美国专利号5, 972, 885 的第1栏第25行至第2栏第40行；美国专利号6, 048, 720的第6栏第1-22行以及实施 例1 ;美国专利号5, 543, 502的第2栏第17-46行；美国专利号5, 171，844的第4栏第22 行至第5栏第36行；美国专利号5, 112, 950的第2栏第55-68行，图2以及实施例1 ;美 国专利号4, 868, 112的第2栏第2行至第19栏第21行以及表2 ;美国专利号7, 041，635 的第2栏第1行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7栏第43行至第 8栏第26行、以及第11栏第5行至第13栏第39行；或美国专利号6, 458, 563的第4栏 第25-53行。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII缺失大部分B结构域，但仍然 含有B结构域的为在体内将初级翻译产物蛋白水解加工成两条多肽链所必需的氨基末端 序列，如WO 91/09122中所公开，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案 中，构建缺失氨基酸747-1638,即实际上完全缺失B结构域的B结构域缺失的因子VIII。 Hoeben R. C.等 J. Biol. Chem. 265 (13) : 7318-7323 (1990)，其以引用的方式整体并入本文。 B结构域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的氨基酸771 - 1666或氨基酸868-1562的缺 失。Meulien P.等Protein Eng. 2⑷：301-6 (1988)，其以引用的方式整体并入本文。作为 本发明的一部分的其它B结构域缺失包括：缺失氨基酸982至1562或760至1639 (Toole 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (1986) 83, 5939-5942) )、797 至 1562 (Eaton 等 Bioche mistry (1986) 25:8343-8347) )、741 至 1646 (Kaufman (PCT 公布申请号 TO 87/04187))、 747-1560 (Sarver 等，DNA (1987) 6:553-564)、741 至 1648 (Pasek (PCT 申请号 88/00831))、 或 816 至 1598 或 741 至 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988)第 82 期：16-25 ;EP 295597))，所述文献和专利各自以引用的方式整体并入本文。可在本发明的实施方案中利 用的任何因子VIII序列中进行各前述缺失。
[0200] 凝结中涉及的蛋白质包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因 子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、蛋白质C和组织因子（共 同或个别"凝结蛋白"）。内源性和外源性凝结路径中的主要凝结蛋白的相互作用显示于 图2中。大多数凝结蛋白以酶原形式存在，但当活化时展现促凝血蛋白酶活性，其中它们 活化另一凝结蛋白，从而有助于内源性或外源性凝血路径和凝块形成。在内源性凝血级联 路径中，FVIII与活化的因子IX、因子X、钙和磷脂的复合物缔合。因子VIII异二聚体不具 有酶活性，但在由凝血酶或因子Xa蛋白水解活化之后，异二聚体变得具有作为酶因子IXa 的辅因子的活性，其中因子VIIIa的活性的特征在于它能够形成因子IXa和X的呈适于由 因子IXa活化因子X的构象的膜结合位点。在由凝血酶裂解后，活化的FVIII (FVIIIa)自 血管性血友病因子解离且结合带负电荷的磷脂PL，且所得复合物作为因子IXa的辅因子参 与在因子X活化（因子X酶（tenase))复合物中。在C2结构域以及A3结构域中的氨基 酸残基1649至1689内是血管性血友病因子（vWF)结合位点，其用于与血管性血友病因子 复合，所得循环复合物保护FVIII免遭在血液中快速降解（Weiss HJ等Stabilization of factor VIII in plasma by the von Willebrand factor. Studies on posttransfusion and dissociated factor VIII and in patients with von Willebrandi s disease. J Clin Invest (1977)60:390)〇
[0201] 活化的因子VIII是包含Al结构域和A2结构域以及包括结构域A3-C1-C2的轻 链的异三聚体。因子IX的活化是通过自分子两步移除活化肽（Ala 146-Arg 180)来实现 (Bajaj 等，Human factor IX and factor IXa, METHODS IN ENZYM0L0GY· 1993)。第一裂解 是由因子XIa或因子Vila/组织因子在Arg 145-Ala 146位点处进行。第二且限速裂解是 在Arg 180-Val 181处进行。活化移除35个残基。活化的人因子IX以通过一个使酶连接 于Gla结构域的二硫桥固持在一起的C末端重链（28kDa)和N末端轻链（18kDa)的异二聚 体形式存在。因子IXa又与活化的因子VIII协力活化因子X。或者，因子IX和X可均由通 过外源性路径产生的与脂质化组织因子复合的因子Vila活化。因子Xa接着参与凝血酶原 转化成凝血酶所凭借的最终共同路径，且凝血酶又使纤维蛋白原转化成血纤维蛋白以形成 减块。
[0202] 凝血过程中的缺陷可导致凝块形成所花费的时间延长的流血病症（凝血病变）。 所述缺陷可为先天性的或获得性的。举例来说，甲型血友病和乙型血友病是特征在于分别 缺乏FVIII和FIX的遗传性疾病。换句话说，生物活性因子VIII纠正源于受甲型血友病折 磨的个体的血浆中的凝血缺陷。重组FVIII已显示是有效的且已被核准用于治疗成年患者 和儿科患者的甲型血友病，且也用于阻止流血事件或预防与创伤和/或手术相关的流血。 因子VIII的当前治疗用途在治疗展现因子VIII缺乏的个体以及患有血管性血友病（Von Willebrand's disease)的那些个体方面可存在问题。此外，以补充疗法接受因子VIII的 个体常产生针对这些蛋白质的常降低或消除所结合的FVIII的促凝血活性的抗体。由于降 低或打消治疗功效的这些抗体的存在，连续治疗是极度困难的。
[0203] 在一方面，本发明涵盖在CFXTEN融合蛋白组合物中包括与人FVIII -致的FVIII 序列、与FVIII序列具有同源性的序列、天然序列（如来自人、非人灵长类动物、哺乳动物 (包括家养动物））、或截短形式的FVIII ;其全部保留天然FVIII的至少一部分促凝血活性 且适用于预防、治疗、介导或改善甲型血友病或与创伤、手术或缺乏凝血因子VIII相关的 流血事件。可通过标准同源性搜索技术（如NCBI BLAST)或在公开数据库中得到与FVIII 具有同源性的序列，所述数据库如化学文摘服务数据库（Chemical Abstracts Services Database)(例如 CAS 登记）、GenBank、全球蛋白质资源（Universal Protein Resource) (UniProt)和订阅提供的数据库，如GenSeq(例如Derwent)。
