专利名称：Cd19单克隆抗体免疫脂质体的制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，主要涉及CD19单克隆抗体(单抗)-4-2￡8修饰并载 有杀灭B系白血病干细胞的去甲斑蝥素(NCTD)免疫脂质体的制备及用途。
背景技术：
B淋巴细胞白血病/淋巴瘤是常见的血液恶性肿瘤，约在占每年肿瘤新发病 例的4%-5%。虽然患B淋巴细胞白血病的病人对初始化疗反应较好，然而大 部分病例容易复发，特别是成人病例更易复发，主要原因是病人体内残留的恶 性B细胞或肿瘤干细胞未完全清除。此外，常规化疗药对肿瘤细胞无特异杀伤 效应；对正常组织也产生毒副作用。因此，寻找能完全根除残留的恶性B淋巴 细胞或B淋巴细胞白血病干细胞，同时能减轻对正常组织不良反应的治疗方 法，对彻底根治B淋巴细胞白血病具有重要意义。
近年来，以抗体为基础的靶向治疗(包括免疫毒素、放射免疫疗法和免疫 脂质体)，能特异地靶向肿瘤细胞并大大降低化疗药物的毒副作用；与常规化 疗药物相比，能显著提高抗肿瘤疗效。其中，免疫脂质体是靶向治疗快速发展 的分支，也是先进药物传输体统的主流之一；具有生物治疗(抗体)和药物传输 系统(脂质体)的双重优势，被认为是肿瘤治疗最有前途的方法之一。
CD19在B淋巴细胞白血病干细胞表面表达。研究报道从B淋巴细胞白 血病患者骨髓中分离出的CD34+CD38-CD19+移植给SCID小鼠，能发展成为 B淋巴细胞白血病。从被移植的SCID小鼠的骨髓中再次分离出 CD34+CD38-CD19+细胞，又移植给另一只SCID小鼠，也能发展成为B淋巴 细胞白血病，证明CD34+CD38-CD19+细胞是具有自我更新能力的B淋巴细胞 白血病干细胞。CD34+CD10-CD38-CD19-细胞移植给SCID小鼠则不能发展成 为B淋巴细胞白血病；证明CD34+CD10-CD38-CD19-细胞为正常造血干细胞。 此外，CD19在分化的恶性B淋巴细胞表面也高表达，其与CD19抗体结合后 可介导CD19抗体的内化。因此，CD19是免疫脂质体获得靶向杀伤B淋巴细 胞白血病干细胞及子代细胞的一个理想的耙点。虽然正常的B淋巴细胞表面 也表达CD19,免疫脂质体在治疗过程中有可能杀死正常的B细胞，但骨髓造 血干细胞表面不表达CD19，因此骨髓造血干细胞仍可源源不断地长出正常B 3淋巴细胞。研究报道与抗人CD19单抗连接制备的阿霉素、伊马替尼、长春 新碱等免疫脂质体，能显著提高对CD19高表达的肿瘤细胞特异性地结合和靶 向杀伤效应，体内能显著延长B淋巴细胞白血病模型小鼠的生存时间。但它们 均不能杀灭白血病干细胞，限制了它们用于治愈B系白血病的作用。
去甲斑蝥素(norcantharidine， NCTD)是中药抗癌活性成分斑蝥素 (cantharidin， CA)去除两个甲基的衍生物，也是磷酸酯酶A2的抑制剂。NCTD 对许多肿瘤细胞株有抑制作用，其作用机制与阻滞细胞周期的各个时相和诱导 肿瘤细胞凋亡相关。最近又证实NCTD可特异性地诱导白血病干细胞(leukemic stem cells, LSCs)凋亡，其机制与特异性调节LSCs相关的抗凋亡路径(HLF, hepatic leukemia factor/SLUG轴)密切相关。HLF是LSC中稳定表达的基因之 一，作为转录因子在白血病细胞转化中参与HLF / SLUG轴的抗凋亡的活性。 NCTD特异性地下调HLF基因的转录，上调NFIL-3 (nuclear factor, IL3 regulated) 基因的转录，因此减弱了LSCs相关的HLF/SLUG轴的抗凋亡活性，从而诱 导LSCs凋亡。而普通抗白血病药物(如阿糖胞苷、柔红霉素)主要作用于成 熟的分化型白血病细胞，对处于静止期LSCs无特异性的杀伤作用。此外，由 于多耐药相关基因与LSCs密切相关，而NCTD能主动逆转耐药机制，抑制多 耐药相关基因^BC43和^万CC4表达。可见NCTD对LSCs和成熟的分化型白 血病细胞均具有杀伤效应。然而，NCTD也通过HLF / SLUG轴诱导正常造血 干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的凋亡；并容易引起消化系统和泌尿系 统的毒副作用；这在一定程度上削弱了 NCTD对LSCs及其子细胞的治疗优势。 若能通过靶向药物传输系统，将NCTD特异性靶向LSCs及其子代细胞，而对 HSCs和其它正常组织不产生杀伤作用，这将为彻底根治白血病，防止其复发 提供有效的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种CD19单克隆抗体去甲斑蝥素免疫脂质体，通过
以下步骤制备
(1) CD19单克隆抗体(ZCH-4-2E8单抗)的研制基本按Koller&Milstein 报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法制备[11，并经第6届国际人类白细胞分化抗原协作 组会议 (6th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiated Antigens, HLDA6)鉴定，正式命名为CD19抗体。2E8单抗及
