专利名称：以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法，特别涉 及通过对聚偏氟乙烯中空纤维膜的亲水化改性和接枝氨基酸配基，制备应 用于去除血浆中内毒素的聚偏氟乙烯亲和膜的方法。
背景技术：
当前，内毒素血症存在着患病率高、病死率高、治疗费用高的三高现 象，已经构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。内毒素
(endotoxin)是革兰阴性菌细胞壁外膜的结构成分之一，其化学本质为脂多 糖(lipopolysaccharide， LPS)。由于LPS所致细胞活化的胞内信号转导极为 复杂，LPS与炎症反应细胞相应受体结合后启动的瀑布效应一旦发生，将难 以有效地控制。
近年来虽然大量广i普、高效抗生素的应用为临床治疗感染性疾病提供 了有力的措施，但并没有从根本上改变脓毒症患者高病死率的现状。原因 在于，抗生素不能遏制由内毒素与机体相互作用引起的全身失控性炎症反 应，反有可能在杀灭细菌的同时引起内毒素释放，从而加重炎症反应。同 时还存在着用药量大、成本高、毒性大等方面的缺陷，影响了其在临床的 进一步应用。
国内夕卜很多实验表明，选用具有选择性高、分离速度快、能耗低、易 放大等特点的亲和技术来去除内毒素不失为一种有效方法。RomiLamb等 在壳聚糖中加入硅石粒子制备壳聚糖微孔共混膜吸附清除配制的人免疫 球蛋白G (IgG)溶液中的内毒素(Machado RL， et al.， Process Biochemistry, 41(11):2252-2257(2006))。 Sundberg等通过固定化金属亲和层析(层析) 技术去除蛋白质中的内毒素(U.S. Pat. 20050186218)。亲和膜分离是将亲 和色语与膜分离结合起来的一种分离技术，具有选择性高、分离速度快、 产物活性高、易放大等特点，国内外对此技术的应用研究十分活跃，涉及 范围很广。以聚偏氟乙烯膜为载体的血液灌流用内毒素吸附剂未见报道。
发明内容
本发明提供了一种以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法，
通过对聚偏氟乙烯(PVDF)膜亲水化改性，接枝氨基酸配基，制备出性 能稳定，生物相容好，内毒素去除率高的PVDF亲和膜。可用于全血灌流， 也可用于血浆灌流。
一种以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法，其步骤为
1) 基膜的预处理
将PVDF中空纤维膜用质量百分浓度为30%的乙醇润洗后，用去离子 水浸泡，以洗去膜表面的杂质；
2) 亲水化改性
将KMn04和KOH的混合溶液在60-80°C下用恒流泵送入PVDF中空 纤维膜组件反应30-卯min，然后用H2S04和NaHS03的混合溶液还原;
KMn04和KOH的混合溶液中KMn04的浓度为40-80 g/l， KOH的浓 度为3-5mol/l;H2S04和NaHS03的混合溶液中H2S04的浓度为50-100 g/l， NaHS03的浓度为50-100 g/1;
3) 羟乙基纤维素(HEC)处理
还原处理后的PVDF中空纤维膜用NaOH和HEC混合溶液在80-90 。C处理10-30min，以增加膜表面的亲水性；然后于80-90。C煤干，干燥后 用0.5-2mol/l的Na2C03溶液在80-9(TC条件下沖洗，洗去膜表面未反应的 HEC;
NaOH和HEC混合溶液中NaOH的浓度为l-3mol/l, HEC的浓度为 10-30 g/1;
4) 第一次活化
经步骤3 )处理的PVDF中空纤维膜用环氧氯丙烷(ECH)与NaOH 的混合溶液在50-70。C条件下活化，活化后用去离子水冲洗；
所述的环氧氯丙烷与NaOH的混合溶液为按照环氧氯丙烷浓度为 lmol/1的NaOH溶液的体积比为1: 3~6配制的混合溶液；
5) 键合己二胺间隔臂
第一次活化后的PVDF中空纤维膜于50-70。C下与40-80 g/1的己二胺 (HDA)反应2-3h,反应后用去离子水冲洗；6) 第二次活化
经步骤5 )接上间隔臂的PVDF中空纤维膜用环氧氯丙烷(ECH)与 NaOH的混合溶液在50-70。C条件下再次活化；
所述的环氧氯丙烷与NaOH的混合溶液为按照环氧氯丙烷浓度为 lmol/1的NaOH溶液的体积比为1: 3 6配制的混合溶液；
7) 键合氨基酸配基
第二次活化后的PVDF中空纤维膜与2-8g/l的氨基酸溶液(0.2mol/l pH为7.2的磷酸盐緩冲液为溶剂)在40-50。C条件下反应20-24h，得到接 枝氨基酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜。
所述的制备方法中，氨基酸为丝氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、 聚赖氨酸或谷氨酰胺中的一种。内毒素分子由于具有磷酸基团而带负电 荷，因此可以用带正电荷的吸附剂来去除。氨基酸的氣基和羧基可以分别 结合内毒素分子上的阴离子和疏水基团。