[0204] 在一个实施方案中，并入主题CFXTEN组合物中的FVIII是序列对应于自然界中所 见的FVIII蛋白的重组多肽。在另一实施方案中，FVIII是天然序列的保留相应天然FVIII 的至少一部分促凝血活性的非天然FVIII序列变体、片段、同源物或模拟物。在另一实施方 案中，FVIII是全部或一部分B结构域缺失的截短变体（"FVIII BDD")，其可呈异二聚形式 或可保持为单链（"scFVIII")，后者描述于Meulien等，ProteinEng.(1988)2(4):301-306 中。FVIII BDD的非限制性实例是在以下处缺失氨基酸的因子VIII序列：在残基编号741 与残基编号1640之间（相对于天然成熟FVIII加以编号）、或在残基编号745与残基编号 1640之间、或在残基编号745与残基编号1640之间、或在残基编号741与残基编号1690之 间、或在残基编号745与残基编号1667之间、或在残基编号745与残基编号1657之间、或 在残基编号747与残基编号1642之间、或在残基编号751与残基编号1667之间。
[0205] 在另一实施方案中，将异源序列并入FVIII中，所述异源序列可包括如以下更充 分描述的XTEN。表1提供由本发明的CFXTEN融合蛋白涵盖的FVIII的氨基酸序列的非限制 性清单。在一些实施方案中，并入CFXTEN融合蛋白中的FVIII包括相较于选自表1的具有 类似长度的氨基酸序列，具有至少约70%序列同一性、或者 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列一性的蛋白质。
[0206] 表I :FVIII氨某酸序列
[0207]
【权利要求】
1. 一种包含因子VIII多肽和至少第一延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋 白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子 区域的A2结构域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、C2结构域和任选B结 构域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各处连接于所述因子VIII多肽：（i)所 述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B结构域的全部或一部分，那么在所述因子 VIII多肽的所述B结构域内；（iii)在所述因子VIII多肽的所述A1结构域内；（iv)在所述 因子VIII多肽的所述A2结构域内；(v)在所述因子VIII多肽的所述A3结构域内；(vi)在 所述因子VIII多肽的所述C1结构域内；(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2结构域内； (viii)在所述因子VIII多肽的N末端处，（ix)在所述因子VIII多肽的两个结构域之间； 且其中当相较于未连接于XTEN的相应因子VIII蛋白时，所述融合蛋白（a)在体外凝血测 定中保留至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、 400 %或500 %的促凝血活性，或（b)在体外结合测定中展现与抗因子VIII抗体的结合降 低。
2. 如权利要求1所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含因子VIII多肽和至少第一延 伸重组多肽（XTEN)，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性间隔子区域的A1结构域、含 有a2酸性间隔子区域的A2结构域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、C2 结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各处连接于所述因子 VIII多肽：（i)所述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B结构域的全部或一部分， 那么在所述因子VIII多肽的所述B结构域内；（iii)在所述因子VIII多肽的所述A1结构 域内；（iv)在所述因子VIII多肽的所述A2结构域内；(v)在所述因子VIII多肽的所述A3 结构域内；(vi)在所述因子VIII多肽的所述C1结构域内；(vii)在所述因子VIII多肽的 所述C2结构域内；或（viii)在所述因子VIII多肽的两个结构域之间；且当相较于未连接 于XTEN的相应因子VIII蛋白时，所述融合蛋白（a)在体外凝血测定中保留至少约10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%或 500%的促凝 血活性，以及（b)在体外结合测定中展现与抗因子VIII抗体的结合降低。
3. 如权利要求1或2所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN在选自表5、 表6、表7、表8或表9的插入位点处连接于所述因子VIII多肽。
4. 一种包含因子VIII多肽和至少第一延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋 白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子 区域的A2结构域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、C2结构域和任选B结 构域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在选自表6和表7的插入位点处连接于所述因 子VIII多肽且其中相较于未连接于XTEN的相应因子VIII蛋白，当通过体外凝血测定进 行测量时，所述融合蛋白保留至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100 %、200 %、300 %、400 % 或 500 % 的促凝血活性。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当最优比对时，所 述因子VIII多肽与选自由表1中的序列、图3中描绘的序列和图4中描绘的序列组成的 组的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、 或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约 99 %、或约100 %序列同一性。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含在所述因子VIII 多肽的C末端处或在所述因子VIII多肽的所述B结构域内连接于所述因子VIII多肽或任 选置换所述因子VIII多肽的所述B结构域的至少第二XTEN。
7. 如权利要求1至5中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含在所述因子VIII 多肽的所述B结构域内连接于所述因子VIII多肽或任选置换所述因子VIII多肽的所述B 结构域的至少第二XTEN。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多 肽包含人因子VIII的B结构域缺失的变体，其中关于如图3中阐述的全长人因子VIII序 列，所述B结构域缺失自在约氨基酸残基编号741至约750处的第一位置开始且在于约氨 基酸残基编号1635至约1648处的第二位置处结束。
