专利名称：抑制白血病干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于抑制白血病干细胞的方法，特别是用于抑制与急性骨髓性白 血病(AML)以及其它血液癌症病症相关联的白血病干细胞从而作为对抗这些血液癌症病 症的有效治疗。
背景技术：
血液癌症病症是例如白血病以及恶性淋巴组织增生性病症类型的癌症，其影响血 液、骨髓以及淋巴系统。白血病可以分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分为急性骨髓 性白血病(AML)和急性淋巴样白血病((ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和 慢性淋巴样白血病(CLL)。其它相关病症包括骨髓增生异常综合症(MDS，以前被称作“白血 病前期”)，其是由骨髓样血细胞的无效生成(或发育异常)以及转化为AML的风险所组合 的多种血液病症的集合。白血病干细胞(LSC)是具有与正常干细胞相关联的特征(即，自我更新的特性以 及形成多谱系的能力)的癌细胞。已经提出此类细胞在血液癌症(例如AML)中作为不同 的群体始终存在。1急性骨髓性白血病(AML)是一种克隆紊乱，其临床表现为增加的异质增殖以及未 分化的骨髓样母细胞。白血病体系是由一小群的LSC维持的，它们具有不同的自我更新的 能力，并且能够分化成白血病前体(progenitor)1。这些前体生成大量的白血病母细胞，这 些母细胞在诊断和复发的患者体内很容易被检测到，最终导致死亡2_4。与快速分裂的克隆 生成的前体3’5’6相比较，AML-LSC通常被报告为静止期的细胞。LSC的这种特性使得靶向增 殖细胞的传统化学疗法的有效性降低，这潜在地解释了当前的经验，即高比例的AML患者 进入完全缓解期，但几乎总是复发，其中小于30%的成人存活超过4年7。此外，微小残留病 (minimal residualdisease)的出现以及欠佳的存活率被归结为在AML患者中在诊断时的 高LSC频率8。所以，对于AML(以及与以上提及的相类似的其它血液癌症病症)的长期治 疗而言必须发展新的治疗方法以便特异性地消除LSC9_14。AML-LSC和正常的造血干细胞(HSC)共有缓慢分裂的、自我更新能力、以及表面标 记物(例如⑶34+⑶38_表型)这些常见特性。然而，除了已改变的其它细胞表面标记物的 表达之外，还已被报道LSC具有增强的自我更新活性，这二者为治疗开发提供了目标。白细 胞介素-3(IL-3)通过与细胞表面受体进行相互作用而介导其作用，所述细胞表面受体由2 个亚基(a亚基(⑶123)以及0共同(0。)链(⑶131))组成。a链与0链的相互作用 形成针对IL-3的高亲和力受体，0。链介导随后的信号转导15’16。已经广泛地报道了⑶123 在AML母细胞、⑶34+白血病前体以及LSC上相对于正常血液细胞的过量表达17_23，并且在 一些研究中已经提议其作为LSC的标记物24’25。⑶131也被报道在AML细胞上21’25表达，但 对于它在AML-LSC上的表达存在着相冲突的报道23’25。⑶123在AML细胞上的过量表达赋予了一系列相对于正常血液细胞的生长优势，其中很大比例的AML母细胞被报道响应于IL-3而在培养物中增殖26_31。此外，⑶123在AML 细胞上的高水平表达与以下各项相关由IL-3刺激的STAT-5激活的水平；循环细胞的比 例；更为原始的细胞的表面表型；以及凋亡抗性。临床上，CD123在AML中的高表达与较低 的存活期、较低的完全缓解速率以及在诊断时较高的母细胞计数相关联19’21’32。与HSC相比，⑶123在LSC上的增加的表达为治疗性靶向AML-LSC提供了机会。单 克隆抗体(MAb)7G3(针对⑶123而产生的)之前已显示抑制IL-3介导的白血病细胞系以 及初级细胞的增殖和激活33。然而，还不清楚靶向⑶123是否可以功能性地损伤AML-LSC， 以及它是否能够抑制它们的骨髓龛(bonemarrow niche)中的归巢、沉积以及增殖。而且， 直接抑制IL-3介导的信号传导相对于抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)在7G3靶 向AML-LSC的能力方面的相对贡献仍然是未解决的。美国专利号6，177，078 (Lopez)披露了抗-IL-3受体a链(IL_3Ra )的单克隆抗 体7G3，以及7G3结合到IL-3R a的N-端结构域(具体地是IL-3R a的氨基酸残基19-49) 上的能力。因此，该专利披露了单克隆抗体(例如7G3)或它的抗体片段(具有针对IL-3Ra 的氨基酸残基19-49的结合特异性)在治疗患者中的由IL-3的过量产生所导致的病症(包 括骨髓样白血病、淋巴瘤以及过敏症)中的用途，这是通过拮抗IL-3的功能来进行的。美国专利号6，733，743 (Jordan)披露了一种损伤血液癌祖细胞的方法，所述祖细 胞表达CD123但不显著表达CD131，所述方法通过将该细胞与抗体和细胞毒剂(选自化学治 疗剂、毒素、或a辐射的放射性同位素)的组合物相接触来进行，由此该组合物以有效引起 细胞死亡的量选择性地结合到⑶123上。血液癌症可以是白血病或恶性淋巴组织增生性紊 乱例如淋巴瘤。在产生本发明的工作中，本发明人测试了 MAb 7G3在AML-LSC与HSC之间开发 ⑶123表达和功能方面的明显差异的能力。MAb 7G3抑制IL-3信号传导通路以及初级AML 细胞的增殖。而且，MAb 7G3显著降低非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(N0D/SCID)异 种移植模型中AML母细胞的归巢和移入(engraftment)，并且LSC的功能受到抑制。
发明内容
一方面，本发明提供了一种用于抑制表达IL-3Rci (⑶123)的白血病干细胞 的方法，该方法包括将所述细胞与抗原结合分子相接触，该抗原结合分子包括Fc区或 经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到 IL-3Ra (CD123)上。本发明还提供了用于治疗一位患者中的血液癌症病症的方法，该方法包括对该患 者给予有效量的抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应 子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。另一方面，本发明还提供了抗原结合分子在抑制表达IL-3Ra (⑶123)的白血病 干细胞中的用途或在制备用于抑制表达IL-3Rci (CD123)的白血病干细胞的药物中的用 途，所述抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述 抗原结合分子选择性结合到IL-3Rci (⑶123)上。在这个方面，本发明还提供了抗原结合分子在治疗患者中的血液癌症病症或 在制备用于治疗患者中的血液癌症病症的药物中的用途，所述抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性结合到 IL-3Ra (CD123)上。本发明还提供了用于抑制表达IL-3Rci (⑶123)的白血病干细胞的试剂，该试剂 包括抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc 区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。在这个方面，本发明还提供了用于治疗患者中的血液癌症病症的试剂，该试剂包 括抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc 区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。
图1显示了 MAb 7G3抑制IL-3刺激的⑶131磷酸化以及初级AML细胞的增殖。 (a)将来自两位单独的患者的初级AMI细胞用图中所示浓度的抗体在冰上孵育30分钟。不 洗涤，用IL-3(lnM，在37°C下持续10分钟)刺激细胞。刺激之后立即将细胞裂解。对裂解 物进行SDS-PAGE，并且用MAb 4G10进行免疫印迹，接着剥去印迹并且将MAb 1C1作为上样 对照物进行再次探测。(b-e)通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到TCA不溶性材料中来测定初 级AML细胞的增殖。(b-d)在不存在(A，虚线)或存在细胞因子的情况下，用滴定的MAb 7G3将从3位单独的AML患者中新鲜分离的单核细胞孵育48小时lng/mL的IL-3 ( ，点 线)或0. Ing/mL的GM-CSF (■，实线)。数据点显示重复三次的点的平均值士 s.e.m.。(e) 在不存在或存在IL-3 (Ing/mL)的情况下，对来自35位患有AML的患者的解冻细胞分析MAb 7G3(lug/mL)对增殖的抑制。在所测试的35位患者中有32位显示了抑制。在这些患者中 有9位的增殖水平降到低于不存在IL-3的情况(组成型增殖)。使用3H-胸腺嘧啶核苷掺 入以及液体闪烁计数来对增殖进行定量。图2显示了⑶123中和在N0D/SCID小鼠中抑制初级AML细胞的归巢和移入。在 体外暴露于7G3(灰色柱)或IgG2a(黑色柱)(10i!g/mL，2h)之后，来自10位患者的初级 AML细胞的移入(a)、或来自5位个体的正常骨髓(NBM)或脐带血(CB)的移入(b)。在将抗 体处理的细胞移植到亚致命照射的N0D/SCID小鼠中之后，在4-8 (a)或4_11 (b)周进行挑 选，并且用流式细胞术估计股骨骨髓中人类CD45+细胞的比例。对于每个样品，每个处理组 使用3-10只小鼠。AML-8和AML-8-rel对应于从同一个患者中分别在诊断和复发时收集 到的白血病细胞。NBM-4和CB-1起源于汇集的样品。(c)移植了经IgG2a(n = 10，实线) 或7G3(n= 10，点线)体外处理的AML-9细胞的小鼠卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)无事件 (event-free)存活曲线。(d)移植后24小时评估的经IgG2a(黑色柱)、7G3(灰色柱)体 外处理的AML-8-rel或AML-9细胞归巢到骨髓和脾脏的效率。(e)在静脉输注(IV)或股 骨内注射(IF)之后，在移植了经IgG2a(白色柱)或7G3(黑色柱)体外处理的细胞的小鼠 中AML-8-rel细胞的移入水平。对于IF移植的小鼠，显示了移植AML细胞的右股骨(RF) 中、以及在未移植的骨(WBM)中的移入水平。对于(d)和(e)，每个处理组使用4-5只小鼠。 在移植后5周处死小鼠。数值代表平均值士 s.e.m.。对照IgG2a与经治疗的小鼠之间的 显著性差异指示如下*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01 ;_，P彡0. 0001。(f)注射了体外7G3 处理的白血病细胞的N0D/SCID小鼠的BM和脾脏中归巢的⑶34+38_AML细胞的绝对数。对 于AML-8，N =每组2-3只小鼠；而对于AML-9，n =每组5只小鼠。数值代表平均值士 SEM。
6(g)体外治疗后分选的CD34+CD38_AML-9细胞归巢到小鼠的BM和脾脏的效率。每个处理组 N = 3只小鼠。图3显示了将7G3给予N0D/SCID小鼠减少了 AML的移入。(a)在照射的N0D/SCID 小鼠的股骨骨髓中AML-1细胞的移入水平，小鼠在移植前6小时接受了单一剂量的IgG2a 对照或7G3(300i!g)。在移植后5周挑选小鼠。(b)在经IgG2a(黑色柱)或7G3(灰色柱) 处理的N0D/SCID小鼠中AML-1、2、和3的移入。在移植后24小时开始处理，每剂量300 u g， 每隔一天给药，共4个剂量。在移植后5周挑选小鼠。(c)CD123在骨髓衍生的细胞上的表 达，以及(d)将AML-1细胞接种到小鼠中，然后在移植后4天开始IgG2a或7G3处理(共12 次注射，每周给药3次)在外周血和脾脏中的移入水平。在移植后5周挑选小鼠。(e)当移 植后28天开始IgG2a (点线)或7G3(实线)处理，并且连续每周3次直至处死时在骨髓中 AML-2细胞的移入水平。每个处理组使用3-10只小鼠。数值代表平均值士s. e. m. (f)在以 4个剂量的7G3或IgG2a对照(300 u g/剂量)从移植后第28天开始一周给药3次之后， 在N0D/SCID小鼠的BM中人类AML-1细胞的百分数。每一个单独的符号代表从一个单个的 小鼠获得的数值。IgG2a对照与7G3处理的小鼠之间的显著性差异指示如下*，P < 0. 05 ； 氺氺，P < 0. 005。图4部分I显示了将7G3和Ara-C给予具有确定的AML疾病的小鼠阻断了次级受 体小鼠(secondary recipient mice)的 LSC 再生。(a)在经 Ara_C 联合 IgG2a 或 7G3 治疗 的初级小鼠的骨髓和脾脏中AML-10细胞的移入水平，如在示意图中所示，(b)归巢到骨髓 和脾脏的效率，(c)移入水平，以及(d)在次级移入物中CD34+38_细胞的比例，从在(a)中处 理的小鼠的骨髓中收集并移植到次级受体小鼠中的白血病细胞中的比例。水平柱指示平均 值。IgG2a加Ara-C对照组与7G3加Ara_C处理组之间的显著性差异指示如下*，P < 0. 05 和 **P < 0. 01。部分II显示了(A)在7G3或对照IgG2a处理10周后BM和脾脏中AML-10细胞的 移入水平。移植后第28天开始抗体处理，每只小鼠300 u g，每周三次，如在示意性概述中 所示。(B-D)归巢效率(B)、BM和脾脏中移入的水平(C)、以及在次级受体小鼠的BMW中 CD34+CD38—细胞的百分数。在移植后12周对C和D中的小鼠进行分析。每个符号代表一只 单一的小鼠，水平柱代表平均值。*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01在对照IgG2a与7G3组之间。部分III显示了(A)在7G3或对照IgG2a处理10周后BM和脾脏中AML-9细胞的 移入水平。在移植后第28天开始抗体处理，每只小鼠300 y g，每周三次，如在示意性概述中 所示。(B)次级受体小鼠的BM中移入的水平。在移植后8周对次级小鼠进行分析。每个符 号代表一个单以的小鼠，水平柱指示平均值。**，P < 0. 01，在对照IgG2a与7G3组之间。图5显示自然杀伤(NK)淋巴细胞导致7G3-介导的AML移入的抑制。(a)移入的水 平，以及(b)经IgG2a(白色柱)或7G3(黑色柱)(10i!g/mL，2h)体外处理并且移植入NOD/ SCID小鼠中、没有(-)或具有(+)先前⑶122+NK细胞消耗的AML-8-rel细胞的归巢效率。 每个处理组使用4只小鼠。数值代表平均值士s.e.m.。显著性差异指示如下P*< 0.05 以及 **P < 0. 01。图6显示MAb 7G3 (而非6H6或9F5)在IL-3依赖的细胞系和AML细胞中抑制由 IL-3刺激的CD131 ( 3 c)、STAT-5、以及Akt的磷酸化。(a)将TF-1细胞用不同浓度的7G3、 9F5或6H6在冰上孵育30分钟。不洗涤，用IL_3 (InM,在37°C下持续10分钟)刺激细胞。刺激后立即将细胞裂解，并且如在这些方法的说明将⑶131免疫沉淀。用SDS-PAGE将免疫 沉淀物分离，并且用抗体将其免疫印迹到磷酸化的酪氨酸残基(4G10)、磷酸化的STAT-5或 磷酸化的Akt上。剥去印迹，并且用针对0。(1C1)的抗体作为上样对照物将其进行再次探 测。(b)通过TF-1和M07e细胞系、以及初级AML-9细胞的细胞内FACS染色也证实7G3抑 制由IL-3诱导的STAT-5的激活。模拟处理(Mock treatment)(点线)，单独用IL-3 (10ng/ mL 2h，实线)，IL-3 加 7G3 (10ng/mL,虚线)。