一种快速筛选制备小分子类物质单克隆抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速筛选制备小分子类物质单克隆抗体的改良方法。主要包括三个抗体制备条件的变化：1)具用1/10～50脾脏用于细胞融合制备小分子类物质单克隆抗体；2)脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合时混合的比例为1∶1；3)融合细胞株筛选方法采用直接竞争ELISA(一步法)，通过此方法可以一步得到与小分子类物质有阳性反应的融合细胞株。本发明建立了一种可通过直接竞争ELISA(一步法)筛选对小分子类物质有阳性反应的杂交瘤细胞株，解决了传统筛选方法筛选量大，筛选周期长的问题，大大降低了小分子类物质单克隆抗体制备的周期和成本。
【专利说明】
一种快速筛选制备小分子类物质单克隆抗体的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种快速筛选制备小分子类物质单克隆抗体的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体技术，是指将某种抗原诱导产生的特异性B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经融合，形成杂交瘤细胞，并分离筛选出单个杂交瘤细胞，再将其扩增，最终分离纯化制得单克隆抗体。杂交瘤细胞具有双重特性，既能如骨髓瘤细胞般持续繁殖，又能如B淋巴细胞般分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体，即单克隆抗体。尽管单克隆抗体越来越广泛地应用于各个研究领域，但是自1975年问世以来，制备单克隆抗体一直沿用传统方法，成为一经典技术发展的瓶颈。制备单克隆抗体包括抗原制备，动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、冻存复苏、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间。其中杂交瘤细胞的筛选这一步骤最为耗时。
[0003]目前筛选小分子类物质单克隆抗体杂交瘤细胞，都是采用两步法，先通过酶联免疫筛选出对小分子与载体蛋白复合物有阳性反应的单克隆抗体，再通过竞争抑制法筛选出对小分子抗原有阳性反应的单克隆抗体。此方法耗时且繁琐，而且传统的单克隆制备方法细胞融合多数采用骨髓瘤细胞:脾细胞=I: 5-10之间的比例融合，通过一次融合，一般会有数千上万孔杂交瘤细胞，融合较好的时候100 %的孔里都有多克隆杂交瘤细胞生长，但是最终只有不到10%的孔里面含有目标杂交瘤细胞，所以要从如此多的杂交瘤细胞中筛选出目标杂交瘤细胞，其筛选量是非常巨大的。一轮筛选通常需要进行几十次间接elisa实验，花费数周时间，这大大增加了单克隆抗体的制备周期，也增加了生产成本。
【发明内容】
[0004]针对上述现有小分子类物质单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种优化的细胞融合方式和直接竞争ELISA( —步法)筛选杂交瘤细胞的方法，此方法可以大大缩短了小分子类物质单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术周期。
[0005]本发明一种快速筛选制备小分子类物质单克隆抗体(以苯乙醇胺A为例)的方法，包括如下步骤:
[0006]I)用纯化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠；
[0007]2)取免疫完成后的小鼠脾脏，分离小鼠的脾脏细胞，等分为10-50份，液氮保存备用；取一份脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (I: I)融合，并在含有HAT的培养基中进行选择性培养；
[0008]3)直接竞争ELISA(—步法)筛选出对苯乙醇胺A有阳性反应的杂交瘤细胞株(图1)，并分别进行保存；
[0009]4)用阳性的杂交瘤细胞株制备单一的抗苯乙醇胺A单克隆抗体。
[0010]本发明通过优化的细胞融合方式和一步法杂交瘤细胞筛选的方法，大大地缩短了制备小分子类物质单克隆抗体的周期，大大地节约时间和成本。
【附图说明】
[0011]图1为本发明一步法(直接竞争ELISA)筛选杂交瘤细胞株的示意图。
[0012]图2为本发明方法制得的抗苯乙醇胺A抗体的抑制ELISA检测结果
【具体实施方式】
[0013]实施例1实验动物免疫
[0014]用纯化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原皮下多点注射免疫6-8周雌性BALB/C鼠(每只小鼠200 μ I)，首次免疫注射时，分别100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100 μ L不完全佐剂乳化，同样方法注射。两周后取血测定抗体的效价。
[0015]实施例2抗苯乙醇胺A单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
[0016]经腹腔注射苯乙醇胺A-BSA结合物加强免疫小鼠，4天后，将小鼠处死。取免疫完成后的小鼠脾脏，分离小鼠的脾脏细胞，等分为10-50份，液氮保存；取一份脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (I: I)融合，接种4-10个96孔细胞培养板，然后在含HAT的培养基进行选择培养。
[0017]实施例3抗苯乙醇胺A单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选