本发明方法制备的聚偏氟乙烯亲和膜的氨基酸的接枝量为 150 250mg/g膜。
将用以上方法制备的聚偏氟乙烯亲和膜应用于去除血浆中内毒素，使 用该亲和膜的膜组件进行血液灌流，包括下述步骤室温下，内毒素血症 患者的血液泵入膜组件中，流速0.5-2.0 mL/min，流出液不循环。
本发明所述的聚偏氟乙烯亲和膜动态吸附内毒素血症患者的血浆，对 内毒素的清除率可达61.9%,吸附效率较高。可用于临床全血灌流清除血 液中的内毒素，治疗内毒素血症等疾病。
本发明的优点是
1) 使用聚偏氟乙烯为载体，材料的物理化学性质稳定，且具有较好 的血液相容性。
2) 以聚偏氟乙烯中空纤维膜填充至膜组件中，使得膜的改性与接枝 配基以及血液灌流的过程简易方便，且由于膜的比表面积大，可以大大的 提高配基的接枝率。且由于膜组件自身的优点，工艺易于放大，同时可以 串联，满足临床应用需求。
3) 以氨基酸为配基，同时含有胺基和羧基两个官能团，提高了吸附 材料对内毒素的特异性吸附。图l氨基酸亲和膜去除血浆中内毒素的实验流程其中l-血液；2-泵；3-流量计；4-亲和膜组件；5-恒温水浴；6-收集液；
图2实施例1丝氨酸亲和膜吸附内毒素穿透曲线。
具体实施例方式
膜组件中含PVDF中空纤维膜16根，膜的质量为0.42g,有效长度 16.70cm,有效面积19.93cm2。
试验所接触到的玻璃仪器于400QC干烤4小时，塑料器皿在30% H202中浸泡4小时除热源。亲和膜组件用含20%乙醇的O.lmol/LNaOH， 1.5mol/LNaCl,无热原7jc依次沖洗2小时除热源。
实施例1
1) 将PVDF中空纤维膜用30。/。乙醇润洗30min后，用去离子水浸泡 lh,以洗去膜表面的杂质。
2) 将40g/l的KMn04和3mo1/1的KOH混合液在80。C下用恒流泵送 入PVDF中空纤维膜组件反应30min,然后用60g/l的112804和60g/l的 NaHS03混合液还原。
3) 还原处理后的膜用lmo1/1 NaOH和10g/l的HEC混合液在9(TC处理 15min,以增加膜表面的亲水性。置于9(TC恒温热风干燥箱内烘干，干燥 后用0.5mol/l的Na2C03溶液在9(TC条件下冲洗10min,洗去PVDF膜表 面未反应的HEC。
4) 亲水化改性的膜用环氧氯丙烷(ECH) : lmol/lNaOH体积比为1: 4的混合液在60'C条件下活化，并用去离子水冲洗lh。
5) 然后于50。C下与50g/l的己二胺(HDA)作用2h，并用去离子水 冲洗lh。
6) 接上间隔臂的PVDF膜用环氧氯丙烷(ECH) : lmoI/lNaOH体积 比为1: 4的混合液在60。C条件下再次活化。
7) 与3g/1的丝氨酸溶液(0.2mol/l pH为7.2的磷酸盐緩沖液为溶剂) 在45。C条件下反应24h,得到接枝丝氨酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜。
按照
图1所示的方法，人血浆1由泵2经流量计3打入亲和膜组件4中，流速1.0 mL /分钟，亲和膜组件4外设有恒温水浴5。每3分钟取收 集液6测内毒素的含量，绘制穿透曲线，见图2,流出液不循环。通过测 定内毒素的起始浓度和穿透曲线，可以得到内毒素去除效率，如表1所示。 _表1实施例1所制备亲和膜的性能_
配基 接枝量(mg氨基粉g膜) 内毒素去除率(％)
丝氨酸 176 61.9
实施例2
1) 将PVDF中空纤维膜用300/o乙醇润洗40min后，用去离子水浸泡 lh，以洗去膜表面的杂质。
2) 将50g/l的KMn04和3mo1/1的KOH混合液在60°C下用恒流泵送入 PVDF中空纤维膜组件反应30min，然后用60g/l的H2S04和60g/l NaHS03
混合液还原。
3) 还原处理后的膜用1.5mol/l NaOH和15g/l的HEC混合液在80。C处 理10min,以增加膜表面的亲水性。置于80'C恒温热风干燥箱内烘干，干 燥后用0.5mol/l的Na2C03溶液在80。C条件下沖洗10min,洗去PVDF膜 表面未反应的HEC。
4) 亲水化改性的膜用环氧氯丙烷(ECH) : lmol/lNaOH体积比为1: 3的混合液在5(TC条件下活化，并用去离子水冲洗lh。
5) 然后于60。C下与40g/l的己二胺(HDA)作用2h，并用去离子水 冲洗lh。
6) 接上间隔臂的PVDF膜用环氧氯丙烷(ECH): lmo1/1 NaOH体积比 为1: 3的混合液在5(TC条件下再次活化。
7) 与2g/1的丝氨酸溶液(0.2mol/l pH为7.2的磷酸盐緩冲液为溶剂) 在40。C条件下反应20h,得到接枝丝氨酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜。
对血浆中内毒素的去除实验步骤同实施例1，配基接枝密度和内毒素 去除效率见表2。表2实施例2所制备亲和膜的性能
配基接枝量(mg氨基酸/g膜)内毒素去除率(％)