图7显示了⑶123在⑶34+/⑶3K细胞上的表达强度与7G3在N0D/SCID小鼠中抑 制移入的能力负相关。Y轴代表对于每位患者或供者的样品而言⑶123在⑶347⑶38_部 分上的表达的RFI的对数。X轴绘制了对于每位单独的患者或供者的样品而言以IgG2a对 照作为100%进行％标准化的、7G3体外处理组的移入水平的对数。每个点代表一个单独的 实验，该实验反映了每个处理组3-10只小鼠的平均值，并且使用不同的AML患者(实心符 号)或正常BM样品(空心符号)进行的每个实验。在移入后4-6周后分析全部小鼠。每 个移入数据点都是基于从3至10只小鼠的测量值，如在图2a中所示。图8显示了以AML细胞作为靶细胞，⑶107a在NK细胞中的表达。在37 °C以 1 1的比例(A和B)将来自正常健康供体的外周血单核细胞(PBMC)与初级人类AML细 胞(RMH003)、或用 IgGl 对照(10 u g/mL) (A 和 C)或用 CSL360 (10 u g/mL) (B 和 D)孵育 3 小 时。为了评估CD107a的非特异性表达，用抗体和非靶细胞孵育PBMC(1 0) (C和D)。图9显示了从图8中描绘的实验中得到的数据的直方图，并且如所示还包括其中 不加入抗体的样品。图10显示了在接种到N0D/SCID小鼠之前经10ii g/mL IgG2a、完整7G3、6H6或9F5 抗体以及7G3 (7G3Fab)和6H6 (6H6Fab)的F(ab，)2片段体外处理的AML_8_rel样品的归巢 效率。在16小时后测量人类单核细胞归巢到骨髓的效率。对于每个样品，每个处理组使用 3只小鼠。图11显示了在体外暴露于10 ii g/mL IgG2a、完整7G3或9F5抗体以及 7G3 (7G3Fab)和9F5 (9F5Fab)的F(ab，)2片段之后，来自两位患者的初级AML细胞(AML-9 和AML10)在亚致死照射的N0D/SCID小鼠中的移入。接种后4周评估AML的移入，作为通 过流式细胞术所评估的股骨骨髓中人类CD45+细胞的比例。对于每个样品，每个处理组使 用5只小鼠。图12显示了嵌合的CSL360、人类CSL360、及其Fc变体的ADCC活性的对较。将钙 黄绿素(calceirOAM标记的CTLEN细胞与不同的抗体以及从正常人类供体中新鲜分离的 PBMC进行孵育。PBMC与CTLEN细胞的比例为100 1。将细胞在37°C在具有5% C02的培 养箱中孵育4小时。孵育期之后，将细胞离心并且将100 yL上清液转移到新鲜的板中。使 用Wallac酶标仪对上清液中的荧光进行测量(激发滤光片485nm，发射滤光片535nm)。使 用的抗体是嵌合的CSL360 (空心柱)，人源化的CSL360 (实心柱)，具有两个氨基酸改变的 人源化CSL360 (对角线)、或具有三个氨基酸改变的人源化CSL360 (点)。将人类IgGl (水 平线)和没有抗体的孔(垂直线)包括进来作为对照。图13显示了(a)结合到FcR上的hCSL360及其三个变体的Biacore分析。在偶联 了 CD123 的 BIAcore CM5 芯片上逐个捕获huCSL 360及其三个变体。huFc y RI、huFc y Rllb/ c以及huFcyRIIIa以0. 4nM至800nM范围内的浓度在对应的表面上流动，并且将这些信号用来确定KA。亲和力报告为超过hCSL360的增加倍数，对hCSL360赋予相对值1。(b) KA 值表达为对于这四种抗体中每一种的huFc y RHIa与huFc y Rllb/c的A/I比例。图14显示了在钙黄绿素释放测定中将正常的PBMC用作效应子细胞所检测到的 ADCC介导的Raji-⑶123阳性细胞的裂解。⑶123分子在Raji-⑶123低和高表达子上表达 的大致的数量分别是4，815和24，432。(a)在E T = 25 1，ADCC介导的Raji_CD123的 裂解低(b)在 E T = 50 1，ADCC 介导的 Raji-CD123 的裂解低(c)在 E T = 25 1， ADCC 介导的 Raji-CD123 的裂解高(d)在 E T = 50 1，ADCC 介导的 Raji_CD123 的裂 解高。实心三角代表hCSL360Fc3、圆圈代表hCSL360kif、实心圆圈代表CSL360、方块代表 hCSL360、星形代表没有抗体。图15显示了 CSL360及其变体的增强的ADCC活性，其中TF_1细胞作为靶细胞。 使用LDH检验来测定抗体的ADCC活性。(a)实心三角代表hCSL360Fc3、实心正方代表 hCSL360Fc2、空心圆圈代表hCSL360kif、实心圆圈代表CSL360、而星形代表没有抗体。(b) 实心三角代表168-26Fc3、实心方块代表168-26Fc2、实心圆圈代表168-26、而星形代表没 有抗体。图16显示了 CSL360及其变体的增强的ADCC活性，其中初级人类白血病细胞作为 靶细胞，(a)RMH003AML, (b) RMH011AML, (c) RMH010AML, (d) RMH008AML, (e)WMH007AML, (f) RMH009B-ALL, (g) RMH007B-ALL。使用 LDH 检验来确定 ADCC 的活性。图17显示了具有预先移入的ALL的小鼠对于对照Mab (鼠IgG2a)、7G3、168-26以 及168-26Fc3的体内灵敏度，该灵敏度被描述为从白血病移植的当天开始对于无事件生存 (EFS)的卡普兰-迈耶曲线。事件定义为在外周血中25% h⑶45+负荷。每组中动物的数 目分别是7，6，6以及7。白血病生长延迟(LGD)定义为基于中位数EFS的比较，处理组比对 照MAb组多存活的天数，对于7G3、168-26以及168_26Fc3分别是2. 9 (P = 0. 54)、6. 4 (P = 0. 13)以及 12. 2 (P = 0. 044)天。
具体实施例方式一方面，本发明提供了用于抑制表达IL-3Rci (⑶123)的白血病干细胞的方法，该 方法包括将所述细胞与抗原结合分子相接触，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有 增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (CD123)上。在这个方面，本发明还提供了用于治疗患者中的血液癌症的方法，该方法包括对 该患者给予有效量的抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc 效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。优选地，患者是人类。抗原结合分子优选地是单克隆抗体或抗体片段，其包括Fc区或经修饰的具有增 强的Fc效应子功能的Fc区。抗体提供了体液免疫系统与细胞免疫系统之间的连接，其中IgG是最大量的血清 免疫球蛋白。当抗体的Fab区识别抗原时，该Fc部分结合到Fc y受体(Fc y R)上，这些受 体由所有免疫辅助细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞、单核吞噬细胞或树突细 胞)差异性表达。这种结合在这些细胞上交叉连接FcR，并且结果它们被激活。这些细胞的激活有几个结果；例如，NK细胞杀死癌细胞，并且还释放能够抑制细胞增殖以及与肿瘤相 关的血管新生的细胞因子和趋化因子，并且通过增加的主要组织相容性抗原(MHC)抗原的 细胞表面表达来增加肿瘤的免疫原性。一旦受体与多价抗原/抗体复合物交联，效应子细 胞去粒以及编码细胞因子的基因的转录激活被触发，然后靶细胞溶解或吞噬。抗体Fc区介导的效应子功能可以分成两类(1)在抗体结合到抗原之后运行的效 应子功能(这些功能涉及例如，补体级联或带有Fc受体(FcR)的细胞的参与)；以及(2)独 立于抗原结合而运行的效应子功能(这些功能赋予例如，在循环中的持久性以及通过转胞 吞作用被转移通过细胞屏障的能力)。例如，补体的Cl组分与抗体的结合激活补体系统。 补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解方面是重要的。补体的激活也刺激炎症应答， 并且还可涉及自身免疫超敏反应。此外，抗体经由Fc区结合到细胞上，其中在该抗体Fc区 上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)上。抗体结合到细胞表面的Fc受体 上触发了许多重要的并且多样的生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞没和破坏、免疫复合 物的清除、抗体包被的靶细胞被杀伤细胞裂解(称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，或 ADCC)、炎症调节子的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白生产的控制。本发明人已经显示在抗体结合分子中Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能 的Fc区的存在对于表达CD123的白血病干细胞的抑制是重要的，并且因此在治疗与白血病 干细胞相关联的血液癌症病症中是重要的。与白血病干细胞(LSC)相关联的、可以根据本发明进行治疗的血液癌症病症包括 白血病(例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病，急性淋巴样白血病，慢性淋巴样白 血病、以及骨髓增生异常综合症)以及恶性淋巴组织增生性病症，包括淋巴瘤(例如，多发 性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小细胞和大细胞滤泡淋巴瘤)。本文所使用的术语“抗原结合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体(例 如，嵌合的、人源化的或人类的单克隆抗体)、或者是指免疫球蛋白的抗原结合的和/或包 括可变结构域的片段，其与完整免疫球蛋白竞争特异性结合到免疫球蛋白的结合伴侣(例 如，宿主细胞蛋白)上。不论结构如何，抗原结合片段与被完整的免疫球蛋白所识别的相 同的抗原相结合。抗原结合片段可以合成产生或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割 而产生，或者它们可以通过重组DNA技术进行遗传上的工程化处理。生产抗原结合分子 及其片段的方法在本领域中是熟知的，并且见以下描述，例如，Antibodies =A Laboratory Manual, Edited by Ε. Harlow andD, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,通过弓|用并入本文。提及白血病干细胞时，本文所使用的术语“抑制”包括LSC的功能性或活性(包括 生长或增殖以及存活活性)的任何减少，尤其是LSC存活、增殖和/或分化成白血病或其它 恶性过度增生性血液癌细胞的前体的能力方面的任何减少或限制。提及结合分子(例如抗体)及其结合伴侣(例如抗原)的相互作用时，本文使用 的术语“选择性结合”是指该相互作用依赖于特定结构(例如，在结合伴侣上的抗原决定簇 或表位)的存在。换言之，抗体优先地结合或识别结合伴侣，甚至当结合伴侣存在于其它分 子或生物体的混合物中时。术语“有效量”是指对于治疗血液癌症病症有效的如本文所定义的结合分子的数量。
术语“治疗”是指治疗性治疗连同预防性或防止性措施以治愈或停止或至少延缓 病症的进程。需要治疗的包括已经遭受血液癌症病症折磨的连同有待在体内防止这种病症 的。部分地或完全从病症中恢复的受试者也可能需要治疗。防止涵盖了抑制或降低与血液 癌症病症相关联的一种或多种症状中的起始、发展或进程。在本发明的方法中，对患者给予化学治疗剂可以与给予抗原结合分子相联合，其 中给予化学治疗剂是在给予抗原结合分子之前、同时、或之后。优选地，化学治疗剂是细胞毒剂，例如选自下列的细胞毒剂(a)芥子气衍生物氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、以及异环磷酰胺(b)乙撑亚胺噻替派以及六甲三聚氰胺(Hexamethylmelamine)(c)烷基磺酸盐白消安(d)胼类以及三嗪六甲蜜胺(Althretamine)、丙卡巴胼、达卡巴嗪以及替莫唑胺(e)亚硝基脲类(Nitrosureas)卡莫司汀、洛莫司汀以及链佐星(f)金属盐卡钼、顺钼以及奥沙利钼(g)长春花生物碱长春新碱、长春碱以及长春瑞宾(h)紫杉烷紫杉醇以及多西他赛⑴鬼臼毒素依托泊苷以及替尼泊苷(Tenisopide)(j)喜树碱(Camptothecan)类似物伊立替康以及托泊替康(k)蒽环类阿霉素、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌以及伊达比星(1)色霉素更生霉素以及普卡霉素(m)各种抗肿瘤抗生素丝裂霉素以及博来霉素(η)叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(ο)嘧啶拮抗剂5_氟尿嘧啶、氟尿苷(Foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他滨、以及吉 西他滨(ρ)嘌呤拮抗剂类6_巯基嘌呤以及6-硫鸟嘌呤(q)腺苷脱氨酶抑制类克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨以及喷司他丁(r)拓扑异构酶I抑制剂伊立替康(Ironotecan)以及托泊替康(s)拓扑异构酶II抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(t)核糖核苷酸还原酶抑制剂羟基脲(u)肾上腺皮质类固醇抑制剂米托坦(V)酶天门冬酰胺酶以及培门冬酶(w)抗微管剂雌莫司汀(χ)类视黄醇贝沙罗汀、异维甲酸以及维甲酸(ATRA)。