抗p16单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可以识别人P16蛋白质分子的单克隆抗 体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] pl6分子定位于细胞核及细胞质，能特异性的结合细胞分裂周期（CellDivision Cycle)关键酶⑶K4或⑶K4与细胞周期素（Cyclin)的复合体，参与Gl-S转换的调控，抑 制⑶K4的活性，阻止细胞进入S期，对RB基因控制的细胞增殖周期中起负调节作用。一旦 P16基因缺失、突变等导致功能缺失，则不能抑制CDK4,最终导致细胞进入恶性增殖，加速 肿瘤发生。因为P16通过与cyclinD竞争结合⑶K4、⑶K6抑制cyclinD/⑶K4的活性，当 去除P16的抑制作用后，将使细胞异常增殖，过度激活周期蛋白和/或抑制蛋白的失活，都 会导致⑶Ks的过度作用，导致细胞非正常增生。而一旦pl6失活，则会引起细胞恶性增殖。 细胞中，P16蛋白的表达通常受到另两种抑癌蛋白：p53和RB的调控，处于低水平状态。
[0003] 研究表明，pl6异常表达可用于各种肿瘤的研究，如卵巢癌（袁碧波，张士伟，孙保 存，刘容珍，卵巢肿瘤P16蛋白的表达及意义，中国肿瘤临床，2000,4(27) :265-267)、肺腺 癌（陆金友，汤一珍，刘丽华，孟刚，肺腺癌组织P16蛋白表达与其预后的关系，安徽医科大 学学报，1999, 6 (34) :452-454)、直肠癌（张远，王小强，王金柱，白旭升，直肠癌pl6蛋 白表达的检测及其意义，陕西肿瘤医学，2001，6 (9) : 105-107)、乳腺癌（崔素萍，王花丽，彭 伟，刘海静，侯琳，张波，乳腺癌组织P16异常表达的相关分析，北京大学学报，2012, 5 (44): 755-759)。目前研究表明pl6在高级别宫颈上皮内肿瘤和高危型HPV感染的肿瘤中高表达 (齐朝阳，陈艳，曾鸿，高宇琳，郭红梅，宫颈上皮内肿瘤pl6、p53、Ki67、p63的表达与HPV感 染及其临床意义，实用医学杂志，2011，27 (20) :3639-3640)。pl6蛋白分子量为16kDa左 右，选择不同的抗原进行免疫，制备出不同结合特性的抗体，对表达抗原细胞具有不同的识 别能力和模式。鉴于P16分子在肿瘤病理研究中的重要性，已有不同的抗体制备用于不同 免疫学方法。
[0004]
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可被广泛应用、可准确诊断各 种肿瘤类型的抗P16单克隆抗体。
[0006] 本发明的技术手段为：
[0007] 本发明对pl6分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、 组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于 重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端 和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达 质粒载体pET_32a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免 疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组pl6筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性 杂交瘤细胞系。
[0008] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgGl型单克隆抗体，亲和常数 为1.92X109。免疫印记（Westernblotting)实验显示该抗体能特异识别重组的pl6蛋白 以及表达P16分子的肿瘤细胞。
[0009] 为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：
[0010] 一种抗Pie单克隆抗体，抗P16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQID No. 2所示的DNA序列所编码，抗pl6单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQIDNo. 3 所示的DNA序列所编码；所述抗pl6单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo. 4 所示的氨基酸序列，所述P16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo. 5所示的 氨基酸序列。
[0011] 优选的，所述抗P16单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系30859-S17分泌。
[0012] 优选的，获得所述抗pl6单克隆抗体时免疫小鼠用的抗原为重组pl6抗原蛋白，所 述重组P16抗原蛋白由SEQIDNo. 1的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达而获得。
[0013] 优选的，所述重组pl6抗原蛋白包括以下一个或几个部分：促使分泌表达的信号 肽序列、具有抗原性的P16片段和用于重组蛋白的蛋白标签。
[0014] 优选的，所述信号肽序列为大肠杆菌果胶酶信号肽序列，所述P16片段为411-750 位氨基酸蛋白序列，所述蛋白标签为5-7个组氨酸。