丝氨酸15255.8
实施例3
步骤1-6同实施例1
7)与3g/1的天冬酰胺溶液(0.2mol/l pH为7.2的磷酸盐緩冲液为溶 剂)在45t:条件下反应24h,得到接枝天冬酰胺配基的聚偏氟乙烯亲和膜。
天冬酰胺配基的聚偏氟乙烯亲和膜对血浆中内毒素的去除实验步骤 同实施例l,配基接枝密度和内毒素去除效率见表3。
表3实施例3所制备亲和膜的性能
配基接枝量(mg氨基^/g膜)内毒素去除率(％)
天冬酰胺16245,3
实施例4
步骤1-6同实施例1
7)与3g/1的精氨酸溶液(0.2mol/l pH为7.2的磷酸盐緩冲液为溶剂) 在45。C条件下反应24h，得到接枝精氨酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜。
精氨酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜对血浆中内毒素的去除实验步骤同 实施例l,配基接枝密度和内毒素去除效率见表4。
表4实施例4所制备亲和膜的性能
配基接枝量(mg氨基趣!/g膜) 内毒素去除率(°/。)
精氨酸23252.权利要求
1、一种以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)基膜的预处理将聚偏氟乙烯中空纤维膜用质量百分浓度为30％的乙醇润洗后，用去离子水浸泡；2)亲水化改性将KMnO4和KOH的混合溶液在60-80℃下送入聚偏氟乙烯中空纤维膜组成的膜组件，反应30-90min，然后用H2SO4和NaHSO3的混合溶液还原；3)羟乙基纤维素处理还原处理后的聚偏氟乙烯中空纤维膜用NaOH和羟乙基纤维素混合溶液在80-90℃处理10-30min；然后于80-90℃烘干，干燥后用0.5-2mol/l的Na2CO3溶液在80-90℃条件下冲洗；4)第一次活化经步骤3)处理的聚偏氟乙烯中空纤维膜用环氧氯丙烷与NaOH的混合溶液在50-70℃条件下活化，活化后用去离子水冲洗；5)键合己二胺间隔臂第一次活化后的聚偏氟乙烯中空纤维膜于50-70℃下与40-80g/l的己二胺反应2-3h，反应后用去离子水冲洗；6)第二次活化经步骤5)键合己二胺间隔臂的聚偏氟乙烯中空纤维膜用环氧氯丙烷与NaOH的混合溶液在50-70℃条件下再次活化，活化后用去离子水冲洗；7)键合氨基酸配基第二次活化后的聚偏氟乙烯中空纤维膜与2-8g/l的氨基酸溶液在40-50℃条件下反应20-24h，得到接枝氨基酸配基的聚偏氟乙烯亲和膜，所述的氨基酸溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于氨基酸的接枝量为 150 250mg/g膜。
3、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的KMn04和KOH的混合溶液中KMn04的浓度为40-80g/l, KOH的浓度为3-5mol/l。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的H2SCXt和 NaHS03的混合溶液中H2S04的浓度为50-100g/l， NaHS03的浓度为 50-100g/l。
5、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的NaOH和羟 乙基纤维素混合溶液中NaOH的浓度为l-3mol/l,羟乙基纤维素的浓度为 10-30g/l。
6、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的环氧氯丙烷 与NaOH的混合溶液为按照环氧氯丙烷浓度为lmol/1的NaOH溶液的体 积比为1: 3 6配制的混合溶液。
7、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的氨基酸为丝 氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、聚赖氨酸或谷氨酰胺。
8、 如权利要求1-7任一所述的制备方法制备的聚偏氟乙烯亲和膜在 去除血浆中内毒素中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种以氨基酸为配基的聚偏氟乙烯亲和膜的制备方法，对聚偏氟乙烯中空纤维膜亲水化改性后，接枝氨基酸配基，制成亲和膜，氨基酸的接枝量为150～250mg/g膜。本发明同时公开了该亲和膜在去除血浆中内毒素中的应用，以动态吸附的方式去除血浆中内毒素。本发明方法制备的聚偏氟乙烯亲和膜性能稳定，生物相容好，内毒素去除率高，可用于全血灌流，也可用于血浆灌流。
文档编号A61M1/34GK101596422SQ20091010056
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日
发明者茜 叶, 林 张, 堃 徐, 徐秋萍, 陈欢林, 曼 黄 申请人:浙江大学