专利名称：一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可溶性蛋白，它是由人⑶47受体SIRP α的胞外段，与其氨基末端融合的TrxHis表达标签组成的一种白血病干细胞革巴向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，属于医药生物技术领域。
背景技术：
信号调节蛋白ct (Signal-regulatory protein α , SIRP α ),又称为 SHPS-1,SIRPA，p84及BIT，属于免疫球蛋白超家族成员。它主要表达在巨噬细胞、神经元、树突细胞及中性粒细胞。这种跨膜蛋白包含胞外区的三个免疫球蛋白样结构域及胞浆区的酪氨酸磷酸化位点，其胞浆区在大鼠，小鼠和人之间高度保守，含有酪氨酸残基并形成抑制性受体基于酪氨酸的抑制性基序ITIM，从而激活包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-I及SHP-2。SHP-I主要表达在造血细胞及上皮细胞，可负性调节这些细胞的许多功能，SHP-2表达广泛，可通过调节小GTP结合蛋白Ras及Rho而发挥促进细胞生长、迁移及分化等正向调节功能。因此，SIRPa就作为一个船坞蛋白对细胞膜外的刺激产生反应，并通过募集SHP-I或SHP-2而发挥它特殊的生物学功能。此外，SIRPa也可以连接Src激酶相关蛋白SCAP2 (也称为SKAP55hom/R)以及Fyn连接蛋白FYB (也称为SLAP-130)而引起明显的抑制性信号。近年研究发现，SIRPa作为CD47的胞外受体，在巨噬细胞对肿瘤细胞的清除过程中发挥着重要作用。CD47,又称整合素相关蛋白(integrin-associated protein , IAP),也属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。最初从人胎盘与整合素α V β3共纯化而为人们所认识。它是一种广泛表达的抗原，存在于所有组织的不同细胞上。这种跨膜蛋白包含V型I g样胞外结构域，高度疏水的五次跨膜区以及胞浆区。CD47最初是作为整合素依赖的白细胞，对细胞外基质蛋白反应进行调节而发挥作用。最经典的确定CD47在调节吞噬作用的证据来源于将⑶47敲除红细胞(RBCs)移植入正常小鼠体内后很快被巨噬细胞从血液中清除，表明RBC表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRPa结合可能在缓冲巨噬细胞对自身细胞清除中具有重要作用。巨噬细胞的吞噬作用是肿瘤免疫监视的重要调节因素。最近的研究表明，在急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及非何杰金氏淋巴瘤(NHL)等恶性血液系统肿瘤病中，大量的白血病细胞及白血病干细胞(LSC) CD47表达显著上调，并可通过与SIRPa间的相互作用，阻止白血病细胞被宿主的先天免疫系统清除。这也是白血病耐药、复发的重要原因之一。而通过靶向性的⑶47单克隆抗体阻断⑶47-SIRPa间的作用，可以促进巨噬细胞对白血病细胞及LSC的吞噬作用，且不会减少正常的造血干细胞，对于白血病的治疗有着重要的临床意义。本发明基于⑶47-SIRPa在调节吞噬中的重要作用，表达了可溶性的SIRP α胞 外段蛋白，与巨噬细胞上的SIRPa竞争结合白血病细胞上⑶47，从而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
发明内容
本发明的目的，是提供一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，该蛋白可以结合于白血病细胞及白血病干细胞表面，有效地增强巨噬细胞对白血病干细胞的吞曬作用。本发明的技术方案是一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表达标签组成；其中hSIRP α蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含与⑶47结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列编码。 Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnVsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No2 TrxHis-hSIRPa 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
ctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
gvageeelqviqpdks vlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner0No4 :hSIRPa胞外段的核酸序列
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No5 =TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapiIdeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列 atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatc
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图UhSIRPa胞外段蛋白的结构、构建和作用模式 图2、目的基因(hSIRP a )的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳； 图3、表达载体pET32a_hSIRPa的酶切鉴定 图4、TrxHis-hSIRP α融合蛋白表达的SDS-PAGE蛋白电泳 图5、TrxHis-hSIRP α融合蛋白纯化后的电泳图！Western blot定性检测 图6、人U937细胞的诱导分化；
图7、TrxHis-hSIRP α融合蛋白与肿瘤细胞的亲和力检测；
图8、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促进巨噬细胞的吞噬作用。图9、TrxHis-hSIRP α融合蛋白促进巨噬细胞的吞噬作用。