化学治疗剂的其它例子包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克 罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；阿那曲唑； 蒽环类；安曲霉素；曲林菌素；阿扎胞苷(Vidaza)；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替 派；比卡鲁胺；盐酸比生群；甲磺酸双奈法德；二膦酸盐类(例如，帕米膦酸盐(Aredria)、 氯磷酸钠(sodium clondronate) (Bonefos)、唑来膦酸(Zometa)、阿仑磷酸盐(Fosamax)、 依替膦酸盐、伊班膦酸盐、斯孟膦酸盐(cimadronate)、利塞膦酸盐以及替鲁膦酸盐 (tiludromate))；比折来新；布喹那钠；溴匹立明；放线菌素c ；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡莫司汀(carrnustine)；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；西罗霉素；甲磺酸克立 那托；地西他滨(Dacogen)；脱甲基试剂；右奥马钼；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌； 屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；EphA2 抑制剂；依沙芦星；恩洛钼；恩普氨酯；依匹哌啶；厄布洛唑；盐酸依索比星；依他硝唑；氯 苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；组 蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC-I)；伊莫福新；甲磺酸伊马替尼(Gleevec，Glivec)；异丙 钼；醋酸兰瑞肽；来那度胺(Revlimid)；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠； 洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美诺立尔；氯 苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；米托马星；米 托司培；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马钼；奥昔舒仑；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛 霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；拨 尼莫司汀；嘌罗霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋林；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈 (saflngol hydrochloride)；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋 锗；螺莫司汀；螺钼；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替 洛蒽醌；替莫泊芬；替罗昔隆；睾内脂；硫咪嘌呤；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬； 醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑； 尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸 长春甘酯；硫酸长春罗辛；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼钼；净司他丁 ；盐酸 佐柔比星；20-表-1，25 二基羟维生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基夫 文(acylfulvene)；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司 汀；偕胺肟；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管新 生抑制剂；拮抗剂D ；拮抗剂G ；安雷利克斯；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素药；抗瘤酮；反 义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸盐(aphidicolin glycinate)；凋亡基因调整基因；凋亡调 节剂；脱嘌呤核酸；阿糖-CDP-D L-PTBA (ara-CDP-D L-PTBA)；安素拉可林(asulacrine)； 阿他美坦；阿莫司汀；海洋环肽1 (axinastatin 1)；海洋环肽2 ；海洋环肽3 ；阿扎司琼；阿 扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；Balanol ；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并 二氢卟酚类；苯甲酰星孢素；β内酰胺衍生物；β阿爱力新(beta-alethine) ； β克拉霉 素B (beta clamycin B)；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈 法德；二枸橼酸环己噻卓酯A(bistratene Α)；比折来新；布雷菲德(breflate)；溴匹立明； 布度钛；丁胱亚磺酰亚胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C(calph0Stin C)；喜树碱衍生物；金丝雀 痘IL-2 ；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3 ；CARN 700 ；软骨衍生的抑制剂；卡折 来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；天蚕素B ；西曲瑞克；二氢卟酚类(chlorlns)； 氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；氯米芬类似物；克霉唑；柯林斯霉菌素A ；柯林斯 霉菌B ；考布他汀A4 ；考布他汀类似物；conagenin ；crambescidin 816 ；克立那托；念珠藻 环肽8 ；念珠藻环肽A衍生物；氯化琥珀胆碱A ；环戊蒽醌；cycloplatam ；cypemycin ；溶细 胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B ；地洛瑞林；地塞米松；右异 环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B ；3，4- 二羟筌苯并氧肟酸(didox)； 二乙基去甲精胺(diethylnorspermine) ；二氢_5_氮杂胞嘧啶核苷；二氢紫杉酚，二草霉 素(dioxamycin)；联苯螺莫司汀；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡比星SAWuocarmycin SA)；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟 氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依 他硝唑；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维a胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡多；氟卓斯 tT ；氣海星Sl (fluasterone)；盐酸氣柔红比星(fluorodaunorunicin hydrochloride)； 福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；钆替沙林；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶 抑制剂；谷胱甘肽抑制剂；HMG辅酶A还原酶抑制剂(例如，阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐 他汀、来适可、lupitor、洛伐他汀、罗苏伐他汀、以及辛伐他汀)；h印sulfam^eregulin ； 六甲撑二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪 唑并吖啶酮类；咪喹莫特；胰岛素样生长激素-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素类； 白细胞介素类；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯醇，4-伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole ；异高 软海绵B ；伊他司琼；jasplakinolide ；海蛞蝓提取物F ；三乙酸层状素-Ndamellarin-N triacetate)；兰瑞肽；Ieinamycin ；来格司亭；硫酸香菇多糖；1印tolstatin ；来曲唑；亮 丙立德和雌激素、以及黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；LFA-3TIP(Bi0gen，Cambridge, MA ；国 际申请号WO 93/0686和美国专利号6，162，432)；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖 肽；亲脂性钼化合物；lissoclinamide 7 ；洛钼；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽 醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；替沙林镥；利索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美坦新； 甘露糖他汀AOiiarmostatin A)；马立马司他；马索罗酚；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋 白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙；美替瑞林；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新； 米立司亭；错配的双链RNA ；丙米腙；二溴卫矛醇；米托萘胺；促分裂原毒素成纤维细胞生 长因子-皂草毒蛋白；莫法罗汀；莫拉司亭；单磷酰脂质A+分支杆菌(myobacterium)细胞 壁sk ；莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂；基于多重肿瘤抑制基因1的治疗；芥子抗癌剂； 印度海绵BOnycaperoxideB)；分支杆菌细胞壁提取物；myriaporone ；N-乙酰基地那林； N-取代的苯酰胺类；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；萘脲烷亚胺(napavin)；萘 萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达钼；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；碘代琥珀酰 亚胺阿霉素(nisamycin)；氧化亚氮调控剂；氮氧自由基抗氧化剂；nitrullyn ；06-苄基鸟 嘌呤；奥曲肽；okicenone ；寡核苷酸；奥那司酮；oracin ； 口服的细胞因子诱导物；奥马钼； 奥沙特隆；oxaunomycin ；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；钯胺(palauamine)；棕榈 酰根霉素；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀；培得星； 戊聚硫钠；pentrozole ；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇(perillyl alcohol)；苯阿齐诺霉素 (phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶血链球菌素；pilocaine hydrochloride ； 吡柔比星；卩比曲克辛；placetinA ；placetin B ；钼络合物；钼化合物；钼-三胺络合物； porfimer sodium ；泊非霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2 ；蛋白酶体抑制剂；基于 蛋白质A的免疫调节物；蛋白激酶C抑制剂，微藻的；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷 磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮 抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去 甲基化的瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186 (rhenium Re 186 etidronate)；根霉素；RII维胺 酯(RII retinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone Bl ；ruboxyl ；沙芬戈；saintopin ；SarCNU ；肌肉叶绿醇 A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1 ；正义寡核苷酸；信号传导抑制剂；信号转导调控
13剂；Y分泌酶抑制剂，西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol ；索纳明；膦门冬酸； spicamycin D ；螺莫司汀；脾脏五肽(splenopentin)；海绵素1 ；角鲨胺；干细胞抑制剂；干 细胞分裂抑制剂；stipiamide ；间充质溶解素抑制剂；sulfinosine ；强效血管活性肠肽拮 抗剂；suradista ；苏拉灭；苦马豆素；合成的葡萄糖胺聚糖；他莫司汀；亚叶酸；他莫昔芬 甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium ；端粒末端转移 酶抑制剂；替莫泊芬；tetrachlorodecaoxide ；tetrazomine ；菌体胚素；噻可拉林；血小板 生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；乙基锡初紫 红素；替拉扎明；二茂钛二氯化物；topsentin ；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂； 三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂； tyrphostins ；UBC抑制剂；乌苯美司；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽^ariolin B ；载体系统， 红细胞基因治疗；沙利度胺；维拉雷琐；藜芦胺；verdins ；维替泊芬；vinxaltine ；伏氯唑； 扎诺特隆；折尼钼；亚苄维C(2H)；以及净司他丁斯酯。根据本发明，抗原结合分子(包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的 Fc区)优选通过非肠道给药途径施给予患者。非肠道给药包括不通过消化道(即，不是肠 道)的任何给药途径，包括通过注射、输注以及类似方式进行给药。通过注射给药包括，例 如通过进入到静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌内)以及皮肤以下(皮下)的方 式。抗原结合分子还可以作为储库或缓慢释放的制剂进行给药，以足以获得所希望的药理 学效果的剂量通过例如皮下、皮内、或肌内进行给药。在本发明的一个具体实施方式