其免疫球蛋白可变区基因序列和相应的氨基酸序列被专利号 ZL200610052289.7)公开。2E8单抗可变区基因编码的氨基酸序列如下重链的氨基酸序列SEQ ID NO 3 :
DGYYYAMDYWGQGTSVTVSSE;
轻链可变区基因(VL2E8)编码的氨基酸序列SEQ ID NO 4:
(2) 2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体(sterically stabilized liposome-NCTD modified by antibody 2E8, 2E8-SL-NCTD)的制备
首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体 (SL-NCTD)。其中大豆卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE)按起始摩尔比为2 : 1 : 0.01, NCTD与PC的 质量比(w/w)为1:20。高效液相检测NCTD的包封率达(46.5±2.21)%。
2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体(2E8-SL -NCTD)的制备主 要采用后插技术将抗人CD19单抗ZCH-4-2E8与SL-NCTD连接。其中大豆卵 磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、甲氧基-聚乙二醇20(xr磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE) 和马来酰亚胺-聚乙二醇2000.二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-PE)起始 摩尔比为2 : 1 : 0.008 : 0.002。当起始的2E8与胶束中Mal-PEG2Q(KrDSPE按摩 尔比1:50反应时，2E8获得的最佳连接率为(58.70±3.32)%或每个脂质体上含 有9个2E8 (IgM)抗体分子(9 IgM/liposome)。粒径测定仪检测2E8-SL-NCTD 的平均粒径为118.32士2.03nm。 2E8免疫脂质体(2E8-SL)的靶向性采用流式 细胞术检测带藻红蛋白(PE)的2E8-SL-PE与CD19抗原阳性的B细胞系白 血病细胞株Nalm-6细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞和CD19抗原阴性的T 细胞系白血病细胞株Molt-3、急性红白血病细胞株K562细胞的反应性来完成， 结果显示，2E8-SL-PE能特异性地与Nalm-6和Raji细胞结合，阳性率分别为 89.44%和88.73%，而几乎不与Molt-3和K562细胞结合，后两者的阳性率分 别仅为1.95%和1.39%，说明该免疫脂质体具有明显的靶向识别作用。我们所 制备的2E8-SL-PE对耙细胞(Nalm-6)的结合效率是无抗体标记的普通脂质体 SL-PE对耙细胞结合效率的15倍，显著高于其他作者所报道的连接其他克隆 号的抗人CD19单抗的免疫脂质体对靶细胞的结合效率，后者较普通SL对靶 细胞的结合效率仅2倍。
本发明的另一个目的是提供该CD19单克隆抗体免疫脂质体(2E8-SL-NCTD)在特异性耙向杀伤B淋巴细胞白血病及其干细胞中的应用。 所述B淋巴细胞为白血病细胞株Nalm-6细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞 和CD19抗原阴性的T细胞系白血病细胞株Molt-3、急性红白血病细胞株K562 细胞。
我们的研究证实2E8-SL-NCTD能通过受体介导内吞机制内化到Nalm-6 细胞内，将NCTD靶向传输到Nalm-6细胞内而发挥杀靶细胞作用。 2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞的生长抑制作用呈明显时间和剂量 的依赖性。NCTD的浓度在10WVI -50WV1的浓度范围内，2E8-SL-NCTD对CD19 阳性的Nalm-6细胞72小时的抑制率(44.40%-97.17%)显著高于CD19阴性 的Molt-3细胞 (7.04%-58.23%) (PO.Ol)。当NCTD的浓度为20WVI时， 2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞24， 48， 72小时的抑制率分别为 18.41%， 47.44%, 68.13%,显著高于2E8-SL-NCTD对CD19阴性的Molt陽3 细胞24， 48， 72小时的抑制率(5.99%, 10.05%, 13.80%)(P<0.01)。 Prohibit分 析显示2E8-SL-NCTD对Molt-3细胞72小时IC50值(45.90 WVI)是Nalm-6 细胞(14.52 WV1)的3倍。以上结果提示2E8-SL-NCTD能对CD19+的肿瘤细 胞或B系白血病干细胞(CD19+)产生特异性的细胞毒作用，而减少对正常组 织或正常干细胞(CD19-)非特异性毒性作用。