[0018]将50 μ I溶于CB缓冲液浓度为100纳克每毫升的苯乙醇胺A-OVA结合物加到96孔酶标板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天将苯乙醇胺A-牛血清白蛋白结合包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗两次。然后用封闭液(I % BSA/洗液)室温封闭2小时。将封闭液倒掉，然后实验组将50 μ I苯乙醇胺A溶液(浓度为10 μ g/ml)和50 μ I实施例2得到杂交瘤细胞培养液分别加到96孔板，对照组用50 μ I不含苯乙醇胺A的溶剂和50 μ I杂交瘤细胞培养液加到96孔板中。室温孵育I小时，将上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育I小时，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB显色反应底物，室温显色30分钟后2mol/LH2SO4终止，肉眼即可观察阳性结果，实验组无色，对照组黄色即可判定此杂交瘤细胞株为抗苯乙醇胺A特异性的阳性杂交瘤细胞株。
[0019]实施例4杂交瘤细胞的克隆化培养
[0020]单克隆杂交瘤细胞计数，经过系列的稀释制备浓度为I个细胞/200 μ I的单细胞悬液。将200 μ I的单细胞悬液加到96孔细胞培养板中(I细胞/0.2ml/孔)。在37°C，5%二氧化碳的细胞培养箱培养。约10天左右选择单克隆孔，检测抗体，选择抗体OD值高、细胞生长好的克隆，进行扩大培养、建系、保存。
[0021]实施例5抗苯乙醇胺A单克隆抗体的制备和纯化
[0022]腹腔注射成年BALB/C鼠0.1ml不完全福氏佐剂，I周后腹腔注射实施例4得到的生长状态良好的抗苯乙醇胺A单克隆杂交瘤细胞株(16个细胞/小鼠)，2-4周左右小鼠腹部可见明显膨大，用注射器吸取腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵饱和沉淀后，再用蛋白A或蛋白G亲和层析柱继续纯化。
[0023]实施例6抗体效价的测定
[0024]将50 μ I溶于CB缓冲液浓度为10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA结合物加到96孔酶标板的小孔中，4°C放置过夜。第二天将苯乙醇胺A-OVA结合包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗两次。然后用封闭液(1% BSA/洗液)室温封闭2小时。将封闭液倒掉，然后将抗体稀释100倍后，按1: 4的比例系列稀释，将ΙΟΟμΙ各个稀释度的抗体加到96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育I小时，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB显色反应底物，室温显色30分钟后2mol/L H2SO4终止，在波长为450纳米读光吸收值。OD值大于阴性对照2.1倍的最高的稀释倍数即为抗体的效价。实验结果表明本发明所述抗苯乙醇胺A抗体的效价为102400。
[0025]实施例7抗体亲和力测定
[0026]将50 μ I溶于CB缓冲液浓度为10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA结合物加到96孔酶标板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天将苯乙醇胺A-牛血清白蛋白结合包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗两次。然后用封闭液(1% BSA/洗液)室温封闭2小时。先将抗苯乙醇胺A抗体与不同浓度的苯乙醇胺A孵育，然后将该孵育液加到96孔板中，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育I小时，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB显色反应底物，室温显色30分钟后2mol/L H2SO4终止，在波长为450纳米读光吸收值。抗体的亲和力用公式A。/ (A0-A) = Ι+Κ/a。计算，A。为苯乙醇胺A浓度为O时的OD值，A为苯乙醇胺A浓度为a。时的OD值，K为亲和常数的倒数。实验结果表明本发明所述的抗苯乙醇胺A抗体的亲和力大约为1.6 X 10 SM。
[0027]实施例8苯乙醇胺A抗体IC4。的测定
[0028]将50 μ I溶于CB缓冲液浓度为50ng/ml的苯乙醇胺A-OVA结合物加到96孔酶标板的小孔中，4°C放置过夜。第二天将苯乙醇胺A-OVA结合包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗两次。然后用封闭液(I % BSA/洗液)室温封闭2小时。将封闭液倒掉，将50 μ I不同稀释度(0.01-100ng/ml，每一浓度均作三复孔)的苯乙醇胺A溶液，然后加入50 μ 11: 10000倍稀释的抗体，混匀。室温孵育I小时，将上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育I小时，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB显色反应底物，室温显色30分钟后2mol/L H2SO4终止，在波长为450nm读光吸收值。以竞争物苯乙醇胺A竞争浓度为横坐标，以加入竞争物苯乙醇胺A的检测孔的OD450nni(B)与未加竞争物的对照孔的OD450nni(B。)的比例，称为结合率)为纵坐标制作竞争抑制曲线，得到IC5。。实验结果表明本发明所述抗苯乙醇胺A抗体的IC5。为5ng/ml (图 2)。
【主权项】
1.用1/10?50脾脏用于细胞融合制备小分子类物质单克隆抗体。2.脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合时混合的比例为1:1。3.融合细胞株筛选方法采用直接竞争ELISA(—步法)，通过此方法可以一步得到与小分子类物质有阳性反应的融合细胞株。4.根据权利1-3所述的3个抗体制备条件同样适合于青霉素等其它小分子类物质。
【文档编号】C12N5/20GK105884899SQ201510007043
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月8日
【发明人】张伟
【申请人】成都酷赛生物技术有限公司, 上海酷赛生物技术有限公司