中，抗原结合分子包括经修饰的Fc区，更特别地是 Fc区，该Fc区已经被修饰为提供增强的效应子功能，例如对Fc受体的增强的亲和力、抗体 依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体依赖的细胞毒性(CDC)。对于IgG类的抗体，这些效应子 功能由Fc区与被称为Fc γ受体(Fe y R)(在多种免疫细胞上表达)的受体家族的接合进 行控制。Fc/Fc γ R复合物的形成将这些细胞招募到结合的抗原的位置上，通常产生信号传 导以及随后的免疫应答。用于优化这些Fc γ R对该抗体Fc区的亲和力以增强效应子功能 (特别是改变相对于“母体”Fc区的ADCC和/或CDC活性)的方法对于本领域技术人员而 言是熟知的。仅作为例子，用于优化Fc区的结合亲和力的程序由Niwa等人34、Lazar等人 35、Shields等人36以及Desjarlais等人37描述。这些方法可以包括抗体Fc区的修饰以增 强它与相关的Fc受体的相互作用并且增加它促进抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC) 以及抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)34的潜力。也已经描述了在共价结合到Fc区 中的保守Asn297上的IgGl抗体上的寡聚糖修饰之后ADCC活性的增强35’36。其它方法包括使 用固有地产生具有增强的Fc效应子功能的抗体的细胞系(例如，鸭胚胎衍生的干细胞用于 产生病毒疫苗，W0/2008/129058 ；在禽的EBX 细胞中产生的重组蛋白，W0/2008/142124)。 用于增强CDC活性的方法可以包括同种型嵌合现象，其中IgG3亚类的一部分被引入到IgGl 亚类的相应的区中(例如，重组抗体组合物，US2007148165)。另一方面，本发明还提供了抗原结合分子在抑制表达IL-3RCI (⑶123)的白血病 干细胞中的用途或在制备用于抑制表达IL-3Rci (CD123)的白血病干细胞的药物中的用 途，所述抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述 抗原结合分子选择性结合到IL-3Rci (⑶123)上。在这个方面，本发明还提供了抗原结合分子在治疗患者中的血液癌症病症或在制备用于治疗患者中的血液癌症病症的药物中的用途，所述抗原结合分子包括Fc区 或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性结合到 IL-3Ra (CD123)上。另一方面，本发明还提供了用于抑制表达IL-3Rci (⑶123)的白血病干细胞的试 剂，该试剂包括抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子 功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。在这个方面，本发明还提供了用于治疗患者中的血液癌症病症的试剂，该试剂包 括抗原结合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc 区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Ra (⑶123)上。本发明的这个方面的试剂可以是药物组合物，其包含抗原结合分子连同一种或多 种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。适合非肠道给药的组合物方便地包括活性组分的无菌水性制剂，优选地与接受者 的血液等渗。这种水性制剂可根据已知的方法使用适宜的分散剂或润湿剂以及助悬剂进行 配制。这种无菌可注射的制剂也可以是处于无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌 可注射的溶液或混悬液，例如作为处于聚乙二醇和乳酸中的溶液。可被采用的可接受的运 载体(vehicle)和溶剂有水、林格氏溶液、适宜的碳水化合物(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻 糖、葡萄糖)、以及等渗的氯化钠溶液。此外，方便地采用无菌的、非挥发油类作为溶剂或悬 浮介质。出于这一目的，可采用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此 外，脂肪酸(如油酸)可用于制备可注射物。此类治疗组合物的制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。适宜的药学上可 接受的载体和/或稀释剂包括任何以及所有的常规溶剂、分散介质、填充剂，固体载体，水 性溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、以及类似物。此类介质和试剂针 对药物活性物质的用途在本领域内是熟知的，并且在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA 中进行了描述。 除了其中与该活性成分不相容的任何常规的介质或试剂之外，还考虑了它在本发明的药物 组合物中的使用。还可以将补充的活性成分加入组合物中。贯穿本说明书及其随附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和 或变化(如“包括(comprise) ”和“包括(comprising) ”应当被理解成包含提及的整体或 步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。本说明书中提及任何在先公开文件(或从其中所获得的信息)、或者提及任何已 知事物，不是并且不应该被当成是承认或准许或任何形式的建议，即该在先公开文件(或 从其中获得的信息)或已知的事物形成本说明书所涉及的研究领域内公知的一般知识的 一部分。本发明通过下面非限制性的实施例进一步说明实施例1该实例证实了 MAb 7G3在在AML-LSC与HSC之间区分⑶123表达和功能方面的明 显差异的能力。MAb 7G3抑制IL-3信号传导通路以及初级AML细胞的增殖。此外，MAb 7G3 明显降低N0D/SCID异种移植模型中AML母细胞的归巢和移入，并且LSC功能受到了抑制。方法
AML患者的样品、正常的造血细胞、以及细胞系单采血液成分术(apheresis)的产品、骨髓或外周血样品获自新诊断的以及复发 的患有AML的患者。根据公共机构的指导方针在知情同意之后收集患者的样品，并且由 Royal Adelaide Hospital Human Ethics Committee、Melbourne HealthHuman Research Ethics Committee、Research Ethics Board of the University HealthNetwork、以及 the South Eastern Sydney & Illawarra Area Health Service HumanResearch Ethics Committee批准进行研究。使用细胞形态学、细胞遗传学、白细胞抗原表达进行诊断，并且 根据法美英分类法(French-American-British (FAB) classification)进行评估。通过淋 巴细胞分离剂(Lymphopr印)或菲可(Ficoll)密度梯度分离来富集单核细胞并将其冷冻 于液氮中。人类脐带血和BM细胞分别获自足月分娩或接受髋置换手术的知情患者或从 Cambrex(US)商购得到，并且如之前所说明38进行处理。增殖检验如之前所说明39，使用[3H]-胸腺嘧啶核苷检验来测量AML细胞对IL_3或GM-CSF 的生长应答。简言之，在37°C在5% CO2中，在200μ1 IMDM+10 %热灭活的胎牛血清 (HI-FCS) (Hyclone, Utah)中，在 0. OOl-IOnM 7G3 或同种型匹配的对照 BM4(IgG2a)存在 的情况下，用IL-3 (InM)或GM-CSF(0. InM)将96孔板中的2xl04个单核细胞/孔刺激48 小时，其中在培养的最后6小时加入0.5 μ Ci的3H-胸腺嘧啶核苷(MP Biomedicals, NSW， Australia) ο 使用 Packard Filtermate 细胞收集器(Perkin Elmer, Victoria, Australia) 将细胞沉淀在玻璃纤维纸上，并使用Top Count (Perkin Elmer)进行计数。所有的细胞因 子和抗体是可商购获得的(R&D Systems, Minneapolis, MN)或由 CSL Limited (Melbourne, Australia)提供。细胞因子信号传导通过免疫沉淀和免疫印迹来检测信号传导蛋白的磷酸化。对TF-I细胞和AMLMNC 细胞进行洗涤，并且使其在缺失生长因子、含有0.5% HI-FCS (Hyclone，Utah)或0.5%人类 白蛋白(CSL，Melbourne，Australia)的IMDM培养基中静止达到18小时。将一亿个细胞用 IgG2a (IOOnM)、9F5、6H6 (非封闭抗 CD123 抗体)、或 7G3(0. OOOl-lOOnM)在冰上孵育 30 分 钟，接着在37°C用50ng/mL IL-3刺激15分钟。将细胞在NP-40裂解缓冲液4°中裂解，并且 使用偶联到琼脂糖凝胶珠上的ICl和8E4抗体将人类i3。(CD131)免疫沉淀。将免疫沉淀物 进行SDS-PAGE以及免疫印迹，如之前所描述41。用于探测免疫印迹的抗体是4G10，抗磷酸 酪氨酸MAb (Upstate Biotech, Lake Placid, NY)；抗-磷酸-Akt Ser473(Cell Signaling, Beverly,MA)；以及抗磷酸化信号转导蛋白和转录因子5的激活子(STAT_5)MAb (Zymed，San Francisco,CA)。所有抗体根据制造商的说明书使用。使用增强的化学发光(ECL ；Amersham Pharmacia或West Dura来自Pierce)对信号进行显影。还通过细胞内FACS在白血病细胞系M07e和TF1、以及初级AML细胞上检测 STAT-5 的激活。将细胞在 MEDM 力口 10 % FCS 以及 10ng/mL huIL-3 (CSL, Melbourne, Australia)中孵育60分钟，并且用BD Cytofix 缓冲液(Becton-Dickinson)固定，之 后以甲醇渗透。然后，用抗磷酸STAT-5(Becton-Dickinson)对细胞进行染色，并且使用 FACSCalibur(Becton-Dickinson)设备对其进行分析。体外的抗体处理
在37°C将解冻的AML或正常的造血细胞用对照IgG2a或7G3(10l·! g/mL)在补充 7 15-20 % BIT(StemCell Technologies, Vancouver, BC Canada)的 X-VIVOlO(Cambrex Bioscience)中孵育2小时，之后静脉移植进入亚致死照照射的N0D/SCID小鼠中用于再生 测定(见下)。在4-10周在2个不同的时间点检测移入。
AML的体内抗体处理对于体内测试，按照每幅图的图例中所说明的方案将对照IgG2a或 7G3 (300-500 μ g/注射)通过腹膜内(i. p.)注射到小鼠中，每周3次。为了研究7G3与阿 糖胞苷(Ara-C)可能的协同效应，在移植后35天，每天注射一次500 μ g抗体，持续连续的 3天；之后以40mg/kg/d腹膜内注射Ara-C，持续连续的5天。以500 μ g/注射每周3次重 新进行抗体处理，再进行4周；在这之后在最后注射抗体的最后3天对移入进行测定。人类细胞异种移植到N0D/SCID小鼠中根 据 University Health Network/Princess Margaret Hospital Animal CareCommittee 或 the Animal Care and Ethics Committee of the University of New SouthWales批准的公共机构指导方针进行动物研究。如之前所说明38，将人类细胞移植到 N0D/SCID小鼠中。简言之，所有小鼠接受亚致死照射(250-350cGy)24小时，之后每只小鼠 用5，000，000-10，000，000个人类细胞进行静脉内(i. v.)或股骨内移植。从杂交瘤细胞 系 ΤΜ-β 1 (由 Prof. Τ. Tanaka, Hyogo University of HealthSciences 惠赠)42 纯化出抗 CD122抗体，并且在小鼠照射后立即将200 μ g通过腹膜内注射到小鼠中用于自然杀伤细胞 的清除，如之前所说明43。类似地，每只小鼠通过静脉内移植8，000, 000个正常的骨髓细胞、 或1，000，000个分选的⑶34+正常骨髓细胞、或3xl05个谱系清除的⑶34+正常脐带血的细 胞。通过流式细胞术基于hCD45+细胞的百分数来评估人类AML以及自然造血细胞在鼠骨 髓、外周血、肝脏和脾脏中的移入水平。为了测量7G3对LSC活性的效应，还通过在IgG2a 或7G3处理组中通过静脉移植相同数目的从之前经过移入的小鼠的骨髓中分离的人类细 胞(9，000, 000个细胞/小鼠)进行了二次移植，。归巢检验将来自初级的患者样品的或从经过移入的小鼠中收集的相同数目的人类细胞通 过静脉注射到亚致死照射的N0D/SCID小鼠中。注射后16-20-4小时，使用5xl04-lxl05个 收集的事件(event)通过流式细胞术针对人类细胞分析来自受体小鼠的骨髓、脾脏、以及 外周血的单核细胞。人类细胞归巢到小鼠组织的效率通过测量特定的器官中所发现的所注 射细胞的百分数来测定，通过以下式子计算在该组织中检测的hu⑶45+细胞的百分数X 在特定组织中细胞的总数/所注射的人类细胞的总数X 10 044—46。细胞染色和流式细胞术用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗鼠抗体以及藻红蛋白-花青苷5(PC5， Beckman-CouIter)或异藻蓝蛋白(APC, BioLegend and Becton-Dickinson)偶联的抗人类 抗体对来自经处理的小鼠的骨髓、脾脏、肝脏和外周血的细胞进行染色，如之前所说明2。用 藻红蛋白(PE)偶联的抗人类⑶123抗体(克隆9F5)测量⑶123的表达。通过使用9F5-PE 或7G3-PE对一式两份样品进行染色以测量从经7G3处理的小鼠中回收的、结合到人类细 胞上的7G3，这是因为两个克隆结合到完全分开的表位上并且在未经处理的初级细胞上产 生类似水平的荧光(数据未显示)。通过以下式子计算7G3的结合水平[(9F5-PE检测的CD123 的 RFI)-(7G3-PE 检测的 CD123 的 RFI)] + (9F5-PE 检测的 CD123 的 RFI)xl00。使 用一列抗人类抗体来识别免疫表型以及干细胞群体抗-⑶15-FITC、偶联PE的抗-⑶14、 抗-CD19-PE、抗-CD33-PE、抗-CD34-FITC 或抗-CD34-PC5、以及抗-CD38-PE 或 PE-菁蓝 7 (所有抗体都来自Becton-Dickinson，除非另有指明)。同种型对照抗体用于排除99. 9% 的阴性细胞，并且使用FACScan或FACS Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)对细胞 进行分析。统计分析数据表示为平均值士s. e.m.。各组之间差异的显著性通过使用Student's t_检 验来确定。结果单克隆抗体7G3在IL-3依赖的细胞系和初级AML细胞中阻断IL_3介导的信号传 导之前已经显示单克隆抗体7G3(针对IL-3受体α亚基(IL_3Ra，CD123)产生) 抑制IL-3结合到⑶123上以及IL-3介导的体内效应，包括白血病细胞系(TF-I)的增殖、组 胺从人类嗜碱粒细胞中的释放、以及内皮细胞的激活33。与这些发现一致，目前已发现MAb 7G3在TF-I细胞以及初级人类AML细胞中抑制细胞内信号传导。用IL-3(lnM)刺激剥夺生 长因子的TF-I细胞导致受体β亚基(CD131)的酪氨酸磷酸化以及STAT-5和Akt下游信 号传导分子的激活，这些分子在细胞的增殖和存活方面发挥作用(图6a)。CD131酪氨酸磷 酸化以及STAT-5和Akt的激活通过使用InM的7G3孵育细胞而受到抑制，在IOnM被进一 步降低，并且在IOOnM浓度下被完全阻断，这与所报道33的7G3的900pM的Kd相一致。