专利名称：检测膜通道蛋白与靶向药物的相互作用的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测膜通道蛋白与靶向药物的相互作用的方法及其应用。
背景技术：
细胞电压门控钠通道(VGSCs)在神经元和其他可兴奋性细胞动作电位形成和传导过程中有非常重要的作用，其细微变化或表达异常都会导致功能改变，是导致癫痫、疼痛、 先天性肌肉强直症、周期性瘫痪等各种疾病的关键因素，一直是研究的热点。但是在长期的进化和演变中，钠通道形成了一系列亚型，广泛分布在生物体各个组织中。其亚型的多样性使得研究过程中针对亚型的区分和鉴定尤为重要，而特异性通道靶向药物则成为不可或缺的工具。钠通道靶向药物能够针对钠通道不同的亚型，具有各种不同的结合位点和作用方式，使得能够通过两者之间相互的结合和作用，成为钠通道亚型区分和鉴定的探针，同时也是研究钠通道功能的工具。BmK I是由东亚短钳蝎中提取分离得到的钠通道特异性靶向药物，是一个由60-70 个氨基酸组成的长链肽类，能够作用于钠通道，改变钠通道的电生理特征，显著延缓其失活过程。其机理是由于钠通道由一个形成孔道的功能性α亚基，一个或数个辅助β亚基组成。α亚基是钠通道行使功能的关键亚基，由四个高度同源的结构域(D I -D IV)组成，每个结构域含有六个跨膜α螺旋片段(S1-S6)。在其结构上目前已经鉴定了至少七个通道靶向药物的受体位点。sra技术可以观测生物分子的动态结合，实验时将一种生物分子固定在特殊的芯片上，利用液体传送系统将溶解有另一种生物分子的结合缓冲液流经芯片，当溶液中的分子与固定在芯片上的分子相互结合时会改变芯片表明的溶液折射率(Resonance Unit, RU)，折射率的变化与结合在芯片表面的生物分子质量成正比。仪器通过跟踪检测折光率的变化，进而分析出生物分子之间结合、解离的整个过程。sra技术能够实时检测生物分子间的相互作用，不必使用任何标记，能够保证生物分子的天然活性。全细胞膜片钳能够进行单个细胞的电生理记录，通过给予单个细胞电刺激(一定阈值的电压或电流刺激)，或化学刺激(特异性靶向药物等)可以记录到由离子通道开放关闭所引起的电流或电压信号，这一信号即可反映离子通道的电生理学性质，是研究离子通道性质的重要指标。而膜通道靶向药物作用于通道之后，可以引起通道电生理学性质的改变，从而为研究离子通道提供依据。钠通道作为一个大分子量的膜蛋白(260KD)，如何能够分离纯化而不影响其活性， 保证其完整的结构，是目前尚未解决的难题，而sra技术检测动态结合，往往是需要能够获得待研究的生物分子样本，因此膜通道蛋白分离纯化的难题，在某种程度上就制约了它的使用，本发明利用人工合成关键结合序列肽链的方法，克服了此类限制，并成功验证了其可行性，使得利用sra技术研究膜通道蛋白与其靶向药物结合成为可能。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法。本发明的目的之二在于提供该检测方法的应用。为达到上述目的，本发明采用如下实验方案
一种检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于该方法的具体步骤为
a.根据膜通道蛋白上与其靶向药物相互作用位点上的关键氨基酸序列，合成肽链；
b.采用表面等离子共振技术检测步骤a所得的肽链与靶向药物的相互作用。上述的膜通道为细胞电压门控钠通道，该通道的位点3与其靶向药物相互作用的关键氨基酸序列为D IV /S3-S4胞外环，根据该关键氨基酸序列设计的两段肽链为
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ； 所述的靶向药物为钠通道靶向药物BmK I。上述的步骤b的具体方法为
a.靶向药物的芯片固化
注 Λ 40OmM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的 N-hydroxy-succimide的按1: 1的体积比混合成的混合液，激活CM5传感器芯片上的偶联基团-COOH ；将靶向药物以23 μ g/ml的配置浓度置于pH5. OUOmM醋酸钠溶液中，取30 μ 1 注入芯片；
b.取一系列结合反应终浓度下的肽链分别以20ul/min的流速通过步骤a所得的固化有靶向药物的传感器芯片；所有反应在4°C进行；使用的结合反应液为NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 调至 ρΗ7· 4。上述的肽链为
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL
rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ；所述的靴向药物为钠通道靴向药物BmK I。本发明选取鼠源钠通道亚型1.5 (rNavl. 5)作为阳性对照，SI3R能观察到明显结合信号，其电生理性质能够被Bmk I显著影响。以鼠源钠通道亚型1.8 (rNavl. 8)与其对照， 发现通过Sra技术能观察到结合信号，但Bmk I与其结合后，rNavl. 8的电生理性质未有显著变化，由此发现BmK I对于rNavl. 8的新特性。BmK I作为特异性钠通道靶向药物，能够结合rNavl. 8却不影响其功能。本发明经人工合成膜通道蛋白相关的关键性氨基酸序列肽链，同时运用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术实时检测合成的膜通道蛋白肽链与其靶向药物相互作用的动态结合，再经电生理记录，来检测膜通道的功能变化。本发明运用该方法，验证了钠通道亚型1. 8对其靶向药物BmK I的选择敏感性，即BmK I能够结合钠通道亚型1.8，但是不影响其功能，而本发明的钠通道靶向药物BmK I能够与钠通道上受体位点3 结合。受体位点3由VGSCs的D I /S5-S6、D IV /S5-S6、以及D IV /S3-S4组成，其中D IV / S3-S4这段序列中的氨基酸对通道与位点3靶向药物结合至关重要。由此证明本发明从技术层面为研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其与靶向药物相互作用开拓了新思路，提供了新的可行检测方法。
图1为Bmk I影响钠通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的电生理记录。其中，(A)300nM BmK I 施加前后，rNavl. 5 电流的变化；(B) I5ms/Ipeak (rNavl. 5) ； (C) 300nM BmK I 给药 rNavl. 8 的影响；(D) I5ms/Ipeak (rNavl. 8)。图2为位于钠通道(rNavl. 5，rNavl. 8)位点3的关键氨基酸序列肽链与钠通道靶向药物(BmK I)的相互作用结果。其中，(A)和(B)分别为rNavl. 5和rNavl. 8位点3上关键氨基酸序列合成肽链与BmK I结合情况(一系列浓度分别为1X10_9，2.5X10_9，5X10_9， 7. 5X10_9，1X10_8 mol/L)。
具体实施例方式实施例一表面等离子共振(SH ，BIACore 3000)检测位于钠通道 (rNavl. 5，rNavl. 8)位点3的关键氨基酸序列肽链与钠通道靶向药物(BmK I)的相互作用。1.定位钠通道位点3的关键氨基酸序列，并工人合成肽链。根据先前的文献报道和研究，位点3靶向药物通过结合钠通道位点3影响其功能， 其中D IV /S3-S4胞外环是重要组成部分，这段氨基酸序列对通道与位点3靶向药物的结合至关重要。因此，通过检索比对钠通道氨基酸序列，列出rNavl. 5和rNavl. 8的该段序列
rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL
人工合成两段多肽(由吉尔生化有限公司合成)，分子量分别为2228. 63和2400. 82，纯度分别为95. 75%和96. 41%，液相色谱和质谱报告由公司提供。(本说明书中未列出)
以细胞外液(mM :NaCl 150，CaCl2 1.2，MgCl2 1,KC1 3. 5，HEPES 10，D_glucose 20，用 NaOH 调至 ρΗ7· 4)溶解为 1 X l(T8mol/L，-20° 保存。2. SI3R检测多肽链与BmK I结合
采用全自动生物传感器BIACore -3000 (Pharmacia公司)实时分析两段多肽链与BmK I的结合效应。丨I)BmK I的芯片固化
注入 40 μ 1 的 400mM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的N-hydroxy-succimide的按1:1的体积比混合而成的混合液，激活CM5传感器芯片上的偶联基团-C00H。将BmK I以23 μ g/ml的配置浓度置于IOmM醋酸钠溶液中(pH5. 0)，取 30μ1注入芯片。实际观测到的芯片结合量为1020共振单位(RU)。芯片表面上过量的偶联基团可被!35μ1的IM ethanolamine hydrochloride (pH 8. 0)去活化。整个过程使用 BIACore -3000 专用的 HBS 缓冲液150Mm NaCl ；3. 5mM EDTA ；0. 05% BIACore _3000 表面活性剂 P-20 禾口 IOmM HEPES, pH 调至 7. 4. U与多肽的结合
一系列不同浓度的多肽以20ul/min的流速通过固化有BmK I的传感器芯片。所有反应均在 4°C进行。使用的结合反应液NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 调至 ρΗ7· 4。结合反应实验程序完成后，继续在结合缓冲液的使用环境下，等待二者解离，解离程序完成后，固化芯片以5mM NaOH再生。实验过程中与BIACore -3000相连接的计算机实时记录反应信号，并使用BIA Evaluation软件包分析数据。