9. 如权利要求6至8中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN序 列在所述因子VIII多肽的C末端处连接于所述因子VIII多肽，且所述第二XTEN在所述因 子VIII多肽的所述B结构域内连接于所述因子VIII多肽，其中关于如图3中阐述的全长 人因子VIII序列，所述第二XTEN连接于约氨基酸残基编号741至约750的C末端和氨基 酸残基编号1635至约1648的N末端，其中所有XTEN的累积长度是至少约84个氨基酸残 基。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当最优比对时，相 较于选自由表21的序列组成的组的具有类似长度的序列，所述融合蛋白具有至少约80%、 或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约 95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%、或至少约100%序列同 一性。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含至少第二 XTEN、任选第三XTEN、任选第四XTEN、任选第五XTEN和任选第六XTEN，其中所述第二、第三、 第四、第五或第六XTEN各自在选自由以下组成的组的第二、第三、第四、第五或第六位点处 连接于所述因子VIII多肽： (a) 来自表5、表6、表7、表8或表9的插入位点； (b) 关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，在氨基酸残基编号32、220、224、336、 339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 或 1910 的 6 个氨基酸内的插入位点； (c) 在所述因子VIII多肽的任何两个邻近结构域之间的插入位点，其中所述两个邻近 结构域选自由A1和A2结构域、A2和B结构域、B和A3结构域、A3和C1结构域、以及C1和 C2结构域组成的组； (d) 在所述因子VIII多肽的所述B结构域内，其中关于如图3中阐述的全长人因子 VIII序列，所述第二XTEN连接于约氨基酸残基编号741至约750的C末端和氨基酸残基编 号1635至约1648的N末端； (e) 所述因子VIII多肽的C末端；以及 (f) 所述因子VIII多肽的N末端。
12. 如权利要求11所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN与所述第二 XTEN相隔至少10个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少200个氨基酸、至少 300个氨基酸或至少400个氨基酸。
13. 如权利要求1至12中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当向受试者施用 时，所述融合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或至少约4小时、或至少约6小时、或至少 约12小时、或至少约13小时、或至少约14小时、或至少约16小时、或至少约24小时、或至 少约48小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或至少约144小时、 或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天，其中所述受试者选自人和因子VIII/血管 性血友病因子双重敲除小鼠。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当最优比对时， 相较于选自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列组成的组的具有类似长度的 XTEN，各XTEN具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约 93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少 约99%、或约100%序列同一性。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于未连接于 XTEN的相应因子VIII多肽，所述融合蛋白展现所述融合蛋白与抗因子VIII抗体的结合降 低和更大促凝血活性。
16. 如权利要求15所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当促凝血活性是通过体外凝 血测定加以测定时，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII多肽，在所述抗FVIII抗体存在 下，所述融合蛋白的促凝血活性大至少30 %、40 %、50 %、80 %、100 %、200 %、300 %、400 % 或 500%。
17. 如权利要求15所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于未连接于XTEN的相应 因子VIII多肽，所述融合蛋白与所述抗因子VIII抗体的结合降低是利用选自由表10中的 抗体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者的多克隆抗体组成的组的抗因子VIII 抗体，使用毕提斯达测定加以确定。
18. 如权利要求17所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白与抗因子VIII 抗体的结合降低和促凝血活性保留是由相较于未连接于XTEN的所述因子VIII多肽的毕提 斯达效价，所述融合蛋白的毕提斯达效价降低至少约2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、 70、80、100或200个毕提斯达单位所证明。
19. 一种包含至少一个延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，所述融合蛋白 具有式IX的结构： (A1N) - (S) a- (XTEN) t-⑶ b- (Alc) - (A2N) - (S) c- (XTEN) u-⑶ d- (A2C) - (BN) - (S) e- (XTEN)v-⑶ f- (Bc) - (A3N) - (S) g- (XTEN) w-⑶ h- (A3C) - (C1N) - (S)厂（XTEN) x-⑶厂（Clc) - (C2N) - (S)k- (XTEN) y-⑶ f (C2c)-⑶ m- (XTEN) z IX,其中就各次出现独立而言， a) AlN是因子VIII的所述A1结构域的片段，其具有关于如图3中阐述的全长人因子 VIII序列，在至少氨基酸残基编号1至至多氨基酸残基编号371的范围内的序列； b) Al。是因子VIII的所述A1结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号2至至多氨 基酸残基编号372的范围内的序列，前提是所述A1N片段的序列在所述A1。片段中不重复； c) A2N是因子VIII的所述A2结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号373至至多 氣基酸残基编号739的范围内的序列； d) A2。