两 种不阻断IL-3结合、中和⑶123欠佳的抗体9F5和6H6在抑制IL-3介导的信号传导上是 无效的(图6a)。还通过流式细胞测定证实了 IL-3依赖的白血病细胞系TF-I和M07e中 7G3对IL-3刺激的STAT-5磷酸化的抑制(图6b)。重要地，MAb 7G3在初级AML细胞中以 浓度依赖的方式选择性地抑制IL-3依赖的CD131酪氨酸577的磷酸化(涉及促进细胞存 活的信号4°)(图6a)。类似地，7G3在初级AML细胞中还降低了 IL-3刺激的STAT-5的磷酸 化，如通过流式细胞术所测量(图6b)。MAb 7G3对IL-3信号传导的这种选择性抑制与它 能够阻断IL-3结合的能力相一致，并且提出了以下重要问题，即以前报道不表达⑶131 ( β 链)25的白血病干细胞是否可以专有性地通过⑶123(α链)进行信号传导。⑶123(IL_3受体α链)与⑶131 (受体β链)在AML白血病干细胞上共表达⑶123在来自AML患者的⑶34+/⑶38_细胞上的过量表达已被广泛报道17_21，并且 在一些研究24’25中提出作为白血病⑶347⑶38_干细胞(LSC)的标记物。在目前的研究 中，在2个不同的实验室对⑶123在多个AML样品上的表达进行独立地测量。⑶123在AML CD34+/CD38-细胞上的表达(RFI 67. 7士24. 2，η = 9)显著高于在正常的造血CD34+/CD38-细 胞上的表达(RFI 17. 1 士8. 6，η = 4，Ρ = 0. 21)，(数据汇总于以下表1中)，这与其它报道 17_21’24’25—致。这种过量表达表现为选择性的，因为在AMl样品中在等效的群体中GM-CSF受 体α链(⑶116)没有表达，如通过流式细胞术所测量。相反，GM-CSF受体α链在⑶34—母 细胞上大量表达(数据没有显示)。而且，流式细胞术和PCR分析证实了表达⑶123的⑶34+ 细胞也表达⑶131 (数据没有显示)，这提示通过经典的杂二聚体IL-3受体但不单独通过 CD123来发生信号转导，这也是CD131磷酸化数据所支持的(图la)。此外，在正常的以及恶性的⑶34+/⑶38_母细胞之间⑶123表达水平方面的差异为7G3选择性地靶向LSC而非 正常造血干细胞提供了基础。7G3在体外抑制初级AML样品的自发的以及IL_3诱导的增殖使用38个初级AML的患者样品来研究7G3抑制由IL_3诱导的增殖的能力。对于 3个初级样品的代表性图显示于图lb-d。在35份样品中的32份中，7G3抑制IL-3诱导的 增殖(图Ie)，但不抑制GM-CSF刺激的生长(图lb_d)。在缺失外源加入的生长因子时， 7G3还抑制一些AML样品中的细胞的生长。在所测试的9个初级样品中，7G3和IL-3的存 在将增殖降低到内源水平的大约60%，其范围是50-75% (图Ie)，这提示了自分泌通路。 这种阻断6H6欠佳的抗体不抑制IL-3诱导的增殖(数据没有显示)。7G3抗体的Kd(大约 900pM)33与抑制增殖所要求的浓度很好地拟合(图lb-d)。总而言之，在大多数初始AML样 品中7G3有效地抑制IL-3介导的生长连同自发生长(未添加IL-3)，这提示一些AML细胞 组成型地生产IL-3或者7G3在这些细胞中触发了负信号。用7G3预处理抑制N0D/SCID小鼠中AML的移入但不抑制正常造血细胞的移入为了评估7G3对于正常的以及恶性细胞在免疫缺陷小鼠中再生能力的效应，用 7G3或不相关的IgG2a(10y g/mL，2h)对初级AML以及正常骨髓(NBM)或脐带血(CB)细胞 进行体外孵育，并且将其移植到亚致死照射的N0D/SCID小鼠中。体外7G3孵育明显地减少 了(10份中有9份)初级AML样品的移入，它的对照物显示了在接种后4-8周骨髓移入的 证据(平均值89. 7士 1.9%，相对于对照物的减少，P = 0. 013，图2a和表1)。当在接种后 8-12周之间评估时，在7份样品中有6份持续了移入的减少。相比之下，在接种后4-11周， 7G3对5份正常样品中的3份的移入没有显著的抑制作用，并且当对抗两个NBM的小效应达 到统计显著性时，与AML细胞相比这种抑制的明显程度低得多(图2b和表1)。体外7G3处 理相对于IgG2a对照将正常造血细胞的移入平均降低了值23. 5士8. 9% (P = 0. 078)。通 过监测⑶33、⑶19以及⑶3表达，对这些NBM中的3个的多谱系移入进行测量，在IgG2a与 7G3处理组之间没有发现显著性差异(数据没有显示)。体外7G3处理将诊断和复发时所收集的AML-8的移入抑制到相似的程度，这表明 诊断和复发的样品可以具有可以针对7G3处理的可相比的敏感性。AML-5是仅有的其中 体外7G3处理不会降低移入的AML样品，这也许是归因于该样品显示高比例的LSC(⑶347 ⑶38_)以及所评估的全部AML样品中最低的⑶123表达(表1)。总而言之，这些结果证实 了与AMLLSC相比正常造血干细胞对7G3处理的降低的敏感性。由体外7G3处理所引起的AML移入的减少也与改进的生存率相关联。移植了经 IgG2a或7G3处理的AML-9细胞的小鼠分别显示11. 5和24周的中位值存活期(P = 0. 0188， 对于每组η = 10，，图2c)，其中7G3组中有40%存活超过实验结束时(25周)，相比之下在 对照组中没有小鼠存活超过20周。体外7G3处理对AML或正常造血细胞移入的抑制效应是与⑶123在该⑶34+/ ⑶38—群体上的表达强度负关联的，具有显著的关系(图7洱=-0.68，？ = 0.0051)。二元 模式是明显的，这证实了对于其中移入被7G3严重抑制的那些AML样品而言⑶123表达通 常是高的。相反地，这种单一的AML样品(AML-5)、连同正常的造血细胞样品(对于这些样 品，移入没有受到7G3的明显影响)通常表达较低水平的⑶123。7G3在N0D/SCID小鼠中抑制AML归巢的能力
为了确定7G3对经静脉接种AML细胞归巢到骨髓和脾脏的能力的效应，移植了体 外处理的AML-8-rel和AML-9细胞，并且将小鼠进行安乐死并且24小时后进行检查。与同 种型处理的对照物相比(P < 0. 05)，7G3将归巢到骨髓显著地降低到46-93%，同时将归巢 到脾脏减少到对照物的35%至90%，但是该差异不是统计学显著的(P > 0. 05)(图2d)。 接种后24小时停留在骨髓和脾脏中的白血病细胞基本上是CD34+原始细胞，并且当7G3减 少骨髓中细胞的数目时，它没有改变停留的细胞的细胞表面表型(数据没有显示)。为了进一步表征7G3对AML归巢到骨髓的效应，将AML-8_rel细胞暴露于7G3或 同种型对照抗体，随后经由尾静脉(IV)进行移植或直接进入右股骨(RF)，并且在5周之 后将这些动物安乐死。图2e显示了与静脉接种相比股骨内接种缓解了 7G3对移入的抑制 效应，尽管7G3在经注射的股骨和未注射的股骨中显著地降低移入方面仍然有效。为了更 直接地证实7G3对AML-LSC的抑制，我们研究了 7G3处理对⑶34+CD38_细胞的影响，因为 AML-LSC(按照它们在N0D/SCID小鼠中重现人类疾病的能力来定义)在该部分中显著地富 集2’3。来自归巢到BM中的AML-8-rel和AML-9的⑶34+CD38-细胞的数目被体外7G3处理 分别减少到对照物的8. 4士0. 018%和12. 0士4. 3% (P = 0. 16和0. 013，图2f)。类似地， 归巢到脾脏的AML-9CD34+CD38—细胞的数目被减少到对照物的3. 8士 1. 5% (P = 0. 019)。 为了进一步确认该发现，使用从AML-9中分选的CD34+CD38—细胞对该归巢实验进行重复， 并接着用IgG2a或7G3进行体外处理，之后注射到N0D/SCID小鼠中。在7G3处理组中人 类细胞的归巢效率在BM中被降低到IgG2a对照的7. 8士 1. 7% (P = 0. 0019)，而在脾脏中 (P = O. 09)为11. 2士0.84% (图2g)。所以，CD123似乎在AML N0D/SCID白血病起始细胞 (SL-IC)归巢到它们的支持性微环境、连同该疾病在N0D/SCID小鼠中的确立和传播方面发 挥重要的作用。在N0D/SCID小鼠早期给予7G3降低了 AML移入为了确定N0D/SCID小鼠的7G3处理是否影响AML细胞移入，对小鼠给予单一的 腹膜内注射7G3或同种型对照抗体(300 μ g)，然后在6小时后进行AML-I细胞的静脉内移 植。在移植后5周，7G3处理几乎完全去除了骨髓中的移入，达到对照物的1.3士0.9% (P =0. 0006，η = 5，图 3a)。还通过在移植后24小时或4天开始处理来检查7G3在N0D/SCID小鼠中控制AML 进展方面的疗效，假定处理开始之前允许SL-IC归巢到骨髓微环境中44_46。当在移植后24 小时开始处理时，在3份AML样品中有2份的移入被降低。使用这种每隔一天给予4个剂 量的处理方案时，AML-2和-3的移入分别被减少到对照物的41. 1 士27. 1% (P = 0. 096)和 39. 6 士 10. 0% (P = O. 026)，而AML-I的移入没有受到影响(图3b)。尽管7G3在两个移植后处理方案中的效应相对温和，但是包被在AML细胞(从小 鼠骨髓中收集)上的7G3是清楚地明显的(数据没有显示)。此外，在所测试的任何处理方 案中，7G3处理减少了⑶123在AML-I细胞上的表达。为了展示，从移植后4天开始的7G3处 理将从BM中收集的AML-I的⑶123表达降低到对照物的51. 3士4. 0% (图3c，P<0. 0001)， 正如使用9F5抗体所评估。在同一实验中，7G3还将AML-I向小鼠外周血和脾脏的传播分别 降低到对照物的 27. 8 士 7. 5% (P = 0. 0029)和 23. 5 士 5. 3% (P = 0. 0009)(图 3d)。7G3能够降低N0D/SCID小鼠中确立的AML疾病的负荷尽管本发明的主要目标是测试靶向⑶123对于AML干细胞的效应，7G3对确立的白血病显示任何单一试剂处理活性的能力(高于并且超过它对白血病干细胞移入的效应) 是在确立的疾病模型中通过在移植后28天开始进行连续的7G3或对照IgG2a处理来进行 评估的，并且连续处理直到处死时。在该模型中在多个患者样品之间对7G3处理的应答存 在着差异，这类似于临床见到的AML的异质性反射。在该模型中两个患者样品之间应答7G3 处理存在差异，这类似于临床可见的AML的异质性反射。在5份样品中的2份中看到AML 的BM负荷的显著降低(显示于图3e和f)。AML-2响应于7G3，其中在移植后9周和14周 BM的移入显著降低(图3e)，而在8天内仅用4个剂量的7G3对小鼠进行处理将AML-I的 移入显著地减低到IgG2a对照的18. 9士4. 1% (P = O. 001，图3f)。此外，移植后4天或28 天开始7G3处理时，多个AML样品不具有BM中自血病负荷的显著降低，通常观察到外周造 血器官(脾脏、外周血、以及肝脏)中白血病负荷低于7G3处理组(图3d，数据没有显示)。 总之，这些数据提示7G3在体内是具有生物学活性的，并且在用作单一试剂时可以在NOD/ SCID模型中抑制AML的生长。7G3靶向SL-IC自我更新能力这些系列性的移植实验解答对于所有的癌症干细胞(CSC)指引的治疗中一个重 要问题，并且提供了 CSC实际上是受到体内靶向的这一证据。在AML的情况下，已知当 AML-LSC再生初级N0D/SCID小鼠时，它们必须自我更新3 ；自我更新是所有干细胞的关键特 性，并且最好通过二次移植进行评估。为了检查7G3是否也能够作为常规处理的佐剂用于靶向具有自我更新能力的 LSC(它靶向更快增殖的AML母细胞)，将7G3或IgG2a与阿糖胞苷(Ara-C)相结合，并且 确定了它们对SL-IC和白血病负荷的效应。在用AML-10细胞移植后35天，每天用7G3或 IgG2a对照(500 μ g/d)对小鼠进行处理，持续3天，之后是Ara-C (40mg/kg/d)，持续连续的 5天。在Ara-C处理之后，再给予7G3持续另外4周。与经IgG2a和Ara-C处理的小鼠相 比，在经7G3和Ara-C处理的小鼠的骨髓和脾脏中白血病移入没有减少(图4部分Ia)。然 而，当从经处理的小鼠的骨髓中收集细胞并且将相同数目的人类细胞移植到次级受体小鼠 中时，从7G3/Ara-C处理的供体小鼠中收集的细胞归巢到骨髓和脾脏分别被抑制到IgG2A/ Ara-C 处理的对照物的 33. 6士5. 0% (P = 0. 014)和 10. 9士4. 6% (P = 0. 15)(图 4 部分 Ib)。此外，次级受体小鼠的骨髓和脾脏的再生还被7G3/Ara-C分别降低到IgG2a/Ara-C处 理的对照物的 21. 0士 15. 2% (P = O. 024)和 35. 8士31. 8% (P = O. 31)(图 4 部分 Ic)。尽 管在供体小鼠的骨髓中出现的⑶347⑶38—LSC的比例相对于IgG2a/Ara-C处理没有被7G3/ Ara-C减少(数据没有显示)，图4部分Id显示了与使用IgG2a/Ara-C进行处理的供体相 比来自7G3/Ara-C供体的次级受体小鼠的骨髓和脾脏中该细胞群体的显著减少。这些数据 证实在N0D/SCID小鼠中体内7G3给药特异性地靶向AML-LSC，导致在次级受体小鼠中归巢 和移入的减少。为了确定7G3是否可以作为单一的试剂，在Ara-C缺失的情况下进行体内7G3处 理之后进行系列性移植。如图4部分IIA中所示，尽管7G3处理10周在初级移入小鼠的BM 或脾脏中没有明显地减少AML-10的移入，与IgG2a处理的对照物相比，从7G3处理的小鼠 中收集的AML细胞显著地破坏了归巢到次级受体小鼠的BM(28. 2士2. 9%，P = 0. 0083)和 脾脏(18·3±4·8%，Ρ = 0·0021)的能力(图4部分II B)。再生能力也受到显著破坏尽 管9只移植了未经处理的对照细胞的次级受体小鼠中有8只被移入，在8只接种了来自7G3
21处理小鼠的细胞的小鼠中仅有3只显示移入的证据(图4部分II C)。与IgG2a处理的对照 物相比，在7G3处理的小鼠中平均移入水平被显著减少(BM，34. 6士 18. 6%，P = 0. 039 ；脾 脏，33. 7 士 20.4%，P = 0. 19)(图4部分II C)。这个患者样品具有高水平的⑶34+⑶38_原 始细胞，其在7G3处理的初级小鼠中没有减少。然而，与IgG2a处理的供体相比，在从7G3 处理的供体中移植的次级受体小鼠的BM中该原始细胞群体存在着显著的减少(对照物的 56.6 士 15.0%，P = 0.031)(图4部分II D)。在以AML-9细胞进行的独立实验中获得了 类似的结果，显示7G3引起移入平均水平的降低达到对照物的19. 3% 士9. 8% (图4部分 III)。总之，将在图4中所描述的来自全部3个独立实验的数据进行汇总，在27只次级 小鼠中仅有1只(3. 7% )没有移入从IgG2a或IgG2a加Ara-C处理的对照小鼠中收集的细 胞。相比之下，在23只次级小鼠中有11只(48% )不能移入从7G3或7G3加Ara-C处理的 小鼠中收集的细胞。这些结果证实在N0D/SCID小鼠体内7G3给药特异性地靶向AML-LSC， 导致次级受体中归巢和移入的减少。⑶122+NK细胞对于N0D/SCID小鼠中7G3介导的AML再生的抑制发挥作用NK细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞和树突细胞是免疫系统中的效应子细胞，它们有助 于Fc依赖的、抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。通过以下方法进行评价它们对7G3抑制AML 移入的能力的贡献在进行体外7G3处理的AML细胞的白血病细胞移植之前，将针对鼠 IL-2Ri3 -链(IL-2Ri3)的单克隆抗体(也称作⑶122)注射到经照射的N0D/SCID小鼠中。 IL-2R^广泛地表达于NK细胞、T细胞以及巨噬细胞上，通过mAb阻断IL-2R0可以在NOD/ SCID异种移植系统中改进人类造血细胞的移入。在移植后4周，在NK细胞清除的、移植了经IgG2a对照体外处理的AML-8_rel细 胞的小鼠中白血病移入被增加到未清除的小鼠的113. 3士2. 8% (P = 0. 023)(图5a)，这提 示⑶122+NK细胞在N0D/SCID小鼠中温和地减少了 AML的移入。⑶122+细胞的消除也部分 地但却显著地缓解7G3降低AML细胞移入的能力，这提示⑶122阳性细胞部分地介导7G3 的抑制作用(图5a)。与对N0D/SCID再生的效应相反，在抗CD122处理的小鼠中7G3还将 白血病细胞的归巢有力地抑制达到超过IgG对照的85% (图5b)。这些结果表明在NOD/ SCID小鼠中7G3抑制AML细胞的移入和归巢的能力是由至少2种合作的通路所介导的NK 和/或其它CD122依赖的细胞引起的ADCC ；以及，7G3阻断IL-3/CD123信号通路的特异性
