黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于鱼类免疫学技术领域，具体涉及黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是我国常见的一种重要的小型经济鱼类，因 其肉质鲜嫩、少细刺，深受消费者喜爱。我国黄颡鱼大规模养殖已有10余年历史，主要集中 在两湖及长三角地区。随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断提高，疾病问题日益凸 显，其中以细菌性疾病为主。在保护水环境和食品安全的高要求之下，免疫预防成为疾病防 治的最佳手段，疫苗是其典型代表。现阶段缺乏有效的黄颡鱼免疫效果评价体系，而利用黄 颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体对免疫后抗体水平变化规律进行分析，可以准确的评价疫苗效 果，因此，对黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的研究在疫苗的开发应用中具有重要意义。目前 未见关于黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株，并由该杂交瘤细胞株所产生的黄颡鱼免 疫球蛋白的单克隆抗体。
[0004] 本发明的另一个目的是提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法。
[0005] 本发明的再一目的提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的用途及其用法。
[0006] 为实现目的之一，本发明采用的技术方案是:一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体， 所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株F6-F2,保藏单位为：中国典型培养物保藏中 心，保藏单位地址为：中国武汉省武汉大学;保藏号为:CCTCC NO: C2015152，保藏日期为： 2015年9月13日的杂交瘤细胞株产生。
[0007] 为实现目的之二，本发明采用的技术方案是:一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克 隆抗体制备方法，包括如下步骤:将黄颡鱼血清经盐析法和亲和柱层析法纯化得到黄颡鱼 免疫球蛋白；以纯化的黄颡鱼免疫球蛋白免疫BALB/c小鼠；融合免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤 细胞;经免疫学方法检测，筛选出分泌黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞F6-F2; 其所分泌的抗体即为黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体。
[0008] 所述的盐析法和亲和柱层析法是将黄颡鱼血清经饱和硫酸铵（SAS)分级盐析沉 淀后获得粗提液，再将粗提液透析后过Protein A亲和层析柱进行纯化。
[0009] 所述的免疫学方法是间接酶联免疫吸附法。
[0010] 为实现目的之三，本发明采用的技术方案是:一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克 隆抗体用于对黄颡鱼疫苗免疫效果进行检测评价，所采用的方法是:利用所述黄颡鱼免疫 球蛋白单克隆抗体建立三抗体夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)。
[0011] 本发明优点在于:制备了黄颡鱼免疫球蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤 细胞株，建立了三抗体夹心酶联免疫吸附法，能够对多种疫苗免疫效果进行评价，为疫苗的 开发应用奠定基础。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例1所提供的黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的检测黄颡鱼鲇鱼爱德华 氏菌强毒株灭活疫苗和弱毒株活疫苗不同方式免疫的血清特异性抗体水平的结果。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1: 一、黄颡鱼免疫球蛋白的提取 黄颡鱼血清的采集： (D健康黄颡鱼尾静脉采血，室温静置lh，4°C过夜，次日4000r/ min离心15min，取上清 液，-80 °C保存备用。
[0014] 黄颡鱼免疫球蛋白的分离、纯化： ?'?Η包和硫酸铵（SAS)盐析法:黄颡鱼血清加等体积生理盐水稀释后，缓慢加入pH7.0 的饱和硫酸铵至30%饱和度，4°C静置过夜，10000r/min离心30min，取上清继续加入饱和硫 酸铵至最终饱和度为50%，同上处理，收集沉淀，沉淀溶解于0.02mol/L PBS(PH7.4)，再经 PBS 4°C透析脱盐，获得黄颡鱼免疫球蛋白粗提液，-80 °C保存备用。