结果显示一系列浓度(1X10-9，2.5X10-9，5X10-9，7.5X10-9，1X10_8)的多肽与 BmK I均有显著的快速结合，并且具有浓度依赖性，结合量RU值随着多肽浓度的增加而上升。参见图2。结果表明rNavl. 5上肽链能够与BmK I显著结合，KA值为1. 61 X IO8 (1/M)，KD 值为6. 23 X KT9(M)，在芯片上的最大结合量为92. 6 (RU)。而rNavl. 8上肽链同样观察到了与BmK I的结合，KA值为6. 71 XlO8(1/M)，KD值为1. 49X 10_9(M)，芯片最大结合量为 40. 3 (RU)。通过SI3R检测表明，BmK I能够与rNavl. 5，rNavl. 8显著性结合。实施例二 Bmk I影响钠通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的电生理记录 1外源表达rNavl. 5和rNavl. 8
EI ]制备 rNavl. 5 (pCDNA3. 1+rNavl. 5)和 rNavl. 8 (pEGFP-N2+rNavl. 8)质粒，以两种质粒分别转化大肠杆菌DH5 α，用氨苄青霉素(50mg/L)筛选rNavl. 5阳性菌落，用卡那霉素(50mg/L)筛选rNavl. 8阳性菌落。用LB培养基扩大培养菌株，使用质粒大提试剂盒 (TianGen公司)进行质粒大量抽提。(具体步骤见试剂盒说明书)。(2)培养HEK293T细胞系和ND7/23细胞系并转染。HEK293T细胞用含10%胎牛血清(FBS)，4mM Glutamine的DMEM培养基培养；ND7/23细胞用含10%胎牛血清(FBS)，2mM Glutamine的DMEM培养基培养。两种细胞均置于含5% CO2的37°培养箱中培养，采用胰蛋白酶(0.025%)消化法进行细胞传代。在转染前M小时传代，接种于35mm培养皿。待细胞长满平皿的60%左右，进行转染。细胞转染采用脂质体Lipoefectamin 2000( Invitrogen, he)转染试剂，严格按照转染试剂说明书进行操作。rNavl. 5转染于HEK293T细胞；rNavl. 8 转染于ND7/23细胞。以8μ 1脂质体携带3μ g质粒转染细胞(具体步骤见转染试剂说明书)。2全细胞膜片钳记录钠通道电流转染后24-48小时的细胞用于膜片钳实验。膜片钳记录均在室温下(20-22°C)进行。记录玻璃微电极(内径1.5mm，武汉微探款科学仪器有限公司，中国)经两步拉制仪(Narishige，PC-10, Japan)垂直拉制而成，充灌电极内液 (mM, CsF 140，CsCl 10，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10 ；用 CsOH 调节至 ρΗ7· 3)后，电极阻抗为2ΜΩ左右。在倒置显微镜下，通过微操纵仪将充灌电极内液的记录电极轻轻压向细胞表面。当封接阻抗增加时，再使电极稍稍下降，并迅速通过记录电极内部施加适当负压，使电极和细胞表面形成紧密封接。在此基础上继续施加负压破膜，即形成全细胞记录方式。采用Axopatch 200Β膜片钳放大器采集电流信号，电流信号经AD/DA转换器进入计算机后， 由pCLAMPS. 2软件的Clampex采样程序采入，采样频率为20ΚΗζ。电流信号经膜片钳放大器低通贝塞尔滤波(low-pass Bessel filter)，_3dB频率为2KHz。串联电阻补偿为85-95%。 均采用Clampex采样程序提供的P/N漏减功能(P/N leak Subtraction)消除漏电流，N=_4 (P/-4，施加4个与阶跃脉冲时程相同、极性相反的漏减脉冲，幅度为阶跃脉冲的1/4)。全细胞记录形成至少10分钟待电流稳定后再进行实验观察。BmK I 溶解于细胞外液(mM :NaCl 150，CaCl2 1. 2，MgCl2 1，KCl 3. 5，HEPES 10， D-glucose 20，用NaOH调至pH7. 4)。加药管直径约为100 μ m，距离细胞约100 μ m，给药速度为 200-300 μ 1/min。
本发明表达rNavl. 5的载体为HEK293T细胞系，非转染的HEK293T细胞的平均本底电流密度为D=5.53 士0.21 pA/pF(n=15)，这些本底电流与在转染细胞中激活的电流相比要小得多，因此在分析时可以忽略不计。参见图1，将细胞钳制于-140mv时，给予_20mv 跃阶刺激，比较300nM BmK I施加前后，rNavl. 5电流的变化(如图IA所示)。为了定量描述 BmK I对rNavl. 5失活的影响，将去极化刺激开始后4. 5ms到5ms间的电流平均值与此电压下峰值的比值定义为IaiisAprak作为BmK I对通道失活过程影响的指标。统计分析发现， 加药前，rNavl. 5失活较快，IaisApeak仅占峰钠电流的0. 14士0. 01 (n=32)；施加300 nM BmK I后，rNavl. 