抑制效应。
AML样品的增殖。此外，7G3处理明显地降低了 AML-LSC移入并且改进了小鼠的存活率。患 有预先确立的疾病的小鼠显示了 BM和外周中降低的AML负荷、以及在治疗时受损的二次移 植，从而确立了在经处理的小鼠中AML-LSC被直接靶向。这些结果为治疗性抗⑶123单克 隆抗体对AML-LSC的靶向、以及将体内临床前的研究发现转化成潜在的临床应用提供了清 楚的确证。实施例2CSL360是一种嵌合抗体，通过将小鼠单克隆抗体7G3的轻可变区和重可变区嫁接 到人类IgGl恒定区而获得。与7G3相同，CSL360以高亲和力结合到CD123 (人类IL-3R α ) 上，与IL-3竞争结合到受体上并阻断它的生物学活性33。大部分的人类嵌合抗体CSL360还 由此可以潜在地用于靶向并且消除AML LSC细胞。CSL360凭借它的人类IgGlFc区(它可能 在人类环境中引起效应物活性)还具有作为人类治疗剂的潜在使用优势。而且，可能的是 在人类中相对于小鼠7G3等效物它会显示降低的清除并且不太可能是免疫原性的。CSL360 在处理表达白血病的⑶123中的作用机制可能涉及1)通过阻断IL-3结合到它的受体上而 抑制IL-3信号传导，2)在抗体已经结合到靶细胞之后招募补体并且引起补体依赖的细胞 毒性(CDC)，或3)在抗体结合到靶细胞之后招募效应子细胞并且引起抗体依赖的细胞毒性 (ADCC)。以下说明所开发的研究抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的方法，并且可以将其归类 为以下方法，这些方法分析该检验中(1)靶细胞群体或(2)效应子细胞群体。分析靶细胞 所涉及的方法测量由ADCC产生的靶细胞的裂解或靶细胞的早期凋亡。检查效应群体的方 法测量效应子细胞(例如NK细胞)上膜颗粒的诱导，以此作为NK细胞诱导的细胞裂解的 标记物。方法使用51铬释放检验测量ADCC在37°C将经工程化处理以表达⑶123的鼠淋巴样细胞系CTL-EN(如Jenkins等人 5°所描述)或新鲜解冻的白血病细胞(5xl06)用250 μ Ci的51Cr-铬酸钠孵育1小时。用 RPMI-10% FCS培养液将细胞洗涤3次以去除任何游离的51Cr铬酸钠。将铬标记的靶细胞 以10，000个细胞/孔分配到圆底的96孔板中。加入10 μ g/mL的CSL360或同种型对照抗 体(MonoRho，重组抗恒河猴D人类免疫球蛋白Gl)。以不同的比例加入新鲜分离的PBMC作为效应子细胞，一式三份，并且在37 °C在 5% CO2培养箱中将其孵育4小时。总样品的体积是200 μ L/孔。在孵育期之后，将孔板以 600xg离心5分钟，除去100 μ L上清液并且在Wallace γ -计数器中测量释放的51Cr。使用以下式子来确定特异性裂解裂解百分数=IOOx[(具有抗体的平均cpm-平 均自发cpm) / (平均最大cpm-平均自发cpm)]。从多个样品获得自发的释放，这些样品具有 靶细胞而没有抗体并且没有效应子细胞。从使用(v/v) Triton X-IOO处理的靶细胞中 确定最大释放。 使用钙黄绿素AM标记的靶细胞检验测量ADCC 通过Neri等人52描述的方法测量由CSL360诱导的ADCC。该方法涉及用钙黄绿 素AM代替51铬来标记靶细胞。将靶细胞在37°C在5% CO2培养箱中用ΙΟμΜ钙黄绿蛋白 AM(Invitrogen, cat. no. C3099)孵育30分钟。对标记的细胞进行洗涤以去除任何游离的钙黄绿蛋白AM，并接着将其以5000细胞/孔分配到圆底平板中。以不同比例加入效应子细 胞。加入有关抗体达到终浓度为lOyg/mL，无抗体的细胞充当阴性对照物。将平板在37°C 在5% C02培养箱中孵育4小时。孵育期后，将平板以600xg离心5分钟。除去100 μ L上 清，并且在Envision酶标仪(激发滤光片485nm，发射滤光片535nm)中测量荧光。通过使 用以下式子来计算特异的裂解裂解百分数=IOOx [(具有抗体的平均荧光_平均自发荧 光)/ (平均最大荧光_平均自发荧光)]。通过用3 % Extran裂解细胞来确定最大荧光，自 发裂解是使用没有任何抗体或效应子细胞的靶细胞所获得的荧光。测量ADCC作为膜颗粒蛋白CD107a的效应子细胞表达而作为细胞裂解的替代标记 物Fischer等人51证实了 NK细胞的⑶107a(—种膜相关联的裂解颗粒蛋白)的表达 水平与靶细胞毒性相关。该方法用于评估CSL360的ADCC活性。该方法涉及孵育从覆盖靶 细胞的棕黄层中新鲜分离的人类PBMC。所使用的靶细胞是表达CD123的细胞系或初级人类 AML细胞。靶细胞在抗体存在或不存在的情况下以1 1的比例加到人类PBMC中。⑶107a 的非特异性或自发的表达使用不含所添加的任何抗体或靶细胞的人类PBMC进行评估。将 PE-Cy5偶联的CD107a单克隆抗体(BD Pharmingen, cat. no. 555802)加到所有样品中，并 且在37°C在5% CO2培养箱中将细胞孵育3小时。在孵育的第一个小时之后，加入布雷菲 德菌素A(BFA)。在孵育结束时，对细胞进行洗涤，并且用抗-CD56-PE(BD Pharmingen, cat. no. 347747)以及抗-CD16-FITC (BD Pharmingen, cat. no. 555406)单克隆抗体对其进行染 色。然后，通过流式细胞术使用FACS Calibur (Flow Jo Software TreeStar, Inc.)分析细 胞并且分析⑶56dimCD16+⑶107a细胞，这些细胞代表了表达FcR y IIIA受体的NK细胞，它 们表达膜相关的裂解颗粒蛋白。结果当通过51铬释放检验进行评估时CSL360在AML样品和表达⑶123的细胞系中诱 导 ADCCCTLEN细胞总摄取的51铬在2000cpm与1500cpm之间，作为对比AML细胞仅有大约 400-200cpm，如通过用洗涤剂裂解的最大铬释放所确定。使用CSL360以效应物比靶细胞为 100 1的比例观察到AML(SL)细胞的15%裂解，相比之下用阴性对照抗体MonoRho具有 1. 9%的裂解。使用CSL360以效应物比靶细胞为100 1的比例观察到CTLEN细胞的51% 裂解，相比之下用阴性对照抗体MonoRho具有5%的裂解(表2)。这些结果提示与AML细 胞相比，CTLEN细胞对CSL360-介导的ADCC裂解更加敏感，尽管AML细胞具有更高水平的 ⑶123的表面表达。当用⑶107a在效应NK细胞上的表达进行评估时CSL360在AML样品和表达⑶123 的细胞系中诱导ADCC图8显示了流式细胞术分析，这些分析证实在CSL360或同型对照抗体的存在 下膜裂解颗粒⑶107a在衍生自混合的PBMC(来自以AML患者样品RMH003孵育的正常 供体)NK细胞上的诱导。在该混合的群体中NK细胞是对于表达⑶56(NK标记物)和 OTie(FcRYlIIA)的淋巴细胞群设门(gated)而获取。这些数据显示与来自相同供体以及 用同种型对照抗体孵育的患者样品的NK相比( 3% CD107a阳性细胞，在图8A中)，暴露 于包被着CSL360的AML细胞的NK证实显著地提高⑶107a ( 39%⑶107a阳性细胞，在图8B中)。供体NK细胞上的CD107a诱导是靶细胞依赖的，因为如果在靶AML患者细胞的缺 失下将CSL360加到效应子细胞中就没有检测出CD107a(图8D)。图9显示了来自相同实验 的、被绘成直方图的数据。表3中包含了按照与以上相似的方式产生的数据，这些数据来自多个经工程化处 理以表达人类⑶123(CTLEN，EL4)的细胞系或表达内源性⑶123 (TF-I)的人类白血病细胞 系、以及来自白血病患者的作为靶细胞(以衍生自达3种不同供体的效应子细胞进行孵育) 的初级样品。这些数据表达为表达了 CD 107a、以不同样品进行孵育(在存在CSL360或 不加入抗体的情况下)的NK细胞的百分数。两个表达人类⑶123的小鼠细胞系在CSL360 的存在下在NK细胞中诱导了⑶107a的表达。8份初级白血病样品中有4份证实在NK细 胞上CSL360-介导的⑶107a的表达。RMH007甚至在CSL360的缺失下还在NK细胞中诱导 CD107a的表达。RBH013给出了与来自供体的PBMC相类似的结果，然而，使用不同的供体， ⑶107a的表达是特异性地针对CSL360的，这表明了在这个情况下供体特异性对CSL360诱 导的NK-介导的ADCC的敏感性。对8份初级白血病样品中的6份检查了 ADDC效应，其中不同的供体作为效应子细 胞的来源。一个重要的观察是对ADCC敏感的样品通常在效应子细胞中诱导CD107a，不论供 体如何。类似地，对ADCC具有抗性的样品也通常保持着阴性，不论供体细胞如何。CSL360在AML样品中诱导ADCC，如通过钙黄绿素-AM释放检验所评估在培养基中裂解的细胞释放的钙黄绿素是ADCC-介导的细胞裂解的指示物。在该 检验中患者RMH003和RMH008显示对ADCC的敏感性，而RMH009、RMH010和RBH013表现出 对裂解的抗性(表4)。在NK细胞CD107a表达检验中，用与本检验所使用的相同的效应子 细胞测试了所有这五位患者对CSL360-介导的ADCC的敏感性，并且将比较结果显示于表5。 6个患者样品中有3个样品的ADCC的状态与两个不同的测检验相一致。表2在51铬释放检验中ADCC介导的裂解 表3CD107a的表面表达作为ADCC活性的量度 ““表明用不同供体作为效应子细胞的来源来测试样品的ADCC表4钙黄绿素释放检验中ADCC的评估。 *使用样品RMH009重复测定，使用另一个来源的PBMC作为效应子细胞表5.基于流式细胞术的检验与裂解检验的比较 a使用⑶107和钙黄绿素释放检验对这些样品测试ADCC，对于这两个测定使用相 同的效应子细胞* 未做
讨论通过使用几种被公认的测量ADCC活性的检验(尽管具有变化的灵敏度)，可以看 到CSL360可以在保持于培养物中的、表达异位的人类CD123的小鼠细胞系中诱导ADCC应 答。重要的是，CSL360在来自正常供体的功能性效应子细胞存在下也能够诱导针对初级人 类AML患者样品的ADCC应答。这一数据提示了一些白血病患者(它们的白血病细胞包括 LSC)表达充足水平的⑶123，治疗性地给予CSL360也许能够诱导ADCC指导的白血病细胞 的消除，特别是如果患者在他们的循环中还保留着一些功能性效应子细胞，例如像，处于缓 解期的患者或具有微小残留病的患者。实施例3⑶123在AML细胞(包括LSC)上的普遍表达以及表明IL_3在AML的病因学中具 有重要作用的证据提示阻断IL-3Ra功能的能力对于靶向IL-3Ra的抗体(例如7G3)的 任何治疗活性而言是至关重要的。在这个实施例中，一定程度上出乎意料地证实了 7G3抑 制由AML患者样品产生的N0D/SCID小鼠的移入或再生的能力至少部分地依赖于由7G3的 Fc区引起的效应子作用应答。而且，不显著抑制IL-3Ra功能的其它IL-3Ra抗体也阻断 了移入，因此证实在AML的N0D/SCID小鼠模型中的治疗活性。方法F (ab)，2片段的制备在37 °C使用固定的胃蛋白酶-琼脂糖(每mg抗体具有22. 5U胃蛋白酶琼脂糖) 与抗体孵育2小时，通过胃蛋白酶切割得到针对6H6、9F5以及7G3的F(ab)，2片段。使用 3M Tris将pH调节到6. 5来淬灭酶解。通过离心将固定的珠子从得到的F (ab) ’ 2中分离。使用串联的色谱操作从残余的免疫球蛋白以及其它污染物中纯化出7G3的 F(ab)，2 嗜硫吸附色谱(20-0%硫酸铵梯度，在40mM HEPES中，超过15个柱体积)以 及阴离子交换色谱。通过离子交换色谱、之后进行亲和层析而纯化出9F5F(ab)’ 2和 6H6F(ab)，2。通过LAL生色检验对内毒素水平进行定量。其中内毒素水平大于10EU/mL， Detoxigel用于降低内毒素水平。如所预期的，7G3F (ab) ’ 2保留了 CD123中和活性，如通过 IL-3依赖的TF-I增殖检验所评估(数据没有显示)。AML患者样品在知情同意之后从3位新诊断的患者中收集外周血细胞。对AML患者进行诊断， 并且根据法美英(French-American-British) (FAB)指标对其进行分类。AML_8_rel最初在 第一次诊断时被分类为M4，AML-9被分类为M5a，而未对AML-10进行分类。通过菲可密度 梯度离心将AML母细胞分离，并且将等份冷冻于液氮中。体外抗体处理使用针对IL-3受体α链(CD123)、7G3、9F5、6H6及其F(ab)，2片段的单克隆抗 体处理从AML患者中收集的细胞。IgG2a平行使用作为对照物。将解冻的AML细胞接种于 XVIV010加15% BIT中，并且用10 μ g/mL浓度的抗体对其进行独立孵育。在37°C孵育2小 时之后，将收集的白血病细胞静脉内注射到亚致死照射的N0D/SCID小鼠中用于再生检测。将人类细胞异种移植到N0D/SCID小鼠中进行异种移植，基本上如实施例1中所述进行。N0D/SCID小鼠在 UniversityHealth Network/Princess Margaret Hospital 白勺云力胃巾口畏住于此。根据 University Health Network/Princess Margaret Hospital Animal Care Committee批准的公共机构指导方针进行动物研究。如之前所说3，将白血病细胞移植到 N0D/SCID小鼠中。简言之，在相同的实验中所有小鼠在相同的时间以300cGy的剂量进行 照射，之后注射等数目的人类细胞。对于静脉移植，每一组使用5只小鼠，其中每只小鼠注 射5，000, 000-10, 000, 000个白血病细胞。基于通过鼠骨髓的流式细胞术得到的⑶45+细 胞的百分数来评估人类AML的移入水平。细胞染色和流式细胞术将来自经治疗小鼠的骨髓的细胞用偶联到APC上的对人类CD45特异的小鼠抗 体(抗-CD45) (Beckman-Coulter)、偶联到异硫氰酸荧光素(FITC)上的抗-CD34、以及 抗-CD38-PC5(Becton-Dickinson)进行染色。使用同种型对照以避免假阳性的细胞。使用 抗-CD123-PE (克隆9F5和7G3, Becton-Dickinson)测试IL-3受体α链在AML细胞上的 表达。使用Caliber(Becton-Dickinson)分析染色的细胞。统计分析数据表示为平均值士 s. e. m。处理组之间差异的显著性是用Student’ s t_检验 通过P值来确定的。在P < 0. 05时认为结果被统计上显著的。结果抗-IL-3RCI抗体Fc区显著地促进了对AML归巢能力的抑制实施例1中的数据、图5a和b表明由NK和/或其它⑶122依赖的细胞所引起的 ADCC促进7G3抑制AML细胞进入N0D/SCID小鼠的骨髓的归巢和再生的能力，并且额外地 影响了 7G3阻断IL-3/⑶123信号通路的效应。为了对此直接进行检查，检查了其它中和 抗-IL-3R α抗体欠佳的6Η6和9F5对体外处理的AML样品归巢的效应。6Η6和9F5均特异 地结合⑶123，然而与7G3不同，它们不阻断IL-3Ra的功能33。在图6a中这也是显然的， 该图显示与7G3不同，9F5和6H6甚至在所测试的最高剂量下也不能抑制IL-3诱导的信号 传导，包括⑶131 (β c)酪氨酸的磷酸化、STAT-5磷酸化和Akt磷酸化。图10显示尽管如 此，6Η6和9F5有效地抑制AML细胞归巢到ΒΜ，至少与本实验中的7G3 —样。Fc结构域对7G3抑制归巢的效应的贡献是通过测试7G3和6Η6的F(ab)，2片段 来进行评估的。抗体F(ab)，2片段缺少Fc效应物免疫球蛋白结构域，并且不能引起ADCC 或⑶C应答。图10还显示在该实验中7G3和6H6的F (ab)，2片段没有抑制AML细胞归巢， 并且表明这两个抗体的Fc结构域对抑制AML细胞归巢到骨髓是重要的。抗-IL-3RCI抗体Fc结构域显著地促进对AML细胞的骨髓移入和再生能力的抑制然后，本实验延伸到评估IL-3Ra中和以及效应物活性对于抑制AML细胞移入受 体小鼠骨髓中的贡献。在37°C用10 μ g/mL浓度的不同的完整的抗体和抗体片段将两个AML 患者样品体外处理2小时。孵育后，将细胞离心以去除未结合的抗体，并且将其移植到亚致 死照射的N0D/SCID小鼠中。移植后4周通过评估hu⑶45阳性细胞在小鼠骨髓中的百分数 来分析人类AML的移入水平。如图Ila和b中所示，如所预期的，7G3显著地抑制这两个AML 患者样品移入N0D/SCID小鼠中。与对归巢的效应一致，9F5也有效地抑制这两个患者样品 的AML细胞移入。有趣地是，图Ila显示对于患者样品AML-9，7G3和9F5的F(ab) ’ 2片段 被证实显著地降低抑制能力，但没有完全允许移移入恢复到使用对照抗体时的水平。相比 之下，对于样品AML-10，不存在这两个F(ab)，2片段的抑制效应。