本发明的有益之处是ZCH-4-2E8修饰的NCTD立体空间稳定的脂质体 (sterically stabilized immunolipsome, SL)是利用本实验自行研制的抗CD19高亲 和力的IgM亚类的单抗(ZCH-4-2E8)，通过胶束转移法与NCTD空间稳定脂质 体成功连接，制备而成的一种新型构像的靶向B淋巴细胞白血病的免疫脂质体 (2E8誦SL-NCTD)。
2E8所结合的抗原具有95kDa的分子量，该单抗在人体各组织细胞中的表 达谱与其他抗人抗人CD19单抗类似，但它不能阻滞标准进口抗人抗人CD19 单抗(克隆名SJ25-C1)与B淋巴细胞的结合，说明其识别的抗原表位与标准 进口抗人CD19单抗(克隆名SJ25-C1)不同。
ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体是一种新型构像的免疫脂质体， 国际上尚无ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体靶向治疗B淋巴细胞白 血病、淋巴瘤的研究报道。该免疫脂质体(2E8-SL-NCTD)有望能特异性靶向 杀伤B淋巴细胞白血病干细胞及其子代细胞，具有彻底根治急慢性B淋巴细 胞白血病和淋巴瘤的潜在应用前景。
我们采用ZCH-4-2E8修饰的NCTD空间稳定脂质体(2E8-SL-NCTD)并非天然存在，而是经过一系列繁琐而复杂的技术过程制备而成，该制剂可靶向
治疗B系恶性肿瘤。
图1 NCTD脂质体与游离NCTD经SephadexG-50分离的流出曲线。 图2 ZCH-4-2E8(CD19)修饰的NCTD空间稳定的脂质体制备的模式图。 图3 2E8-SL-NCTD与游离2E8经Sepharose CL-4B分离曲线。 图4 SDS-PAGE证明2E8-SL-NCTD在制备过程中的每一步，2E8均保 持完整的形式。
图5流式细胞术证实，2E8与脂质体连接成功。 图6透射电镜观察脂质体的形态图。 图7 2E8-SL-NCTD粒径分布。
图8 ZCH-4-2E8(CD19)修饰的NCTD空间稳定的脂质体特异性靶向结合 CD19高表达的肿瘤细胞，并通过受体介导内化作用将NCTD靶向传输到肿瘤 细胞内。
图9不同浓度的2E8-SL-NCTD对靶细胞Nalm-6和对照细胞Molt-3的靶 向杀伤效率。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 实施例1
本发明提供的一种抗人CD19单抗免疫脂质体，通过以下步骤制备 U)ZCH-4-2E8单抗的研制参照专利号ZL200610052289.7实施例1-2 公开的方法制备。基本按KoUer&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行"。 以急性B淋巴细胞白血病细胞作为免疫原，将107白血病细胞给8周龄雌性 Balb/C小鼠作腹腔注射4次，每周一次，最后一次注射后第4天，脱臼杀死小 鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1 (购自美国 ATCC公司)细胞按6:1混合，以50。/。聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子 量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司) 中进行选择性培养，于融合后第9 20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行 间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100%孔达 到阳性，即建立了能持续分泌2E8单抗的杂交瘤细胞。该细胞分泌的2E8抗体 经第6届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(6th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiated Antigens, HLDA6 )鉴定，正式命名为CD19抗体2。2E8单抗的免疫球蛋白重链可变区基因(VH2E8)和轻链 可变区基因(VL2E8)已经被克隆和测序。抗人CD19鼠免疫球蛋白重链可变 区基因见SEQ ID NO 1核苷酸序列及SEQ ID NO 3氨基酸序列；抗人CD19鼠 免疫球蛋白轻链可变区基因见SEQ ID NO 2的核苷酸及SEQ ID NO 4氨基酸序 列。
该杂交瘤细胞经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌2E8单抗的 能力稳定。以其腹水(荧光法效价l:3200)或培养上清(荧光法效价1:16)作为2E8 单抗的来源。2E8腹水经凝胶层析柱纯化P，经聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)进行电泳分析，抗体纯度达到99%以上，用于下一步研究。