具体实施例方式以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。I、构建表达载体。根据hSIRPa的序列设计引物Pl: 5’_GATATCATGGGAGTGGCGGGTGAGGAG-3’ ；P2: 5’ -GCTCGAGCCGTTCATTAGAT CCAGTGT-3’。以人淋巴结 cDNA 为模板，聚合酶链反应扩增编码hSIRP α胞外段氨基酸的多核苷酸序列(图2)，I. 5%琼脂糖电泳回收后与PMD18-T载体16°C连接2小时，热休克转化大肠杆菌XL10，扩增后将目的片段亚克隆至表达载体pET32a(+)，构建pET32a_hSIRPa (图3)，限制性酶切(图4)、测序鉴定。图UhSIRPa胞外段蛋白的结构、构建和作用模式图。图2、目的基因(hSIRP a )的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，I道(M)是分子量标志(DL2000)，箭头所指为扩增片段。图3、为表达载体pET32a_hSIRPa的酶切鉴定图；(质粒分别用限制性内切酶EcoRV+XhoI及Sac I +Bgl II双酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。M道是marker DL2000)。2、诱导表达融合蛋白。将表达载体pET32a(+)、pET32a_hSIRPa分别以热休克法转化大肠杆菌BL21，涂布含100μ g/ml氨苄青霉素LB平板，37°C培养12小时后随机挑取单克隆接种到含100μ g/ml氨苄青霉素LB液体培养基，220rpm，37°C培养12h，以I %转接到新鲜LB(+)培养基中，220rpm，37°C培养至3h后，加入终浓度I. OmM的IPTG，200rpm，37°C培养5h。6500rpm离心IOmin收集细菌，200 μ I/ml培养基PBS重悬细菌，超声裂菌，加入1% Triton-XlOO，混匀，4°C静置30分钟，4°C离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测发现，TrxHis-hSIRPa蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中(图4)。图4、为TrxHis-hSIRP α融合蛋白表达的蛋白电泳图。将质粒pET32a (+)、pET32a-hSIRP α分别转化大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导融合蛋白的表达。取全细菌裂解物、裂解上清(可溶性组分)和裂解沉淀(即包涵体)分别进行SDS-PAGE分析。1-3为Trx的细菌裂解物、上清和沉淀，4-6为TrxHis-hSIRP α的细菌裂解物、上清和沉淀，M是蛋白分子3、重组蛋白的纯化。pET32a(+)空载体蛋白TrxHis从细菌裂解上清中纯化，TrxHis-hSIRP α以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)纯化包涵体蛋白，所有纯化步骤以ProBondTM纯化手册操作。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，然后用抗His标签抗体进行Western blot,可见在TrxHis-hSIRP α可检测到大小正确的蛋白条带(图5)。图5、为TrxHis-hSIRP α融合蛋白的纯化及Western blot检测。M道是蛋白分子量标志。下图是空载体蛋白及融合蛋白Western blot检测结果,一抗是抗His标签抗体。4、巨噬细胞的诱导分化。将人单核细胞系U937细胞以2X IO5/孔的密度接种于24孔板中，同时加入乙酸肉豆蘧佛波酯(PMA) 160nM诱导3_5天，细胞由圆形悬浮状态变为贴壁弓形虫样改变(图6)。图6、相差显微镜下人单核细胞系U937细胞诱导分化为人巨噬细胞。5、融合蛋白与肿瘤细胞的亲和力检测。将人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞与纯化的TrxHis-hSIRP α蛋白(10 μ g/ml)在37°C条件下共孵育2小时，PBS、Trx蛋白以及hCD47蛋白(专利公开号CN102070719A)作为对照。流式检测poly-Histidine阳性细胞所占的比例。一抗为 poly-Histidine, 二抗为 anti-mouse IgG-FITC (图 7)。图7、为流式细胞术检测TrxHis-hSIRPa蛋白与肿瘤细胞亲和力。6、蛋白功能测定将人U937细胞以2X IO5/孔的密度接种于24孔板中，给予PMA160nM诱导3_5天。之后将DiI标记的Jurkat细胞以2 X IO4/孔的密度添加到预先接种有巨噬细胞的24孔板中，同时添加hSIRP α胞外段蛋白(10 μ g/ml), PBS、Trx蛋白以及h⑶47蛋白作为对照。处理组和对照组分别设三个复孔。蛋白作用2小时后荧光显微镜下计数吞噬有Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，并对结果进行统计学分析。(图8、图 9)
图8、为荧光显微镜下观察对照组与处理组巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬情况，箭头所指为吞噬了 Jurkat细胞的巨噬细胞。图9、为荧光显微镜下计数吞入Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，之后对数据进行统计学分析的结果，Student’ s t检验，*P〈0. 05，** P〈0. 01，有统计学意义。由以上可制备本发明这种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，它是由人SIRPa蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中hSIRPa蛋白胞外段是hSIRPa第26 370位氨基酸。所述的hSIRP α第26 370位氨基酸包含与⑶47结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列编码。Nol TrxHis-hSIRP α 的氨基酸序列
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No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列
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No5 =TrxHis的氨基酸序列
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Nol :TrxHis_hSIRP α的氨基酸序列
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ggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcag caaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggNo5 TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIlfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi0No6 TrxHis 的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc。
权利要求
1.一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是它由人SIRPa蛋白胞外段和融合TrxHis的表达标签组成；其中hSIRP a蛋白胞外段是hSIRP a第26 370位氨基酸。