讨论总而言之，这些结果表明除了 7G3中和IL-3Rci功能的能力之外，7G3的Fc结构域 对于抑制AML细胞的归巢和移入的能力也是重要的。没有这个Fc结构域，针对⑶123的抗 体在N0D/SCID小鼠中就显著地丧失了它们抑制AML-LSC的归巢、沉淀、以及再生的能力。实施例4已经描述了用于增加抗体的效应子功能活性的一些方法。这些方法可以包括抗体 的Fc区的氨基酸修饰以增强它与相关Fc受体的相互作用并且增加它促进抗体依赖的细胞 介导的细胞毒作用(ADCC)以及抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)的潜力34’35。还描 述了在寡聚糖共价结合到Fc区中的保守Asn297上的IgGl抗体上的修饰之后ADCC活性的 增强34。在进一步的研究中36，Lecl3细胞中(变体的中国仓鼠卵巢细胞系，它缺少将岩藻 糖加到其它的正常寡聚糖上的能力)人类IgGl抗体的表达导致了岩藻糖缺陷抗体，该抗体 具有高达50倍改进的与人类Fc YRIIIA的结合以及改进的ADCC活性。通过在某些糖苷酶抑制剂53的存在下培养表达抗体的细胞也说明了产生去岩藻 糖化抗体的可替代的方法。在本研究中，在kifimensine (—种有效的α -甘露糖苷酶I抑 制剂)的存在下培养表达感兴趣的抗体的CHO细胞，其导致分泌不含有岩藻糖的寡聚甘露 糖类型聚糖的IgG。这些抗体展显示出对FcR的增强的亲和力以及增强的ADCC活性。在本实施例中描述了通过Fc工程化处理或去岩藻糖化而具有增强的ADCC活性的 CSL360变体的产生和测试。方法用于瞬时表达CSL360和Fc优化的CSL360的哺乳动物表达载体的构建使用NucleoSpin RNA II试剂盒(BD Bioscience)根据制造商的说明书从 总7G3. 1B8杂交瘤RNA中克隆鼠抗-⑶123抗体7G3的轻链和重链可变区的基因。使用 SMART RACE扩增试剂盒(Clontech)合成第一链cDNA，并且通过RACE-PCR使用校对DNA 聚合酶Plantinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)扩增可变区。用于可变重区的引物是 UPM(Universal Primer Amiχ， DB Bioscience)和 MH2a(5’ AATAACCCTTGACCAGGCATCCTA3 ，)。类似地，使用UPM和MK (5，CTGAGGCACCTCCAGATGTTAACT3’ )扩增可变轻区。使用标准 的分子生物学技术，将该重链可变区克隆到a)哺乳动物表达载体pcDNA3. l(+)-hIgGl， 它基于pcDNA3. 1 (+)表达载体(Invitrogen)被修饰为包括人类IgGl恒定区，或b) pcDNA3. l(+)-hIgGlS239D/A3鳳/I332E，或 c)pcDNA3· l(+)-hIgGlS239D/I332E。b)和 c)中使用的载体 编码掺入氨基酸突变的蛋白，这些氨基酸突变被报道导致具有显著地增改进的ADCC活性 的抗体35。使用QuikChange诱变技术(Stratagene)引入这些突变。将该轻链可变区克隆 到表达载体pcDNA3. l(+)-hK中，它基于pcDNA3. 1(+)表达载体被修饰为包括人类κ恒定 区。细胞培养FreeStyle 293-F细胞获自Invitrogen。将细胞培养于补充有青霉素/链霉素 / 两性霉素 B i式齐[J (Invitrogen)的 FreeStyle Expression Medium (Invitrogen)中。在 转染之前将细胞在37°C在8% CO2的大气压进行培养。瞬时转染使用293feCtin转染试剂(Invitrogen)根据制造商的说明书使用
31FreeStyleTM293-F细胞进行表达质粒的瞬时转染。将轻和重链表达载体组合，并且在 Freestyle 293-F细胞中共转染。细胞(1000ml)以最终浓度IxlO6个活细胞/mL进行 转染，在 Cellbag 2L (Wave Biotech/GE Healthcare)中在 37 °C 在 8 % CO2 的大气压在 2/10ffave Bioreactor 系统 2/10 或 20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare)上孵育 5 天。转 染后4小时加入Pluronic F-68 (Invitrogen)至终浓度0. 1% ν/ν。转染后24小时向细胞 培养液补充胰蛋白胨NKOrganotechnie，France)至终浓度0.5% ν/ν。然后，在纯化前通 过Millistak+POD过滤器(Millipore)过滤来收集细胞培养液的上清。Kifunensine 处理为了产生去岩藻糖化的抗体，按照描述53，将提及的 kifunensine (TorontoResearch Chemicals)加到瞬时转染的 FreeStyle 293-F 细胞(转 染后24小时)的培养基中至如终浓度0. 5 μ g/mL。蛋白表达的分析5天后，将20 μ 1的培养液上清在4-20% Tris-Glycine SDS聚丙烯酰胺凝胶上电 泳，并且通过用考马斯兰试剂染色而显示抗体。抗体纯化除了实施例2中所描述的嵌合体CSL360，在本实施例中还描述了 CSL360的人源化 变体(hCSL360)的用途。通过标准的⑶R移入技术制备该抗体，其中来自7G3的鼠⑶R区 被移入到适宜的人类可变结构区上54。得到的人源化抗体含有完整的人类框架序列。作为 人源化处理的结果，MAb对⑶123的亲和力被适度地减小(表示为对于CSL360和hCSL360 的KD分别是1. 06nM和12. 8nM)。然而，结合特异性保持不变，并且hCSL360保留了有效的 ⑶113中和活性，正如通过IL-3-依赖的TF-I细胞增殖测试所测量(表示为对于CSL360 和hCSL360的IC5tl分别是5nM和19nM)。使用标准的基于核糖体展示的诱变55进行亲和力 优化，以便将hCSL360的亲和力恢复到至少等效于亲本小鼠Mab的7G3以及嵌合体CSL360 的水平。产生了亲和力优化的MAb克隆(168-26)，它展显示与⑶123可比的亲和力以及 ⑶123对亲本Mab的中和的活性(表示为对于与⑶123的结合KD为0. 6nM，并且IL-3中和 IC50为6nM)。还产生了该克隆的Fc工程化处理衍生物，这些衍生物含有具有三个氨基酸 取代 S239D/A330L/I332E (168_26Fc3)或具有两个氨基酸取代 S239D/I332E (168_26Fc2)的 IgGlFc区，如以上针对hCSL360所说明。未修饰的嵌合CSL360、人源化变体(hCSL360)以及ADCC优化的和人源化的 CSL360s239d/i332e (hCSL360Fc2)以及 CSL360S239D/A330L/I332E (hCSL360Fc3)以及从 kifunensine 处 理的细胞所衍生的物质是在4°C使用蛋白A进行亲和层析(其中将MabSelect树脂(5ml， GE Healthcare, UK)填充到 30mL Poly-Prep 空柱(Bio-Rad，CA)中)进行纯化。首先将 树脂用10个柱体积的无热源的GIBCO蒸馏水(Invitrogen，CA)进行洗涤以去除储存的乙 醇，并接着用5个柱体积的无热源的磷酸盐缓冲盐水(PBS) (GIBC0 PBS, Invitrogen, CA)进 行平衡。然后，将经过滤的条件细胞培养基(IL)通过重力自流进料(gravity feed)上样 到该树脂上。然后，用5个柱体积的无热源PBS对树脂进行洗涤以去除非特异性蛋白。结 合的抗体用2个柱体积的0. IM甘氨酸pH 2. 8 (Sigma, M0)洗脱到馏分中，该馏分含有0. 2 个柱体积的2M Tris-HCl pH 8. O (Sigma, M0)以中和低pH。洗脱的抗体在4°C在12ml的 Slide-A-Lyzer盒(拦截分子量为3. 5kD) (Pierce, IL)中以5L PBS透析18小时。通过使用Ultraspec 3000 (GE Healthcare, UK)分光光度计在280nm处测量吸光度来测量抗体浓 度。通过SDS-PAGE来分析抗体的纯度，其中将处于还原性样品缓冲液(Invitrogen，CA) 中的 2μ g 蛋白上样到 Novex 10-20% Tris Glycine Gel (Invitrogen,CA)上，并且在含有 Tris Glycine SDS 电泳缓冲液的 XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA)中使用恒 压150V持续90分钟，之后用考马斯兰染色进行显像，这些是按照制造商的说明书进行的。
结果 野生型CSL360和Fc工程化处理的CSL360变体的ADCC测试为了测试不同的变体抗体的效应子活性，使用表达CD123的CTLEN细胞系作为靶 细胞系，并且如实施例2中所概括在正常的PBMC作为效应子细胞来源的情况下使用钙黄绿 素AM释放检验来评价ADCC活性。图12显示了嵌合体CSL360与人源化变体(hCSL360)抗 体、以及经Fc修饰的变体hCSL360Fc2以及hCSL360Fc3在它们诱导ADCC指导的CTLEN靶 细胞系的裂解的能力方面的比较。这些数据表明嵌合体CSL360以及具有未修饰的Fc结构 域的人源化变体具有可检测的、但却适度的诱导针对CTLEN细胞系(5-10%的靶细胞裂解) 的ADCC的能力，并且与在实施例2中所概括的发现相一致。两个具有经修饰的Fc结构域 的变体(hCSL360Fc2和hCSL360Fc3)证实了显著地增强引起ADCC指导的CTLEN靶细胞裂 解的能力，其中当用与Fc未修饰抗体相同的浓度测试时观察到50-60%靶细胞裂解。测试CSL360、Fc_工程化处理的CSL360变体以及去岩藻糖化的CSL360对Fc受体 的结合如已提及，通过结合到先天免疫系统的不同效应子细胞上表达的Fc Y受体 (FcyR)介导了抗体Fc效应子作用37。为了增强对Fc γ R的结合而进行的抗体优化导致更 大的效应子细胞激活以及对抗体包被的肿瘤细胞的更大的杀伤。用BIAcore AlOO生物传感器测量了不同的人类Fc γ R对于hCSL360、Fc工程化处 理的变体hCSL360Fc2和hCSL360Fc3、以及通过kifunensine处理所产生的去岩藻糖化的 hCSL360(hCSL360kif)的相对亲和力。在与CD123偶联的CM5BIAcore芯片上逐个捕获不 同抗体。可溶的？(；丫1 011^(；丫1 1、111^(；丫1 11匕/(；禾口111^(；丫1 111&(获自1 &0 Systems))以 0. 3nM-800nM的浓度范围流过对应的表面，通过将数据拟合为动力学和/或稳定状态的模 型来确定亲和力测量值。图 13A 比较了 hCSL360Fc2、hCSL360Fc3 和 hCSL360kif 相对于 hCSL360 的与 huFcYRI、huFcYRIIb/c和huFcYRIIIa相结合的亲和力(KA)。这些结果广泛地类似于 hCSL360Fc2 和 hCSL360Fc3，其中相对于 hCSL360 与 huFc y RI 和 huFc y RIIb/c 的结合 KA 具有大约15-35倍的增加。对于huFcYRIIIa，看到了结合最显著的增加，其中亲和力增加 了 100倍。尽管hCSL360kif亲和力在倍数上的绝对增加低于Fc工程化处理的变体，使 用huFc YRIIIa再次观察到一种类似的模式，展示了与huFc y RI (0. 75倍)和huFc y RIIb/ c (2. 6倍)相比的最大倍数增加( 5倍)。近来的研究已经显示不是绝对亲和力，而是IgG亲和力中高激活/抑制(Α/Ι) (FcyRIII huFcyRIIb)的比例对于最大化的抗体介导的效应物活性是重要的56。图13B 显示了表达为对于Fc γ RIII huFcYRII的hCSL360变体亲和力比例的数据。所有变体 证明相对于hCSL360A/I比例均增加，hCSL360kif、hCSL360Fc2和hCSL360Fc3分别具有 2倍、 4倍以及 3倍的A/I比例增加。
这些数据证实，正如所预期的，不同的hCSL360Fc增强的变体对于Fc γ R显示出增 加的亲和力，其中对于激活对比抑制Fc γ R具有更大的效果。讨论本文中显示了 Fc工程化处理的以及去岩藻糖化的CSL360变体证明显著地增加针 对FcR γ的亲和力和A/I结合比率，以及改进的体外ADCC效应物活性。该结果与在实施例 1和3中所提供的数据一起证明了效应子功能活性在AML的小鼠模型中对于抗CD123抗体 的治疗效果的重要作用，有力地提示效应子功能增强的变体抗-CD123抗体治疗很可能会 证明用于在人类患者中治疗AML和其它CD123-阳性白血病的改进的治疗活性。实施例5在本实施例中，测试不同的Fc增强的抗体针对经工程化处理以表达⑶123的细胞 系、连同表达天然⑶123的的人类白血病细胞系的增强的ADCC活性。还使用体外ADCC测 试Fc增强的MAb来对抗一系列来自AML和ALL患者的初级白血病样品。方法使用乳酸脱氢酶释放检验测量ADCC使用乳酸脱氢酶(LDH)释放检验来测量ADCC，如所说明35。LDH是稳定的胞质酶， 一旦细胞裂解就将其释放出。使用比色检验法测定释放到培养基中的LDH，其中LDH将特 异性底物转化成红颜色的产物。裂解被测量为释放的LDH，并且直接与形成的颜色成比例。 将表达CD123的靶细胞与不同数量的抗CD123抗体在用作针对ADCC的效应子细胞的NK细 胞的存在下进行孵育。使用MiltenyiBiotec，s NK分离试剂盒(Cat#130_092_657)从正常 的棕黄包块中纯化NK细胞。细胞在37°C在5% CO2的存在下孵育4小时。使用无抗体或 NK细胞的靶细胞作为自发的LDH释放(背景)对照物，并且使用经裂解缓冲液裂解的靶细 胞作为最大裂解对照物。根据制造商的说明书(Cat#G1780)使用Promega's CytoTox 96 非放射性细胞毒性测定试剂盒测量释放进入到培养基中的LDH。所有其它方法见以上的实施例的描述。结果图14检查了不同的CSL360衍生抗体对于针对经工程化处理以表达⑶123的人类 成淋巴细胞样Raji细胞的ADCC活性的效应。表达低水平⑶123 (大约4，800个受体/细 胞)(Raji-⑶123低)(图14a和b)的稳定克隆或表达高水平CD123 (大约24，400受体/ 细胞)(Raji-⑶123高)(图14c和d)的独立克隆用于这些实验中。使用25 1和50 1 的效应物对靶细胞的比例。一致地，hCSL360Fc3和CSL360kif证明了与亲本hCSL360抗 体相比显著增强的针对Raji-⑶123低和Raji-⑶123高的ADCC活性。在50 1的E T 比例，hCSL360Fc3和hCSL360kif都实现了以低浓度( Ing/mL)的抗体几乎完全裂解 Raji-⑶123高靶细胞。在Raji-⑶123低细胞中达到相同的效果大约需要超过一个数量级 幅度的抗体。有趣的是，嵌合体CSL360诱导的ADCC稍微强于hCSL360 (尽管在比Fc增强 的变体更低的水平)。这可能是由于与嵌合MAb相比，对于人源化变体与CD123结合的亲和 性大约减少10倍，如之前所讨论的人源化处理产生的结果。图15a显示了上述实验的重复，使用了 TF-I人白血病细胞，该细胞自然地表达 ⑶123以作为靶细胞。与Fc未优化的hCSL360相比，hCSL360Fc3变体再一次地显示了具有 hCSL360Fc2和hCSL360kif的显著改进的ADCC(尽管有效性欠佳)，还证明了增加的活性。