是因子VIII的所述A2结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号374至至多 氨基酸残基编号740的范围内的序列，前提是所述A2N片段的序列在所述A2。片段中不重 复； e) BN是因子VIII的所述B结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号741至至多氨 基酸残基编号1647的范围内的序列； f) B。是因子VIII的所述B结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号742至至多氨 基酸残基编号1648的范围内的序列，前提是所述BN片段的序列在所述B。片段中不重复； g) A3N是因子VIII的所述A3结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号1649至至 多氣基酸残基编号2018的范围内的序列； h) A3。是因子VIII的所述A3结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号1650至至 多氨基酸残基编号2019的范围内的序列，前提是所述A3N片段的序列在所述A3。片段中不 重复； i) ClN是因子VIII的所述C1结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号2020至至 多氨基酸残基编号2171的范围内的序列； j) Cl。是因子VIII的所述C1结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号2021至至 多氨基酸残基编号2172的范围内的序列，前提是所述C1N片段的序列在所述C1。片段中不 重复； k) C2N是因子VIII的所述C2结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号2173至至 多氨基酸残基编号2331的范围内的序列； l) C2。是因子VIII的所述C2结构域的片段，其具有在至少氨基酸残基编号2174至至 多氨基酸残基编号2332的范围内的序列，前提是所述C2N片段的序列在所述C2。片段中不 重复； m) S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序 列或氨基酸的间隔子序列； n) a是0或1 ; 〇)b是0或1 ; p) c是0或1 ; q) d是0或1 ; r) e是0或1 ; s) f是0或1 ; t) g是0或1 ; u) h是0或1 ; v) i是0或1 ; w) j是0或1 ; x) k是0或1 ; y) 1是〇或1 ; z) m是0或1 ; aa) t 是 0 或 1 ; bb)u 是 0 或 1 ; cc) v 是 0 或 1 ; dd) w 是 0 或 1 ; ee) x 是 0 或 1 ; ff)y 是 〇 或 1 ; gg) z 是 0 或 1,前提是 t+u+v+w+x+y+z 彡 1 ; hh)各XTEN独立地是延伸重组蛋白； 且其中所述融合蛋白具有至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%的未连接于XTEN的相应因子VIII多肽的促凝血活性，或其中当通过是ELISA或毕 提斯达测定的体外测定进行测量时，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，所述融合蛋白 展现与抗因子VIII抗体的结合降低。
20. 如权利要求19所述的重组因子VIII融合蛋白，其中z是1。
21. 如权利要求19所述的重组因子VIII融合蛋白，其中v是1且其中关于如图3中阐 述的全长人因子VIII序列，（XTEN)v连接于约氨基酸残基编号741至约750的C末端和氨 基酸残基编号1635至约1648的N末端。
22. 如权利要求19所述的重组因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的总和等 于 2、3、4、5 或 6。
23. 如权利要求22所述的重组因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的总和等 于2,且v是1且z是1。
24. 如权利要求22所述的重组因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的总和等 于3, v和z各自等于1，且t、u、w、x或y的一者是1。
25. 如权利要求22所述的重组因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的总和等 于4, v和w和z各自等于1，且t、u、x或y的一者是1。
26. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所有XTEN的累积长 度在约84至约3000、或在约144至约2000、或约288至约1000个氨基酸残基之间。
27. 如权利要求19至26中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当最优比对时， 相较于选自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列组成的组的具有类似长度的 XTEN，各XTEN具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约 93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少 约99%、或约100%序列同一性。
28. 如权利要求19至27中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中各XTEN独立地 在选自表5、表6、表7、表8和表9的插入位点处连接于所述融合蛋白。
29. 如权利要求19至28中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中XTEN是紧靠对 应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸 残基编号 32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和 1910。
30. -种重组因子VIII融合蛋白，其包含：包含式X :(A1) -al - (A2) -a2 - [B]的第 一多肽；和包含式XI :a3 - (A3) - (Cl)_ (C2)的第二多肽； 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在； 其中，a)Al是因子VIII的A1结构域；b)A2是因子VIII的A2结构域；c) [B]是因子 VIII的B结构域、其片段或被缺失；d) A3是因子VIII的A3结构域；e)Cl是因子VIII的C1 结构域；f)C2是因子VIII的C2结构域；g)al、a2和a3是酸性间隔子区域； 其中所述A1结构域包含XTEN容许环-1 (A1-1)区域和XTEN容许环-2 (A1-2)区域； 其中所述A2结构域包含XTEN容许环-1 (A2-1)区域和XTEN容许环-2 (A2-2)区域； 其中所述A3结构域包含XTEN容许环-1 (A3-1)区域和XTEN容许环-2 (A3-2)区域； 其中XTEN序列插入所述区域Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l或A3-2的至少一者中；且 其中所述重组因子VIII蛋白展现促凝血活性。