[0015] 优选的，所述抗pl6单克隆抗体为小鼠IgGl亚型单克隆抗体。
[0016] 优选的，所述抗pl6单克隆抗体能够识别重组pl6抗原蛋白和肿瘤细胞表面的pl6 分子。
[0017] 优选的，制备以上所述的抗pl6单克隆抗体的方法，包括以下几步：
[0018] 第一步免疫小鼠：先对pl6分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、 组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于 重组表达，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标 签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET_32a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可 溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠；
[0019] 第二步获得杂交瘤细胞系：经细胞融合、重组P16筛选克隆，获得高效分泌单克隆 抗体的阳性杂交瘤细胞系；
[0020] 第三步获得单克隆抗体：将第二步中的杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备， ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体；
[0021] 第四步鉴定单克隆抗体的亚类：用ELISA技术测定第三步中的单克隆抗体的亚类 为IgGl型单克隆抗体，亲和常数为1. 92XIO9;
[0022] 第五步免疫印迹：通过免疫印记实验显示该抗体能特异识别重组的pl6蛋白和表 达P16分子的肿瘤细胞。
[0023] 优选的，所述抗pl6单克隆抗体用于检测肿瘤和正常组织细胞中的pl6表达情况， 检测方法包括以下一种或几种：免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法。
[0024] 优选的，所述抗pl6单克隆抗体应用在免疫组化病理诊断剂中。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 其一、本发明获得的杂交瘤（30859-S17)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋 白P16分子和表达pl6的淋巴细胞，能够检测高表达pl6蛋白的皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、 黑素瘤、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌等多种肿瘤组织。
[0027] 其二、本发明获得的杂交瘤（30859-S17)为一种IgGl类抗体，与pl6蛋白的结合 有极强特异性和敏感性。
[0028] 其三、本发明获得的杂交瘤（30859-S17)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化 学（IHC)、免疫印记（Westernblotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性 和灵敏度高。
[0029] 其四、本发明细胞株制备的抗体在平滑肌瘤、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、食管癌、宫颈 癌的诊断中特异性、敏感性整体基本同对照抗体相当，且在表达强度上稍强于对照抗体。因 此，本发明的P16单克隆抗体在检测诊断方面可被广泛应用，可准确诊断各种肿瘤类型。
【附图说明】
[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中 所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他的附图。
[0031] 图1 :纯化的pl6重组抗原蛋白图。
[0032] 其中，1，2为表达产物300mM咪唑洗脱的结果，Marker为分子量蛋白，表达产物为 GST和pl6的融合蛋白，分子量约为43kDa，使用12%SDS-PAGE凝胶。
[0033] 图2 :30859_S17抗体对肿瘤细胞的识别特性和实际应用效果图。
[0034] 其中，单克隆抗体30859-S17对Hela细胞制备物的的免疫印迹检测结果，Marker 为分子量标记，30859-S17单克隆抗体可特异性识别Hela细胞中分子量大小约为16kDa的 条带，具有很高的特异性。
[0035] 图3 :pl6单克隆抗体的免疫组织化学检测结果图中的对照抗体E6H4。
[0036] 图4 :pl6单克隆抗体的免疫组织化学检测结果图中的pl6抗体。
[0037] 其中，应用纯化的本发明pl6抗体同商品化抗体E6H4在组织芯片上进行免疫组织 化学检测，左为对照抗体E6H4,右为本发明pl6抗体。本抗体的敏感性、特异性同对照抗体 一致，强度稍强于对照抗体。
【具体实施方式】
[0038]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 实施例
[0040] 第一步：重组P16融合蛋白的制备
[0041] 一、基因克隆
[0042] pl6单克隆按照Uniprot数据库中登录号为P427712的蛋白质序列及对应 Genbank中NP_0