专利名称：因子viii蛋白向血小板的靶向递送的制作方法
技术领域：
本文描述的发明涉及包含至少一个与人因子VIII或其生物活性部分具有显著同一性(同源性)的氨基酸序列的多肽、有关的分子(诸如编码这样的多肽的核酸)、包含这样的多肽的组合物(诸如药物制剂)、以及制备和使用这样的多肽和有关的生物分子的方法。
背景技术：
凝血因子VIII (“因子VIII”或“FVIII”)是一种重要的凝结因子。正常的FVIII 的缺少会造成A型血友病，即一种遗传性出血障碍。因子VIII参与血液凝结的内源性途径。 具体地，因子VIII是将因子X转化成活化的因子fe (在Cf2和磷脂存在下)的因子IXa 的辅因子。因子VIII基因生成2种可选地剪接的转录物。转录物变体1编码大糖蛋白同种型a，其在血浆中循环，且与von Willebrand因子(“vWF”)结合成非共价复合物。该蛋白经历多个切割事件。转录物变体2编码认为的小蛋白同种型b，其主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。该结合域是促凝剂活性所必需的。FVIII的结构是众所周知的(参见，例如， Thompson, Semin Thromb Hemost. 2003 Feb；29(1)11-22)。在被凝血酶(因子IIa)活化后，因子Villa (FVIIIa)从FVIII vWF复合物解离， 以与因子Ixa相互作用，造成确定地表征的事件链，导致更多凝血酶的生成。凝血酶会将纤维蛋白原切割成纤维蛋白，其聚合并交联(使用因子XIII)成血块。FVIIIa在该过程中被活化的蛋白C ( “aPC”)和因子Ixa蛋白水解地灭活，并迅速从血流中清除。可以将从捐献的血浆浓缩的FVIII或可选地重组的FVIII施用给血友病患者，以恢复止血。因而，FVIII也称作抗血友病因子。FVIII在体内具有约10-12小时的循环半衰期，因此非常希望提供具有延长的半衰期的FVIII类似物，以便降低治疗性/预防性静脉内FVIII输注的频率。W02009140598公开了包括杂种分子的概念，所述杂种分子包含FVIII和GPIIb/ IIIa特异性的抗体。但是，该概念可能导致GPIIb/IIIa受体的结合纤维蛋白原的能力的抑制，因而在施用这样的杂种FVIII分子以后，会降低形成初级血块(primary clot)的能力。 因而，本领域需要生物活性的因子VIII分子，其具有以高亲和力结合血小板的能力。此外， 本领域需要生物活性的因子VIII分子，其具有结合血小板的能力，同时基本上保留血小板的聚集并从而形成初级血块的能力。发明概述
本发明提供了靶向分子，例如包含非抑制性的GPIIb/IIIa特异性的抗体的因子VIII (FVIII)分子，以及有关的分子、组合物，制备这样的分子的方法，和使用这样的分子和组合物的方法(例如，在A型血友病的治疗或调节中)。在本文中将更完整地描述本发明的这些和其它方面、特征和优点。
fil图释了可能的方法，通过所述方法，可以将SCFv化学地连接到FVIII或 FVIII类似物氨基酸序列上，或作为含有FVIII或FVIII类似物氨基酸序列的多肽的一部分顺式地表达，从而得到修饰的FVIII分子。具体地显示了用于生产这样的分子的糖缀合、 化学缀合和融合蛋白方法。在适用时，这些方法可以类似地用于制备本发明的其它FVIII 分子。12 图释了血小板聚集。条显示了用 F8-500 AP3-LC-HC scFV - Δ a3 (AP3-N8) 或ReoPro 预处理的、SFLLRN (10 μΜ)活化的血小板中的聚集。显示的数据是双份测定的平均值士平均值标准差，其中将单独的SFLLRN (10 μΜ)设定为100%。Ml图释了最终的靶向载体。Mi图释了 ΑΡ3-Ν8 2097 (A)和ΑΡ3-Ν8 MZl (C)以剂量-依赖性的方式结合人血小板。用过量的AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEQ ID NO 22)，可以几乎完全竞争两种化合物
的结合。发明详述
在本发明的卜.下f中，因子VIII蛋白(或FVIII蛋白)是这样的蛋白，其包含与选自下述的氨基酸序列表现出至少约70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列人因子VIII (SEQ ID N0:1)、或其成熟部分(即，其残基20-2351)、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/ 截短形式，如下所示。因子 VIII (SEQ ID N0:1) MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE
FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFV匪ERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLI^KNNAIEPRSFSQNS RHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPG AIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDN TSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKR AHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDK NATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVS LGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQEN VVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTK QIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEK GAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAK KNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFK KKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISV EMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPL YRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMA PTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRA PCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNL YPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHY SGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDS SGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTWFATWSPSKAR LHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGN QDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