[0015] ③Protein A亲和层析柱纯化：取黄颡鱼免疫球蛋白粗提液l.OmL，与HiTrap Protein A HP柱4°C结合3-4h;用(h02mol/L ρΗ7·4 PBS以 1.0-1.5mL/min流速洗脱未结合 蛋白至0D28q〈0.01;用0. lmol/L pH3.0柠檬酸以1.0-1.5mL/min流速洗脱洗脱结合蛋白，以 200μL7管收集洗脱峰，合并洗脱峰，用0.02mol/L pH7.4 roS 4°C透析过夜，_20°C保存备 用;该纯化蛋白的重链分子量为73KD，轻链分子量为30KD。
[0016] 二、黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备 (l)BALB/c鼠的免疫 tl基础免疫:取纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化作为 抗原，免疫剂量为〇. 2ml/尾，背部皮下多点及腹腔注射6周龄BALB/c小鼠。
[0017] 加强免疫:基础免疫2周后，取纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白与等体积弗氏不 完全佐剂充分乳化作为抗原，加强免疫小鼠，免疫剂量与方法同上。
[0018] 這;二次加强免疫:加强免疫间隔2周后再次加强免疫，免疫剂量与方法同上。
[0019] ?融合前三天加强免疫：融合前3d，取纯化的黄颡鱼免疫球蛋白作为抗原，背部 皮下多点及腹腔注射小鼠，免疫剂量为〇. lml/尾。
[0020] (2)细胞融合 il饲养细胞的制备:脱颈处死正常BALB/c小鼠，无菌条件下打开腹部皮肤，用无菌注 射器取PRMI-1640培养基注射到小鼠腹部内，反复抽吸后，将液体全部吸出，移入96孔细胞 培养板内，置于37°C、5 %C02培养箱中培养待用。
[0021] 義I脱颈处死免疫小鼠，无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞过100目筛网，与SP2/0 骨髓瘤细胞混合于融合管内，lOOOrpm离心10min，弃去上清;轻弹融合管底，融合管放入37 °C水浴中，吸取lmL预热至37°C的PEG4000于lmin中内加完，静置90s;继续缓慢加入15mL预 热至37°C的PRMI-1640培养基，使PEG失效，再补加25mL的PRMI-1640培养基，lOOOrpm离心 lOmin，弃去上清;沉淀细胞用预热的含1%HAT的PRMI-1640培养基重悬，加入装有饲养细胞 的96孔板，置37 °C、5 %C02培养箱培养。
[0022] i|)培养5-7天后进行换液处理，吸出100μL7孔培养液，加入等量含HAT的培养基。
[0023] (3)阳性杂交瘤的筛选和克隆 ?筛选:待融合细胞生长到培养孔面积的1/10时，取培养上清用间接ELISA法进行筛 选，用纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白作为包被抗原，2yg/mL，lOOyL/孔，4 °C过夜包被；10%小 牛血清于37°C封闭3h，用PBST洗涤3次，5min/次;加入杂交瘤上清37°C孵育lh，以SP2/0上清 作为阴性对照，阳性对照为免疫血清；同上洗涤3次，加入1:1000辣根过氧化物酶标记的羊 抗鼠 IgG37°C孵育lh，100yL/孔；同上洗涤3次孔加入TMB显色液，100μL7孔，于暗处反应 30min，加入2 mol/L硫酸溶液终止反应，50yL/孔，450nm下读取0D值(Ρ/Ν 2 2.1时判为阳 性)。
[0024] ?克隆：采用有限稀释法进行克隆，提前制备饲养细胞(方法同上），将筛选的阳 性杂交瘤细胞用血球计数板进行活细胞计数，用PRMI-1640培养基进行10倍梯度稀释，设3 个浓度，将上述浓度细胞悬液分别加入含饲养细胞的96孔培养板内，100μL孔，平均每孔含 1个杂交瘤细胞，置37°C、5 %C02培养箱培养。培养期间用间接ELISA法检测各孔培养上清， 用经复测仍为强阳性的克隆用有限稀释法再次克隆，克隆化至阳性率达100%，即可定株。本 发明获得了外观饱满，分裂旺盛的杂交瘤细胞，其名称为:杂交瘤F6-F2,保藏单位为：中国 典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC N0:C2015152,保藏日期为:2015年9月13日。
[0025] (I;冻存：取生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞株，制备细胞悬液，lOOOrpm离心 lOmin，弃去上清，加入含10%DMS0的PRMI-1640培养基使细胞终浓度为106个/mL，然后转移 到冻存管中。经4°C 1 Omin，-20 °C 30min，-80 °C过夜后，浸入液氮中长期保存。
[0026] (4)腹水制备 ：Ι.?选取8-10周龄的BALB/c小鼠，提前7-10d注射灭菌的液体石蜡0.5ml/尾。
[0027] (?取对数生长期的杂交瘤细胞，lOOOrpm离心10min，弃上清，用无菌生理盐水离 心洗涤1次，细胞计数后稀释至5 X 106,腹腔注射小鼠。
[0028] 識}:腹腔注射杂交瘤细胞7-14d后，选取腹部明显隆起小鼠，用12或16号针头插入 腹下部采集腹水2-5