31. -种重组因子VIII融合蛋白，其包含：包含式X:(A1) -al - (A2) -a2- [B]的第 一多肽；和包含式XI :a3 - (A3) - (Cl)_ (C2)的第二多肽； 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在； 其中，a)Al是因子VIII的A1结构域；b)A2是因子VIII的A2结构域；c) [B]是因子 VIII的B结构域、其片段或被缺失或任选不存在；d) A3是因子VIII的A3结构域；e) C1是因 子VIII的C1结构域；f)C2是因子VIII的C2结构域；g)al、a2和a3是酸性间隔子区域； 其中XTEN插入a3中；且 其中所述融合蛋白展现促凝血活性。
32. 如权利要求30或权利要求31所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述第一多肽 和所述第二多肽形成包含式（Al) -al- (A2) -a2- [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的单一多肽链。
33. 如权利要求30所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述XTEN容许环包含在表面 暴露的可挠性环结构内，且其中根据以DSSP数据库的登录号2R7E储存的成熟因子VIII的 二级结构，A1-1位于0链1与0链2之间，A1-2位于0链11与0链12之间，A2-1位 于3链22与@链23之间，A2-2位于@链32与@链33之间，A3-1位于@链38与3 链39之间且A3-2位于0链45与0链46之间。
34. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A1-1的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸15至约氨基酸45的区域。
35. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A1-1对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸18至约氨基酸41的区域。
36. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A1-2的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸201至约氨基酸232的区域。
37. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A1-2对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸218至约氨基酸229的区域。
38. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A2-1的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸395至约氨基酸421的区域。
39. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A2-1对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸397至约氨基酸418的区域。
40. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A2-2的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸577至约氨基酸635的区域。
41. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A2-2对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸595至约氨基酸607的区域。
42. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A3-1的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸1705至约氨基酸1732的区域。
43. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A3-1对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸1711至约氨基酸1725的区域。
44. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中包含A3-2的所述表面暴露的 可挠性环结构对应于天然成熟人因子VIII中自约氨基酸1884至约氨基酸1917的区域。
45. 如权利要求33所述的重组因子VIII融合蛋白，其中A3-2对应于天然成熟人因子 VIII中自约氨基酸1899至约氨基酸1911的区域。
46. 如权利要求30和32至45中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中XTEN插 入所述区域六1-1、六1-2、六2-1、六2-2、六3-1或六3-2的至少两者中。
47. 如权利要求30和32至46中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中XTEN是 紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入： 氨基酸残基编号 32、220、224、399、416、603、1711、1725、1905 和 1910。
48. 如权利要求30和32至47中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中另一 XTEN 序列插入a3酸性间隔子区域中。
49. 如权利要求48所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述另一 XTEN序列紧靠对应 于成熟天然人因子VIII中的氨基酸1656的氨基酸的下游插入a3酸性间隔子中。
50. 如权利要求31所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述A1结构域包含XTEN容许 环-1 (A1-1)区域和XTEN容许环-2 (A1-2)区域； 其中所述A2结构域包含XTEN容许环-1 (A2-1)区域和XTEN容许环-2 (A2-2)区域； 其中所述A3结构域包含XTEN容许环-1 (A3-1)区域和XTEN容许环-2 (A3-2)区域；且 其中另一 XTEN插入所述区域Al-1、Al-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2的至少一者中。
51. 如权利要求31所述的重组因子VIII融合蛋白，其中另一 XTEN紧靠对应于成熟天 然人因子VIII中选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、 220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和 1910。