5失活化过程极其显著地被延缓，此比值变为0. 62士0. 02(n=21)(如图IB所示)。表达rNavl. 8的载体为ND7/23细胞系。据已有研究表明，ND7/23具有内源性本底电流，但是可以被500nM TTX (河豚鱼毒素)完全阻断，而rNavl. 8是TTX不敏感型钠通道 (TTX-R通道，IC50彡100yM)，500nm TTX不会阻断rNavl. 8的电流。在记录rNavl. 8电流时，在细胞外液中添加500nM TTX，可记录到单独的rNavl. 8通道电流。图IC所示，钳制电位为_80mv，给予细胞+IOmv刺激时，施加300nM BmK I前后(施加时间为IOmin)的rNavl. 8 电流，同样使用I5msApeak作为量化指标，施加300nM BmK I前后rNavl. 8电流的失活没有显著性差异:I5fflS/Ipeak加药前后分别为0. 62士0. 02 (n=8)和0. 61 + 0. 01 (n=4)。(图ID所示)
结果可发现，300nM BmK I能够影响rNavl. 5，显著延缓其失活过程，而对rNavl. 8则无明显效果。通过电生理记录，检测出通道靶向药物(BmK I)对于通道(rNavl. 5，rNavl. 8)功能的影响。两种检测结果对比发现，BmK I对于rNavl. 5来说，功能影响和动态结合具有一致性，但是对于rNavl. 8来说，二者存在差异，BmK I能够结合rNavl. 8，实际上却并不显著影响其功能。由此证明本方法能够从技术层面为研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其与靶向药物相互作用开拓新思路，是具备可行性的检测方法。
权利要求
1.一种检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.根据膜通道蛋白上与其靶向药物相互作用位点上的关键氨基酸序列，合成肽链；b.采用表面等离子共振技术检测步骤a所得的肽链与靶向药物的相互作用。
2.根据权利要求1中所述的检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于所述的膜通道为细胞电压门控钠通道，该通道的位点3与其靶向药物相互作用的关键氨基酸序列为D IV /S3-S4胞外环，根据该关键氨基酸序列设计的两段肽链为rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL rNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ； 所述的靶向药物为钠通道靶向药物BmK I。
3.根据权利要求1所述的检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于所述的步骤b的具体方法为a.靶向药物的芯片固化注 Λ 400mM 的 N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid 禾口 IOOmM 的 N-hydroxy-succimide的按1: 1的体积比混合成的混合液，激活CM5传感器芯片上的偶联基团-COOH ；将靶向药物以23μβ/πι1的配置浓度置于pH5. OUOmM醋酸钠溶液中，取30 μ 1 注入芯片；b.取一系列结合反应终浓度下的肽链分别以20ul/min的流速通过步骤a所得的固化有靶向药物的传感器芯片；所有反应在4°C进行；使用的结合反应液为NaCl 150 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 1 mM, KCl 3.5 mM, HEPES 10，D-glucose 20 mM，用 NaOH 调至 ρΗ7· 4。
4.根据权利要求3所述的检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于所述的肽链为rNavl. 5 SIVGTVLSDIIQKYFFSPTLrNavl. 8 SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL ；所述的靴向药物为钠通道靴向药物BmK I。
全文摘要
本发明涉及一种检测膜通道蛋白与靶向药物的相互作用的方法及其应用。该方法的具体步骤为根据膜通道蛋白上与其靶向药物相互作用位点上的关键氨基酸序列，合成肽链；采用表面等离子共振技术检测步骤a所得的肽链与靶向药物的相互作用。发明从技术层面为研究研究膜通道蛋白生理/病理功能及其与靶向药物相互作用开拓了新思路，提供了新的可行检测方法。
文档编号C07K14/00GK102565006SQ20121000805
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月12日 优先权日2011年5月19日
发明者冯兴华, 叶品, 吉永华, 杨宏天, 董邦乾 申请人:上海大学