(2) 2E8修饰的立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体(sterically stabilized liposome-NCTD modified by antibody 2E8， 2E8-SL-NCTD)的制备首先采用薄 膜分散法[4]，制备立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体(SL-NCTD)。将大豆卵磷 脂(PC)、胆固醇(CHO)，甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-PE) 按2 : 1 : 0.01的摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发去除有机溶剂，形成一层均匀 脂质薄膜，然后在含有NCTD的HBS (HEPES Buffered Saline)缓冲液中[25 mM HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，140mMNaCl，pH7.4， NCTD/PC(w/w)=l:20〗 水化，直至薄膜完全从瓶壁上洗脱下来，形成脂质体混悬液(整个过程注意避 氧)。此脂质体混悬液通过一系列孔径为1.2， 0.4， O.l微米的聚碳酸脂膜整粒lO 次，使粒径基本一致。未被包封的NCTD经SephadexG-50，以HBS溶液(25 mM HEPES, 140mMNaCl，pH7.4)洗脱去除，并收集，以备高效液相检测NCTD的包 封率。SephadexG-50湿装柱法(玻璃柱:lcmx30cm，)，分别取NCTD，空白脂质 体和NCTD脂质体和悬液lml，过SephadexG-50，流速lml/min，每分钟收集一 份洗脱液，共收集25份。分光光度法测量NCTD在213nm处的吸光值(A)。以吸 光值(A)对洗脱体积作流出曲线(图1)，脂质体主要在6-llml流出，游离NCTD主 要在14-16ml流出。
(3) 胶束准备mPEG2<)()(rPE (甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺)和 Mal-PEG2,-DSPE (马来酰亚胺-聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺)按4:1 摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发(0.06-0.07MPa， 4(TC)去除有机溶剂并真空 过夜干燥。而后在HEPES溶液中(25 mM HEPES， pH 7.4，胶束摩尔浓度 10mM)65。C水化l小时，水化时不断搅拌；
(4) 2E8与胶束连接2E8单抗通过Mal-PEG2。。。-DSPE与脂质体连接[5]。 即10mg/ml 2E8单抗与Traut's试剂(2-亚氨基硫烷盐酸盐)按1:50摩尔比
8反应(增加单抗分子中二硫键)，未反应的Traut's通过Sephadex G-50，以HBS 为洗脱液去除(参见图2A: 2E8单抗的硫醇化)。然后，2E8以浓度180ug2E8 / umol PC与胶束(mPEG2幌-PE:Mal-PEG2画-DSPE = 4:l)在HBS中，4°C孵育反 应过夜(反应过程注意避氧)(参见图2 B: 2E8与胶束 (Mal-PEG2ooo-DSPE/mPEG-PE)的连接)。
(5) 2E8单抗从胶束转移至脂质体将所获得的抗体与胶束的混悬液通 过0.22mn的微孔滤膜以去除未连接单抗的胶束和自身发生聚集的胶束。过滤 后的悬液与先前制备的SL-NCTD，按磷脂摩尔比0.05:1 (脂质体中的磷脂主要 是PC) ， 6(TC敷育1小时，待其冷却后，过SepharoseCL-4B色谱柱，以HBS 平衡并洗脱柱子，去除未转移的2E8单抗(参见图2C: 2E8胶束转移至空间 稳定去甲斑蝥素脂质体(NCTD-SL)表面)。Sepharose CL-4B湿装柱(直径 1.5cm，柱床体积44ml)，分别取0.5ml游离2E8 (2E8浓度2mg/ml )与0.5ml SL誦NCTD (NCTD浓度0.5 mg/ml)，经Sepharose CL-4B，以HBS洗脱。流速 lml/min，每2ml收集一份洗脱液，分光光度计检测每份洗脱液在280 nm(抗体) 和213nm (NCTD)处的吸光值(A)，以吸光值对流份号作流出曲线。在213nm 处所收集的部分为纯化的CD19单克隆抗体修饰的长循环去甲斑蝥素脂质体即 2E8-SL-NCTD (图3 )。图2为2E8-SL-NCTD与游离2E8经Sepharose CL-4B 分离，2E8-SL-NCTD主要在第7-10个流份出峰，游离2E8主要在第15-18流 份出峰，两部分完全分离。
实施例2 2E8-SL-NCTD的评价及靶向杀伤作用 (1) SDS-PAGE和流式细胞术证明2E8与SL-NCTD连接成功。
图4: SDS-PAGE证明2E8-SL-NCTD在制备过程中的每一步，2E8单抗均 保持完整形式(即泳道2， 3， 5均有完整的重链和轻链)，其中泳道l:蛋白分子 量，泳道2:游离2E8，泳道3:与胶束连接后的(2E8-Mal-PEG-DSPE)，泳道 4:空白，泳道5 :2E8与SL-NCTD连接并经Sepharose CL-4B纯化去除游离的 2E8后，所得的2E8-SL-NCTD。