图15b比较了 TF-I细胞中人源化的以及亲和力优化的抗-⑶123抗体变体168-26 与它的Fc增强的衍生物168-26Fc3和168_26Fc2的活性。图中的数据证明Fc工程化改进 的人源化的和亲和力优化的168-26变体的ADCC活性，它类似于只用人源化变体(hCSL360) 所看到的。然后，将不同的Fc增强的hCSL360变体的活性与来自5个AML患者(图16a_e) 和2个ALL患者(图16f-g)的一列初级白血病细胞样品进行比较。在这些初级患者样 品中结果类似于使用具有针对ADCC活性效力的以下数量级排列的细胞系获得的那些 hCSL360Fc3 彡 168_26Fc3 > hCSL360Fc2 彡 hCSL360kif > > CSL360 彡 168-26 彡 hCSL360。 重要地，Fc优化变体在测试的所有初级患者样品中始终诱导ADCC。所有5个AML和2个 ALL样品证明通过Fc优化变体ADCC显著更高的水平，而对于无Fc优化的变体AML样品中 只有3个证明了微弱的应答。两个ALL都证实对于无Fc优化的变体MAbs没有任何显著的 ADCC应答。这些数据与实施例2中描述的结果一致，其中CSL360治疗在6个AML样品中的4 个和2个ALL样品中的0个诱导了适度的ADCC活性(通过不同的ADCC方法评估)。讨论实施例5中的数据证明CD123MAb的Fc优化导致针对体外检验中测试的所有初级 白血病样品的显著效应子作用应答，并且与Fc未优化的抗-⑶123Mab相比表现为显著改进。具有表达⑶123的ALL肿瘤的这些发现与以下观点一致，即除了 AML之外其它表 达⑶123的恶性肿瘤也可能对于具有增强的Fc效应子功能的抗⑶123MAb治疗敏感57—61。实施例6实施例4和5中描述的结果表明具有增强的Fc效应子功能的CSL360变体显示了 体外的针对一系列经工程化处理以表达⑶123的细胞系和自然表达⑶123的人白血病细胞 系的增加的ADCC活性，并且重要的是同样在体外测定(使用从患有AML或ALL的患者中得 到的初级白血病样品)中的增加的ADCC活性。针对AML和ALL患者初级样品的体外ADCC 数据是特别重要的，因为以这种体外设置进行测试允许在人类疾病的条件下对疗效的潜力 进行估计。在这个实施例中，这些实验被延伸到测试CSL360的工程化处理的Fc变体 (168-26Fc3)在人类ALL的N0D/SCID小鼠异种移植模型中的治疗效果。这是一种临床前 模型，它已被证明精确地反应ALL临床疾病并且与患者的结果显著相关62。该模型的临 ^ffi^ti Β ^^τΛ^ , ^ National Cancer Instituteinitiative :the Pediatric Preclinical Testing Program63 的完整的部分。方法从小儿ALL患者中衍生的人ALL白血病细胞(ALL-2)通过如前所述62在雌性非肥 胖糖尿病(NOD)/scid-/-小鼠中通过静脉内接种进行增殖。从使用常见的CDlO+B细胞前体 ALL所诊断的65月龄的雌性鼠的第三次复发中得到该异种移入物。该患者从那以后死于她 的疾病并且该异种移植对于常规的化疗具有抗性62。将小鼠随机分成每组6-7只小鼠的处 理组和对照组，从而在治疗开始时在所有的组中给出大约相等的中位值的白血病负荷。将 所有小鼠维持在阻隔条件下，并且使用经新南威尔士大学的委员会和动物管理和伦理委员会批准的程序和条件进行实验。如前所述62测定人类CD45-阳性(hCD45+)细胞的百分数。确切的log排列检测(使用GraphPad Prism 4. Oa进行)用于比较处理组和对照 组之间的无事件存活率分布。P值是两侧的并且不针对多个比较进行调整，从而给出本研究 的探测性本质。移植后34天开始处理，小鼠接受300 μ g/100 μ L的溶于磷酸盐缓冲盐水中的抗体 的处理。通过腹腔内注射给予抗体，每周3次(每2-3天一次)。通过小鼠每周尾静脉采血 来监测白血病负荷。继续治疗直到事件达成并且定义为在外周血中25% h⑶45+负荷。结果图17检查了不同的抗体(包括不相关的MAb对照(鼠IgG2a)、鼠MAb 7G3、人源 化的和亲和性优化的变体168-26以及后者的Fc工程化处理变体168-26Fc3)对于ALL移 入的小鼠的效应。附图描述了对于每个处理组无事件生存期(EFS)的卡普兰-迈耶曲线， 其中每条垂直线表示一个事件。以对照MAb治疗的小鼠具有53. 5天的中位值
下对于7G3、168-26和168_26Fc3分别是56. 3,59. 9和65. 7天。结果表明7G3和168-26 尽管分别地将白血病的生长延迟了 2. 9和6. 4天，但与对照MAb相比没有统计上的显著效 果(P > 0. 05)。168-26Fc3在ALL的生长上具有最显著地效果，与对照治疗的动物相比具 有统计显著延迟的12. 2天的白血病生长(P = 0. 044)。重要地，Fc工程化变体168_26Fc3 对比168-26 (无Fc修饰的同样的MAb)增加的EFS效果是统计显著的(P = O. 037)，其中白 血病生长延迟5. 9天。这证明具有增强的Fc效应子功能的抗⑶123抗体在体内具有增强 的治疗效果。结论这些数据显著地扩展了前面实施例中提出的那些数据，因为它们证明具有增强的 Fc效应子功能的抗CD123MAb在患有预先确定的白血病的小鼠中比Fc未修饰的MAbs具有 增强的治疗效果。重要地，使用了临床证实的ALL模型，该模型已被证实可预测人类疾病过 程62，这有力地支持了这样的Fc优化的抗CD123MAb在白血病患者中也可以具有增强的临 床疗效。参考文献1. Wang, J. C. &Dick, J.Ε. Cancer stem cells :lessons from leukemia. Trends CellBiol(2005).2. Bonnet, D. &Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med,3, 730-737(1997).3. Hope, K. J. , Jin, L. &Dick, J. E. Acute myeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol. 5，738-743(2004).4.Lapidot, Τ. , et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia aftertransplantation into SCID mice. Nature 367,645-648(1994).5. Guan, Y.&Hogge, D. E. Proliferative status of primitive hematopoieticprogenitors from patients with acute myelogenous leukemia (AML). Leukemia 14,2135-2141(2000).
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权利要求
一种用于抑制表达IL 3Rα(CD123)的白血病干细胞的方法，该方法包括将所述细胞与抗原结合分子相接触，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性地结合到IL 3Rα(CD123)上。
2.一种治疗患者中的血液癌症病症的方法，该方法包括对该患者给予有效量的抗原结 合分子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所 述抗原结合分子选择性地结合到IL-3Rci (⑶123)上。
3.如权利要求2所述的方法，其中患者是人。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中抗原结合分子是包含Fc区的单克隆抗 体或抗体片段。
5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中抗原结合分子是包含经修饰的具有增 强的Fc效应子功能的Fc区的单克隆抗体或抗体片段。
6.如权利要求5所述的方法，其中抗体或抗体片段的Fc区中的修饰包括在Fc区中取 代至少一个氨基酸、优选2或3个氨基酸，以增强Fc区与相关的Fc受体和补体的相互作用。
7.如权利要求5所述的方法，其中包括经修饰的Fc区的抗体或抗体片段是去岩藻糖化 的抗体或抗体片段。
8.如权利要求5所述的方法，其中抗体或抗体片段的Fc区中的修饰包括结合在Fc区 中的保守Asn297上的寡糖的修饰。
9.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中抗原结合分子是嵌合的、人源化的或人 类的单克隆抗体或抗体片段。
10.如权利要求9所述的方法，其中抗原结合分子是嵌合抗体或抗体片段，该嵌合抗体 或抗体片段包括接到人类恒定区上的小鼠抗-CD123单克隆抗体的轻可变区和重可变区。
11.如权利要求9所述的方法，其中抗原结合分子是一种人源化的抗体或抗体片段，该 人源化的抗体或抗体片段包括接到人类构架区上的小鼠抗CD-123单克隆抗体的互补决定 区(CDR)。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述血液癌症病症是白血病或恶性淋巴增生性紊乱。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述白血病选自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性 白血病、急性淋巴样白血病、慢性淋巴样白血病或骨髓增生异常综合症。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述恶性淋巴增生性紊乱是淋巴瘤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述淋巴瘤选自多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴 瘤、伯基特淋巴瘤、或小细胞和大细胞滤泡淋巴瘤。
16.如权利要求2所述的方法，进一步包括对所述患者给予化学治疗剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中给予化学治疗剂是在给予抗原结合分子之前、同 时、或之后。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述化学治疗剂是细胞毒剂，该细胞毒剂选自(a)芥子气衍生物氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、以及异环磷酰胺(b)乙撑亚胺噻替派以及六甲三聚氰胺(c)烷基磺酸盐白消安(d)胼类以及三嗪六甲蜜胺、丙卡巴胼、达卡巴嗪以及替莫唑胺(e)亚硝基脲卡莫司汀、洛莫司汀以及链佐星(f)金属盐卡钼、顺钼以及奥沙利钼(g)长春花生物碱长春新碱、长春碱以及长春瑞宾(h)紫杉烷紫杉醇以及多西他赛(i)鬼臼毒素依托泊苷以及替尼泊苷(j)喜树碱类似物伊立替康以及托泊替康(k)蒽环阿霉素、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌以及伊达比星(1)色霉素更生霉素以及普卡霉素(m)其它的抗肿瘤抗生素丝裂霉素以及博来霉素(n)叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(o)嘧啶拮抗剂5_氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨、以及吉西他滨(P)嘌呤拮抗剂6_巯基嘌呤以及6-硫鸟嘌呤(q)腺苷脱氨酶抑制剂克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨以及喷司他丁(r)拓扑异构酶I抑制剂伊立替康以及托泊替康(s)拓扑异构酶II抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(t)核糖核苷酸还原酶抑制剂羟基脲(u)肾上腺皮质类固醇抑制剂米托坦(v)酶天门冬酰胺酶以及培门冬酶(w)抗微管剂雌莫司汀(x)类视黄醇贝沙罗汀、异维甲酸以及维甲酸(ATRA)。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞毒剂是阿糖胞苷。
20.抗原结合分子在抑制表达IL-3Rci(⑶123)的白血病干细胞中的用途或在制备用 于抑制表达IL-3Rci (⑶123)的白血病干细胞的药物中的用途，所述抗原结合分子包括Fc 区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性结合到 IL-3Ra (CD123)上。
21.抗原结合分子在治疗患者中的血液癌症病症或在制备用于治疗患者中的血液癌症 病症的药物中的用途，所述抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能 的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性结合到IL-3Ra (⑶123)上。
22.用于抑制表达IL-3Rci(⑶123)的白血病干细胞的试剂，该试剂包括抗原结合分 子，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗 原结合分子选择性地结合到IL-3Rci (⑶123)上。
23.用于治疗患者中的血液癌症病症的试剂，该试剂包括抗原结合分子，该抗原结合分 子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中所述抗原结合分子选择性 地结合到IL_3Ra (CD123)上。
全文摘要
一种用于对表达IL-3Rα(CD123)的白血病干细胞进行抑制的方法，包括将这些细胞与抗原结合分子相接触，该抗原结合分子包括Fc区或经修饰的具有增强的Fc效应子功能的Fc区，其中该抗原结合分子选择性地结合到IL-3Rα(CD123)上。本发明包括通过对患者给予有效量的该抗原结合分子而治疗该患者中的血液癌症病症。
文档编号C07K16/30GK101896200SQ200880119712
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月6日
发明者D·P·吉尔英, G·L·瓦伊罗, J·E·迪克, L·秦, S·J·布斯费德 申请人:Csl有限公司;大学健康网