因子VIII B-结构域缺失形式(SEQ ID NO:2)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYffYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNP PVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHV LRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEE DQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQV TVQEFALFFTIFDETKSWYFTE匪ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMG SNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPL GMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFI IMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLG MESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMY VKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
因子VIII B-结构域截短形式(“N8”)(SEQ ID NO:3)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV
5TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNS RHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYG MSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYS SLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLN PAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIR WYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYS NKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSS LYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVK SLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGC EAQDLY
在一个更具体的方面，本发明涉及靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID N0:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约75%、至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%同一性。在一个再更具体的方面，本发明涉及靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NOiUSEQ ID NO: 2、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约90%同一性(诸如至少约93%同一性)。在另一个方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分表现出至少约95%同一性。在更具体的方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约98. 5%、至少约99%、至少约99. 5%、或至少约99. 7%、至少约99. 8%、或甚至至少约99. 9%同一性。换而言之，在一个方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其特征在于，包含这样的氨基酸序列，该序列相对于SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式，被缺失、插入和/或置换了至少1个、通常至少2-3个、经常至少1-5、通常至少1-20个(诸如 1-15、1-12、1-10、1-7、1-3、2-20、2-15、2-12、2-10、2-7、2-5、3-20、3-15、3-12、3-10、3-7、 3-5、4-20、4-15、4-12、4-10、4-7、5-20、5-15、5-12、5-10 或 5-7 个)氨基酸残基。通常，将FVII “类似物”序列中至少约50%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、诸如约75%或更多、约80%或更多、约85%或更多、约90%%或更多、或甚至约95%或更多(诸如至少约97%、98%、99%、99. 3%,99. 5%,99. 7%,99. 8%)的置换表征为“保守置换”。通过在下述 3个氨基酸分类表中的一个或多个中反映出的氨基酸类别内的置换，可以定义保守置换
表1 -保守置换的氨基酸残基类别 _
权利要求
1.一种FVIII分子，其包括与选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的成熟部分具有至少约95%同一性的氨基酸序列，所述分子共价地结合到血小板-特异性的分子上，其中所述血小板-特异性的分子是非抑制性的GPIIb/IIIa抗体。
2.根据权利要求1所述的FVIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa 抗体选自AP3抗体、Tab抗体或SZ22抗体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的FVIII分子，其中所述分子是融合蛋白。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa 抗体通过连接物共价地连接到FVIII上。
6.根据权利要求5所述的FVIII分子，其中所述连接物包含在FVIII分子上的N-连接的或0-连接的聚糖。
7.根据权利要求6所述的FVIII分子，其中所述聚糖位于B结构域中。
8.根据权利要求4所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体融合到 B结构域截短的因子VIII分子的B-结构域上。
9.根据权利要求4所述的FVIII分子，其中FVIII分子的a3结构域被非抑制性的 GPIIb/IIIa抗体替换。
10.根据权利要求7所述的因子FVIII分子，其中所述FVIII分子包含如在SEQID NO 3中所述的序列，且其中所述连接物包含位于B结构域中的0-连接的聚糖。
11.一种核酸，其编码根据权利要求8或9中任一项所述的FVIII分子。
12.—种宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸。
13.—种生产FVIII分子的方法，所述方法包括在根据权利要求12所述的宿主细胞中，表达根据权利要求11所述的核酸。
14.一种生产根据权利要求5、6、7和10中任一项所述的FVIII分子的方法，其中所述方法包括将FVIII分子与非抑制性的GPIIb/IIIa抗体缀合。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的FVIII分子。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的FVIII分子作为用于治疗A型血友病的药物的用途。
17.一种治疗哺乳动物宿主中的A型血友病的方法，所述方法包括给所述宿主施用治疗有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的分子。
全文摘要
本文描述的发明涉及包含至少一个与人因子VIII或其生物活性部分具有显著同一性(同源性)的氨基酸序列的新颖分子和多肽、有关的分子(诸如编码这样的多肽的核酸)、包含这样的多肽的组合物(诸如药物制剂)、以及制备和使用这样的多肽的方法。
文档编号C07K19/00GK102482340SQ201080015319
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月6日
发明者A.E.普萨特里, 佩施克 B., 贝伦斯 C., H. N. 奥尔森 E., 奥斯特加尔德 H., 斯特尼克 H., 布夏特 J., A. 曾德尔 M., 科福德-汉森 M., R. 巴内特 T. 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司