图5:流式细胞术证实，2E8与脂质体连接成功。(A) SL-PE与Nalm-6细 胞孵育后，细胞表面未探测到任何荧光。(B) 2E8-SL-PE与Nalm-6细胞孵育后， 细胞表面可同时探测到绿色荧光(FITC)和红色荧光(PE)，右上象限FITC与PE 成一一对应的直线关系。(C)SL-PE与Molt-3细胞孵育后，细胞表面未探测到 任何荧光。(D) 2E8-SL-PE与Molt-3细胞孵育后，细胞表面也未探测到任何荧 光。(2) BCA蛋白检测试剂盒和Stewart法[6]检测2E8与SL-NCTD连接效率 为(58.70±3.32)%。根据2E8单抗的分子量(900KD)和每个脂质体约包含的磷脂 分子数(80000f ]，计算出脂质体表面2E8抗体的浓度为9 IgM/liposome。
(3) 高效液相测定NCTD的包封率为(46.5±2.21)%。
(4) 透射电镜观察脂质体的形态(图6)，激光散射粒径测定仪检测 2E8-SL-NCTD的平均粒径为118.32土2.03nm (图7)。
(5) ZCH-4-2E8(CD19)修饰的NCTD空间稳定的脂质体特异性靶向结合 CD19高表达的肿瘤细胞，并通过受体介导内化作用将NCTD靶向传输到肿瘤 细胞内，参见图8，图中(A)流式细胞术分析2E8-SL-PE、 SL-PE对Nalm-6 细胞的靶向效率。2E8-SL能特异的靶向CD19高表达的Nalm-6细胞，靶向效 率为89.44%。 SL对Nalm-6细胞的靶向效率仅为6.13%。 (B)流式细胞术分 析2E8-SL-PE、 SL-PE对Molt3细胞的耙向效率。2E8-SL-PE和SL对Molt3 细胞的靶向效率没有显著性差异，分别仅为1.87%和1.98%。 (C)流式细胞 术分析2E8-SL-PE和SL对CD19十(Nalm-6， Raji细胞)和CD19- (Molt3， K562细胞)细胞的靶向效率。2E8-SL-PE能特异的靶向CD19高表达的肿瘤 细胞，其对CD19高表达的肿瘤细胞的靶向效率显著高于CD19低表达的肿瘤 细胞；而SL-PE对CD19高表达和CD19低表达的肿瘤细胞的靶向效率无显著 性差异。(D)激光共聚焦显微镜观察2E8-SL-PE和SL-PE对Nalm-6细胞和 Molt-3细胞的靶向差异。原始图像放大63倍，分别以0.1nm薄层切片扫描细 胞。2E8-SL-PE处理组，在Nalm-6细胞表面(核染蓝色荧光)同时可观察到红色 荧光(标记脂质体)和绿色荧光(标记2E8)，在Molt-3细胞(核染蓝色荧光)表面 基本未观察到任何荧光。SL-PE处理组与对照组，Nalm-6细胞和Molt-3细胞 (核染蓝色荧光)表面也基本未观察到任何荧光。(E)激光共聚焦显微镜观察 2E8-SL-PE在Nalm-6细胞中的内化。原始图像放大63倍，细胞分别在3toi， 4Mm, 6Wn的层面以0.mm薄层切片扫描。30分钟，仅在Nalm-6细胞表面可 探测到红色荧光；4小时，胞浆中可探测到^分红色荧光；8小时，整个胞浆 中充满均匀一致的红色荧光。
(6) MTT法检测2E8-SL-NCTD对Nalm-6细胞和Molt-3细胞的耙向杀 伤效率(图9) : (A) 2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞的抑制作 用呈明显时间和剂量的依赖性。在10PM-5(mM的浓度范围内，2E8-SL-NCTD 对CD19阳性的Nalm-6细胞72小时的抑制率(44.40%-97.17%)显著高于CD19 阴性的Molt-3细胞(7.04%-58.23%) (PO.Ol)。 (B)当NCTD的浓度为20MM时，2E8-SL-NCTD对CD19阳性的Nalm-6细胞24， 48， 72小时的抑制率分 别为18.41%，47.44%，68.13%，显著高于2E8-SL-NCTD对CD19阴性的Molt-3 细胞24， 48， 72小时的抑制率(5.99%， 10.05°/。， 13.80%)(P<0.01)。 (C) 2E8-SL-NCTD对Molt-3细胞72小时IC50值(45.90 WVO是Nalm-6细胞(14.52
MM)的3倍。
本发明涉及的参考文献
1 K6hler G Milstein C. Continuous cultures of flised cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975 Aug 7; 256(5517): 495-7.
2 Shinichi Sato and Thomas R Tedder. CD 19 Workshop Panel report. Leucocyte Typing VI. Edited by Tadamitsu Kishimoto, et al. Garland Publishing, Inc. New York & London 1997. pl33~134.
3 陈英虎，汤永民，沈红强，宋华，杨世隆，钱柏芹，徐卫群，宁泊涛.2E8-Genistein免 疫毒素耙向杀伤Nalm-6白血病作用及其机制研究.中华儿科杂志,2009， 47(1):57-61.
4 Wu JM， Ren TC. The preparation of characters of liposome containing norcnatharidin, Chin Phar J， 2001，19(40):1485陽1487