2.根据权利要求I所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的hSIRP a第26 370位氨基酸包含与CD47结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是Nol，并由No2的核酸序列编码； Nol :TrxHis_hSIRP a的氨基酸序列Msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkyg irgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigvageeelqviqpdksvlvaagetatIrctatslipvgpiqwfrgagpgreIiynqkeghfpr vttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdpIrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswlIvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No2 :TrxHis_hSIRP α 的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagetgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
3.根据权利要求I所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码No3 hSIRPa胞外段的氨基酸序列Gvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfypqrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrddvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsner ； No4 hSIRPa胞外段的核酸序列ggagtggcgggtgaggaggagctgcaggtgattcagcctgacaagtccgtgttggttgcagctggagagacagccactctgcgctgcactgcgacctctctgatccctgtggggcccatccagtggttcagaggagctggaccaggccgggaattaatctacaatcaaaaagaaggccacttcccccgggtaacaactgtttcagacctcacaaagagaaacaacatggacttttccatccgcatcggtaacatcaccccagcagatgccggcacctactactgtgtgaagttccggaaagggagccccgatgacgtggagtttaagtctggagcaggcactgagctgtctgtgcgcgccaaaccctctgcccccgtggtatcgggccctgcggcgagggccacacctcagcacacagtgagcttcacctgcgagtcccacggcttctcacccagagacatcaccctgaaatggttcaaaaatgggaatgagctctcagacttccagaccaacgtggaccccgtaggagagagcgtgtcctacagcatccacagcacagccaaggtggtgctgacccgcgaggacgttcactctcaagtcatctgcgaggtggcccacgtcaccttgcagggggaccctcttcgtgggactgccaacttgtctgagaccatccgagttccacccaccttggaggttactcaacagcccgtgagggcagagaaccaggtgaatgtcacctgccaggtgaggaagttctacccccagagactacagctgacctggttggagaatggaaacgtgtcccggacagaaacggcctcaaccgttacagagaacaaggatggtacctacaactggatgagctggctcctggtgaatgtatctgcccacagggatgatgtgaagctcacctgccaggtggagcatgacgggcagccagcggtcagcaaaagccatgacctgaaggtctcagcccacccgaaggagcagggctcaaataccgccgctgagaacactggatctaatgaacggo
4.根据权利要求2所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码 No5 =TrxHis的氨基酸序列MsdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlIIfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamad ； No6 TrxHis的核酸序列atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatc0
5.根据权利要求I所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa，其特征是所述白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPa在大肠杆菌BL21中实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hSIRP a蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种可溶性蛋白，它是由人CD47受体SIRPα的胞外段，与其氨基末端融合的TrxHis表达标签组成的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hSIRPα，其特征是它由人SIRPα蛋白胞外段和融合TrxHis的表达标签组成；其中hSIRPα蛋白胞外段是hSIRPα第26~370位氨基酸。所述的hSIRPα第26~370位氨基酸包含与CD47结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端。TrxHis-hSIRPα在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可与白血病细胞及LSC上高表达的CD47结合，阻止巨噬细胞上抑制性受体SIRPα与CD47结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及LSC的吞噬作用，对于白血病的靶向治疗以及清除微小残留病变有着重要意义。
文档编号C07K19/00GK102643347SQ20121008722
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者林燕, 梁英民, 江逊, 韩骅 申请人:中国人民解放军第四军医大学