52. 如权利要求15至51中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白 展现至少约30%、40%、50%、60%、70%或80%或90%的未连接于XTEN的相应因子VIII 的促凝血活性，其中所述促凝血活性是通过体外凝血测定加以测定。
53. 如权利要求52所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述促凝血活性是通过显色测 定、单级凝结测定或两者进行测量。
54. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当在细胞培养基 中表达且通过体外凝血测定加以测定时，所述融合蛋白展现体外促凝血活性超过约0. 5IU/ ml、或约 1. 0、或约 1. 5、或约 2. 0IU/ml。
55. 如权利要求30至54中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当向受试者施 用时，所述融合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或4小时、或6小时、或12小时、或13 小时、或14小时、或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或96小时、或120小时、或 144小时、或7天、或14天、或21天。
56. 如权利要求55所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述受试者是人。
57. 如权利要求55所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述受试者是因子VIII/血管 性血友病因子双重敲除小鼠。
58. 如权利要求30至57中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于未连接 于XTEN的所述相应因子VIII，所述融合蛋白展现与抗因子VIII抗体的结合降低。
59. 如权利要求58所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当使用选自由表10中的抗体 和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者的多克隆抗体组成的组的抗因子VIII抗体 在毕提斯达测定中进行测定时，相较于未连接于XTEN的所述因子VIII，所述因子VIII融合 蛋白具有的毕提斯达效价低至少约2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200 个毕提斯达单位。
60. -种包含因子VIII多肽和至少第一和第二延伸重组多肽（XTEN)的重组因子VIII 融合蛋白，其中所述第一 XTEN在所述因子VIII多肽的C2结构域内连接于所述因子VIII 多肽，且所述第二XTEN在所述因子VIII多肽的A1或A2结构域内连接于所述因子VIII多 肽；其中（a)相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，所述融合蛋白展现与抗因子VIII抗 体的结合降低，所述因子VIII抑制剂抗体能够结合位于所述A1、A2或C2结构域内的表位； 和/或（b)其中所述融合蛋白展现促凝血活性。
61. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述第二XTEN在所述因子 VIII多肽的所述A2结构域内连接于所述因子VIII多肽。
62. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子VIII抗体结合所 述因子VIII多肽的所述A2结构域。
63. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子VIII抗体结合所 述因子VIII多肽的所述C2结构域。
64. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述重组因子VIII融合蛋白 进一步包含第三XTEN，其中所述第三XTEN在所述B结构域内或置换所述B结构域的插入位 点处连接于所述因子VIII在C末端处连接于所述因子VIII。
65. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含在选自由表7中的位点组 成的组的插入位点的1、2、3、4、5或6个氨基酸处或内连接在所述因子VIII多肽内的第三 XTEN。
66. 如权利要求60所述的重组因子VIII融合蛋白，其包含在选自由表9中的位点组 成的组的插入位点的1、2、3、4、5或6个氨基酸处或内连接在所述因子VIII多肽内的第三 XTEN。
67. 如权利要求60至66中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当通过ELISA 测定加以测定时，相较于未连接于XTEN的所述相应因子VIII多肽，抗因子VIII抗体与所 述融合蛋白的结合降低至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。
68. 如权利要求60至67中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子 VIII抗体选自由表10中的抗体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病受试者的多克隆 抗体组成的组。
69. 如权利要求60至68中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当通过体外凝 血测定加以测定时，相较于未连接于XTEN的所述相应因子VIII，在抗因子VIII抗体存在 下，所述融合蛋白保留至少 10%、20%、30%、40%、50%、80%、100%、200%、300%、400% 或500 %或更多的促凝血活性。
70. 如权利要求69所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述测定是显色测定。
71. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，各XTEN具有特征在于以 下的序列： (a) 所述XTEN包含至少36个氨基酸残基； (b) 甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、谷氨酸（E)和脯氨酸（P)残基的 总和占所述XTEN的总氨基酸残基的约80%以上； (c) 所述XTEN序列大致上是非重复的以致（i)所述XTEN不含有三个相同连续氨基酸， 除非所述氨基酸是丝氨酸；（ii)至少约80%的所述XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述 序列基序各自包含约9至约14个由四至六个选自甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨 酸（T)、谷氨酸（E)和脯氨酸（P)的氨基酸组成的氨基酸残基，其中在各所述序列基序中，任 何两个连续氨基酸残基都不出现超过两次；或（iii)所述XTEN序列的子序列计分小于10 ; (d) 所述XTEN具有大于90 %无规卷曲形成率，如通过GOR算法所确定； (e) 所述XTEN具有小于2% a螺旋和2% 0折叠，如通过Chou-Fasman算法所确定； 且 (f) 当通过TEPIT0PE算法分析时，所述XTEN缺乏预测的T细胞表位，其中关于通过所 述算法进行所述预测的TEPIT0PE阈值计分的阈值是-9。
72. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当最优比对时，相 较于一个或多个选自由表4、表13、表14、表15、表16和表17组成的组的具有类似长度的 XTEN序列，各XTEN独立地具有至少约80 %、或至少约90 %、或至少约91 %、或至少约92 %、 或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约 98%、或至少约99%、或约100%序列同一性。
73. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于选自 AE42_1、AE42_2、AE42_3、AG42_1、AG42_2、AG42_3、AG42_4、AE144_1 A、AE144_2A、AE144_2B、 AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AG 144_ 1、AG 144_2、AG 144_ A、AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、AG144_4、AE288_1、AE288_2、AG288_1 和 AG288_2 的序列，至少一个XTEN具有至少90 %、或至少约91 %、或至少约92 %、或至少约93 %、或至 少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%、 或约100 %序列同一性。
74. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其在所述因子VIII序列 中包含一个、两个或三个选自由相对于成熟人因子VIII编号的残基R1645、R1648、Y1680、 R1689及其任何组合组成的组的氨基酸取代，其中各取代是独立地成为是丙氨酸、甘氨酸或 苯丙氨酸的氨基酸。
75. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白展现 表观分子量因子至少约1. 3、或至少约2、或至少约3、或至少约4、或至少约5、或至少约6、 或至少约7、或至少约8、或至少约9、或至少约10。
76. 如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽 通过一个或两个各自可由选自由因子XIa、因子Xlla、激肽释放酶、因子Vila、因子IXa、因 子Xa、因子Ila(凝血酶）、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20组成的组的哺 乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接于至少一个XTEN，其中由所述哺乳动物蛋白酶在所述裂 解序列处裂解会自所述XTEN释放所述因子VIII序列，且其中所述释放的因子VIII序列相 较于所述未裂的解融合蛋白展现促凝血活性增加。
77. 如权利要求76所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述裂解序列可由因子XIa裂 解。
78. -种包含至少三个独立XTEN的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽 包含含有al酸性间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构域、含有a3 酸性间隔子区域的A3结构域、Cl结构域、C2结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其 中所述至少三个XTEN各自位于所述因子VIII多肽的不同插入位点处，其中所述不同插入 位点各自独立地选自由以下组成的组： (a) 来自表5、表6、表7、表8或表9的插入位点； (b) 关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，在氨基酸残基32、220、224、336、339、 390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 或 1910 的 6 个氨基酸内的插入位点； (c) 在所述因子VIII序列中的任何两个邻近结构域之间的插入位点，其中所述两个邻 近结构域选自由A1和A2、A2和B、B和A3、A3和C1、以及C1和C2组成的组； (d) 关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，在自在约氨基酸残基编号741至约750 处的第一位置开始且在于约氨基酸残基编号1635至约1648处的第二位置处结束的内部B 结构域缺失内的插入位点； (e) 所述因子VIII序列的C末端； (f) 所述因子VIII序列的N末端；以及 (g) 在所述因子VIII多肽的两个邻近结构域之间； 其中所有XTEN的累积长度是至少约84至约3000个氨基酸残基。
79. 如权利要求78所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白不包含选自 GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO: 31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO: 32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID N0:33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID N0:34)和 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP(S EQ ID NO :59)的序列。
80. 如权利要求78或权利要求79所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白 不含有由 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP(S EQ ID NO :59), PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTG SPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSS(S EQ ID NO:71)或 PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPG- SGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGAT GSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS(SEQ ID NO:80) 组成的XTEN序列。
81. 如权利要求78至80中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于未连接 于XTEN的所述相应因子VIII，所述融合蛋白保留至少约30%、或约40%、或约50%、或约 60%、或约70%、或约80%、或约90%的促凝血活性，其中所述促凝血活性是通过体外凝血 测定加以测定。
82. 如权利要求78至80中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白，其中相较于缺乏所 述XTEN的相应因子VIII多肽，当向受试者施用时，所述融合蛋白展现终末半衰期延长。