5 Iden DL, Allen TM. In vitro and in vivo comparison of immunoliposomes made by conventional coupling techniques with those made by a new post-insertion approach. Biochim. Biophys. Acta, 2001,1513(2):207-216
6 Hurwitz HI, Fehrenbacher L， Hainsworth JD, Heim W, Berlin J, Holmgren E， Hambleton J, Novotny WF, Kabbinavar F. Bevacizumab in combination with fluorouraeil and leucovorin: an active regimen for first-line metastatic colorectal cancer. J Clin Oneol， 2005，
23(15):3502-3508.
7 Zhou Y, Drummond DC, Zou H, Hayes ME, Adams GP, Kirpotin DB, Marks JD. Impact of Single-chain Fv antibody fragment affinity on Nanoparticle targeting of epidermal growth factor receptor-expressing tumor cells. J Mol Biol ，2007，371(4):934~947.本发明涉及的序列 <110>浙江大学
<120> CD19单克隆抗体免疫脂质体的制备及用途 <160> 8
<170> Patent In Version 2.1
<210> 1
<211>366
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 101 a79 c102 g
<400> 1
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCGGGACCTGAG
TCCTGCAAGGCTTCCGGGTATTCCTTCAGA
CCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGG
GCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTC
TTGCAGATCAACAACCTCMAAATGAGGAC
TTCGACGGATATTACTATGCTATGGACTAC
TCAGAG
841
CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60
AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120
ATAMCACCT ACAGTGGAGA GCCAACACAT 180
TCTTTGGAAA CCTCAGCTAG TACTGCCTAT 240
ATGGCTACAT ATTTCTGTGC AAGACGGGAT 300
TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 360
366
<210>2 <211>321 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221> <222> <223> 92 a <400>2 GA窗CCAGA ATTACTTGCA GGAAATGCTC AGATTCAGTG GAAGATGATG GGCACCMGC
71 c
TGACACAGAC AGGCAAGTGA CTAGGCTCTT GCAGTGGATC CTACTTATTA TGGAAATCAA
74 g
841
TTCATCCTAC CCACATTAAT AATATCTGGT TGGAMGGAT CTGTCAACAG A
TTGTCTGTAT AATTGGCTAG GCAACCAGTT TACACTCTCA TATTGGAGTA
CTCTAGGAGG CCTGGTATCA TGGCAACTGG GCATTACCAG CTCCGTGGAC
CAGAGTCACC GCAGAAACCA GATTCCTTCA TCTTCAGACT GTTCGGTGGA
60 120 180 240 300 321
<210>3 <211> 122 <212>
<213>人工序列
<220>
<221><222>
<223>按照大肠杆菌偏爱的密码子，设计了酶切位点和接头肽的编码hPTH(l-34)的合 成基因
<400> 3
EVKLVESGPE LKKPGETVKI SCKASGYSFR NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYSGEPTH 60
ADAFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCARRD FDGYYYAMDY WGQGTSVTVS 120
SE 122
<210>4 <211> 107 <212>
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 4
DIQMTQTSSY LSVSLGGRVT ITCKASDHIN NWLAWYQQKP GNAPRLLISG ATSLATGIPS 60 RFSGSGSGKD YTLSITSLQT EDDATYYCQQ YWSTPWTFGG GTKLEIK 107
<210>5
<211>20
<212>
<213>人工序列 <220> <221> <222>
<223>重链可变区5'引物序列 <400> 5
GAG GTG AAG CTG GTG GAG TC
<210>6
<211>39
<212>
<213>人工序列 <220> <221> <222>
<223>重链可变区3'引物序列 <400> 6
GGA GAC GAG GGG GAA MG CTT TGG GAA GGA CTG ACT CTC
<210>7
<211>21
<212><213〉人工序列 <220> <221> <222〉
<223>轻链可变区5'引物序列 <400> 7
GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT
<210> 8
<211>21
<212>
<213>人工序列 <220> <221> <222>
<223>轻链可变区3'引物序列 <400> 8
GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
权利要求
1.一种CD19单克隆抗体免疫脂质体，通过以下步骤制备(1)CD19单克隆抗体ZCH-4-2E8的制备基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法制备，所述单抗重链可变区基因编码的氨基酸具有SEQ ID NO 3，所述单抗轻链可变区基因编码的氨基酸具有SEQ ID NO 4序列；(2)2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体2E8-SL-NCTD的制备首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体，其中大豆卵磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺按起始摩尔比为2∶1∶0.01，去甲斑蝥素与大豆卵磷脂的质量比为1∶20w/w，高效液相检测去甲斑蝥素的包封率达46.5±2.21％。
2. 根据权利要求1所述的一种CD19单克隆抗体免疫脂质体，其特征在 于，步骤(2)所述的制备采用后插技术，将步骤(1)的抗人CD19单抗与去甲斑蝥素脂质体连接，其中大豆卵磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇200()-磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-聚乙二醇2,.二硬脂酸磷脂酰乙醇胺起始摩尔比为2 : 1 : 0.008 : 0.002，当起始的CD19单抗与胶束中Mal-PEG2,-DSPE按摩尔比1:50 反应时，CD19单抗获得的最佳连接率为58.70±3.32%或每个脂质体上含有9 个CD19单抗，为IgM抗体分子，粒径测定仪检测所述脂质体的平均粒径为 118.32士2.03跳
3. 根据权利要求1所述的一种CD19单克隆抗体免疫脂质体在制备特异 性耙向杀伤B淋巴细胞白血病及其干细胞药物中的应用。
4. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述B淋巴细胞为白血病 细胞株Nalm-6细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞和CD19抗原阴性的T细 胞系白血病细胞株Molt-3、急性红白血病细胞株K562细胞。
全文摘要
本发明提供一种CD19单克隆抗体去甲斑蝥素免疫脂质体，首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体，其中大豆卵磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇<sub>2000</sub>-磷脂酰乙醇胺按起始摩尔比为2∶1∶0.01，去甲斑蝥素免疫脂质体与大豆卵磷脂的质量比为1∶20，高效液相检测NCTD的包封率达(46.5±2.21)％。研究证实，2E8-SL-PE能特异性地与Nalm-6和Raji细胞结合，阳性率分别为89.44％和88.73％，而几乎不与Molt-3和K562细胞结合，后两者的阳性率分别仅为1.95％和1.39％，说明该免疫脂质体具有明显的靶向识别作用。可在制备特异性靶向杀伤B淋巴细胞白血病及其干细胞药物中的应用。
文档编号A61K9/127GK101612126SQ20091010076
公开日2009年12月30日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者张晶樱, 汤永民 申请人:浙江大学