83. 如权利要求82所述的重组因子VIII融合蛋白，其中当向受试者施用时，所述融合 蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或4小时、或6小时、或12小时、或13小时、或14小 时、或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或96小时、或120小时、或144小时、或 7天、或14天、或21天。
84. 如权利要求83所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述受试者是人。
85. 如权利要求83所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述受试者是因子VIII/血管 性血友病因子双重敲除小鼠。
86. -种包含因子VIII多肽和至少一个XTEN的重组因子VIII融合蛋白，其中所述 因子VIII多肽包含A1结构域、A2结构域、A3结构域、C1结构域、C2结构域和任选B结构 域的全部或一部分，且其中所述至少一个XTEN的各者在选自由残基编号18-32、或40、或 211-224、或 336-403、或 599、或 745-1640、或 1656-1728、或 1796-1804、或 1900-1912、或 2171-2332组成的组的插入位点处连接于所述因子VIII多肽；且其中所述融合蛋白具有 至少约30%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约80%、或约90%的未连接于 XTEN的相应因子VIII的促凝血活性。
87. -种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白 和药学上可接受的载体。
88. -种治疗受试者的凝血病变的方法，其包括向所述受试者施用包含凝结有效量的 如权利要求87所述的药物组合物的组合物。
89. 如权利要求88所述的方法，其中在所述施用之后，相较于包含未连接于XTEN的因 子VIII且以类似剂量向所述受试者施用的相应组合物，促凝血因子VIII的血液浓度维持 在较大水平下。
90. 如权利要求89所述的方法，其中在所述施用之后，所述血液浓度维持在约0. 05IU/ ml、或约0. lIU/ml、或约1. 5IU/ml或更高持续至少48小时。
91. 一种使受试者的血液凝结的方法，其包括使凝结有效量的如权利要求87所述的药 物组合物与所述血液接触。
92. -种治疗具有因子VIII的循环抑制剂的受试者的凝血病变的方法，其包括向所 述受试者施用凝结有效量的如权利要求87所述的药物组合物，其中相较于包含未连接于 XTEN的所述相应因子VIII且使用类似量向所述受试者施用的组合物，所述组合物展现在 所述受试者中的促凝血活性较大。
93. -种处理受试者的流血事件的方法，其包括向所述受试者施用凝结有效量的如权 利要求87所述的药物组合物，其中相较于未连接于XTEN且使用类似量向所述受试者施用 的所述相应因子VIII，所述融合蛋白的所述凝结有效量遏止流血事件持续的时期长至少2 倍、或至少3倍。
94. 如权利要求88至93所述的方法，其中所述凝血病变是甲型血友病。
95. -种用于治疗甲型血友病受试者的医药方案中的重组因子VIII融合蛋白，所述方 案包括包含如权利要求1至86中任一项所述的重组因子VIII融合蛋白的药物组合物。
96. 如权利要求95所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述医药方案进一步包括确定 为在所述甲型血友病受试者中实现止血所需的药物组合物的量的步骤。
97. 如权利要求95所述的重组因子VIII融合蛋白，其中用于治疗甲型血友病受试者的 所述医药方案包括以有效量连续两剂或更多剂向所述受试者施用所述药物组合物，其中相 较于未连接于XTEN且使用类似剂量施用的因子VIII，所述施用导致至少一个、两个或三个 与甲型血友病相关的参数较大改善至少10%、或20 %、或30%、或40 %、或50%、或60 %、 或 70%、或 80%、或 90%。
98. 如权利要求97所述的重组因子VIII融合蛋白，其中所述改善的参数选自促凝血因 子VIII的血液浓度、活化的部分凝血酶原（aPTT)测定时间减少、单级或两级凝结测定时间 减少、流血事件的发作延迟、显色测定时间减少、流血测定时间减少、流血事件解决、或相对 于天然FVIII的毕提斯达效价降低。
99. 一种用于治疗甲型血友病的重组因子VIII融合蛋白，其包含如权利要求1至86中 任一项所述的重组因子VIII融合蛋白。
100. -种核酸或其互补序列，所述核酸编码如权利要求1至86中任一项所述的重组因 子VIII融合蛋白。
101. 如权利要求100所述的核酸，其进一步包含编码信号肽的序列，其中所述序列是 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID NO:1613) 或其互补序列。
102. 一种表达载体，其包含如权利要求100或权利要求101所述的核酸。
103. -种分离的宿主细胞，其包含如权利要求102所述的表达载体。
104. -种产生如权利要求1至86中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括： (a) 提供包含如权利要求102所述的表达载体的宿主细胞； (b) 在用以实现所述融合蛋白的产生的条件下培养所述宿主细胞；以及 (c) 回收所述融合蛋白。
105. -种包含多肽的重组因子VIII融合蛋白，当最优比对时，相较于选自表21的具 有类似长度的序列，所述多肽具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91%、或至少约 92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少 约98%、或至少约99%、或至少约100%序列同一性。
106. -种分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：（a)当最优比对时，相较于选 自表21的具有类似长度的序列，具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91%、或至少 约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或 至少约98%、或至少约99%、或至少约100%序列同一性的序列，或（b) (a)的多核苷酸的互 补序列。
107. 如权利要求106所述的分离的核酸，其进一步包含连接于（a)的核酸的5'末端的 序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCnTTGCGAITCTGCTTTAGT 或所述序列的连 接于（b)的3'末端的互补序列。
【文档编号】A61K38/37GK104487452SQ201280072346
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2012年2月15日
【发明者】沃尔克·斯彻勒伯格, 佩-云·常, 伐巴德哈·瓦法杰, 丁胜, 约胜·斯沃曼, 查-威·王, 本杰明·斯平克, 威廉·P·斯蒂姆, 内森·吉森, 约翰·库曼, 刘童瑶, 伽拉贝特·G·托比, 江海燕, 罗伯特·彼得斯, 王德平, 梅柏松 申请人:阿穆尼克斯运营公司, 比奥根艾迪克Ma公司