Cd133质粒的新用图
【技术领域】
[00011本发明涉及⑶133质粒的新用途。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤。大量证据表明正是由于乳腺癌干细 胞(Breast Cancer Stem Cell,BCSC)的存在导致其容易转移，复发且对放化疗抵抗。而近 年来兴起的过继细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy，ACI)是一种针对放化疗不 敏感肿瘤的新疗法，临床前景广阔，获得越来越多的重视。
[0003] CSC的存在是影响乳腺癌治疗效果和预后最重要的因素之一，目前临床上应用的 放化疗通常只能消除普通乳腺癌细胞，而对放化疗抵抗的残存BCSC仍能不断增殖，导致乳 腺癌复发转移，所以寻找一种行之有效的杀灭CSC的方法成为乳腺癌治疗的新方向。ACI是 一种依赖自体效应性免疫细胞的体外扩增进行肿瘤细胞有效杀灭的新型疗法，其首先应用 于恶性白血病的治疗，后逐步推广至包括乳腺癌、乳腺癌、肺癌等在内的实体肿瘤。ACI的效 应细胞主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CIKs)，淋巴因子激活的杀伤细胞(1711^11〇1^116-activated killer cells，LAKs)，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte cells,CTLs)及新近提出的嵌合抗 原受体的T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)等。而作为体内功能最强大 的专职抗原提呈的DC也是ACI重要的组成部分。
[0004] CIK细胞具有增殖快速、杀瘤力强、杀瘤谱广、对正常细胞无杀伤作用、对耐药肿瘤 敏感等优点，是目前已知的活性最高的非特异性杀伤免疫效应细胞。DC能够将肿瘤抗原提 呈给免疫活性细胞，促进其增殖活化，增强对肿瘤细胞的杀伤活性。有研究表明，负载肿瘤 干细胞抗原的DC免疫表型较前成熟，而将其与CIK细胞共同培养后，DC-CIK免疫表型进一步 成熟且分泌细胞因子水平相应提高。
[0005] ⑶133是乳腺癌干细胞最重要的分子标记，它是一种单跨膜糖蛋白，通过与多种配 体的结合在细胞粘附和迀移等行为中发挥关键作用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供⑶133质粒的新用途。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0008] ⑶133质粒在增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用方面的应用。
[0009] 优选的，上述CD133质粒的应用，以CD133质粒冲击DC(dendritic cell)后与CIK (cytokine-induced killer)细胞联合培养使DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤效果增 强。
[0010] 优选的，上述⑶133质粒的应用，所述⑶133质粒的序列为序列表〈400>1所示序列。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] CD133质粒在增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用方面具有重要应用价 值。
【附图说明】
[0013] 图1 CSC-RNA诱导的树突状细胞；
[0014]图2 CSC-裂解物抗原诱导的树突状细胞；
[0015]图3辅助质粒和目的质粒共转染293T 24h和48h的绿色荧光强度；
[0016]图4用浓缩的慢病毒去侵染293T细胞，12h换液，48后的荧光强度。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0018] 实施例1
[0019] -、乳腺癌MCF-7细胞干细胞全细胞裂解物的制备
[0020] 收集乳腺癌MCF-7细胞及其干细胞细胞、分别调整细胞浓度至1 X 10T(MCF-7细胞 及其干细胞细胞:DC细胞=10:1 )，转至冻存管中，将冻存管放入液氮15min，取出后立即放 入37 °C水浴锅中15min，反复4次，裂解后，4 °C离心，10000g离心1 Omin，收集上清，0.22um滤 膜过滤除菌，存于-80°C备用。用BCA法测定上述裂物蛋白浓度的，按BCA试剂盒说明书进行 蛋白浓度测定。
[0021 ] 乳腺癌MCF-7细胞干细胞总RNA的提取
[0022] 按照Qiagen Rneasy mini kit试剂盒说明书操作。收集对数期生长的MCF-7细胞 及磁珠分选的MCF-7干细胞，计数不少于1 X 107个，移至无 RNase的1.5ml EP管中，加入600μ 1 Buffer RLT，用lml无菌注射器反复吹打5-8次至细胞完全裂解，然后，加入600μ1 70 %乙 醇混勾，8000g离心15s，弃流穿液，加入700μ1 RW1 Buffer至收集柱中，8000g离心15s洗涤 收集柱，再加入含有1〇μ1 DNase的Buffer RDD 80μ1于收集柱中20-30°C孵育15min彻底消 化基因组DNA。加入350μ1 RW1 Buffer至收集柱中，8000g离心15s洗涤收集柱，然后加入500 μL RPE Buffer至收集柱中，8000g离心2min彻底洗涤收集柱，弃流穿液。将收集柱置于新的 1.5ml EP管中，加入30-50μ1无 RNase的去离子水，离心8000g离心lmin，收集洗脱下来的 RNAAanodrop 2000分光光度计检测提取的RNA浓度。
[0023]⑶133慢病毒表达体系的构建
[0024] 1.1.1.1引物设计
[0025] 以 pCDNA3.1+CD133(sl6-s24)为模板
[0026] 引物:CDUSFW -CGGAATTCATGGGTGCAAATGTGGA-3'(序列表〈400>2所示序列）
[0027] CD133R: 5' -ATAAGAATGCGGCCGCTCACAAGGGGTCGATAATGTAGC-3'(序列表〈400>3所示 序列）
[0028] 1.1.1.2 PCR扩增
[0029] 反应体系：按顺序加入以下7种成分，混匀： 母液浓度 50.μ1体系加入量:￡μ1> Buffer 1 () X 5 dNTP 2.5 ηιΜ 4 引物 F 10uΜ： .2
[0030] 引物 R 10 ιιΜ 2 聚合酶 5?7μ1 0.25 c!dH20 - 35.75 模板 （适当稀释） 1
[0031] 反应程序： PCR反座程序:95°C 2min 95 JC 30s
[0032] 58 C 30s 72 °G 1 mi n 3Q*Gye I e 72〇C 7m in
[0033] PCR产物胶回收，用EcoRI和Notl双酶切后与我们提供的过表达对照载体相连接。
[0034] 1.1.1.3酶切 [0035]片段酶切： 上游内切酶 1.5 μL 下游内防酶 1,5 μL
[0036] 共用 buffer (l〇x) 5 μL PCR回收产物 30 μL ddH20 补 ?5()μ1.
[0037] 37 °C消化2_3h。电泳切胶回收(酶切回收试剂盒，TaRaKa)
[0038] 载体酶切： 上游内切酶 1.5 μ1 下游内切酶 1.5 .μL
[0039] 共用 buffer (1〇χ) 5: μ1 载体 20 μL del Η 20 补至 50 μL
[0040] 37 °C消化2-3h。电泳切胶回收(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，ΒΡΙ)
[0041 ] 1.1.1.4连接、转化
[0042] (1)连接：1μ1 载体，3μ1 酶切回收产物，ΙμL连接酶(ΒΡΙ)，5μ1 2XRapid Buffer，混 匀，室温反应30min。
[0043] (2)转化:取出一 80 °C保存的100μΙ感受态细胞(BL21)，放在冰上缓慢解冻。将感受 态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置3〇11^11。42°(：热激90s。冰浴2min后，加入800μ1无抗性 的LB培养基。37 °C培养45min。5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μ1，重悬菌体， 选择有相应抗性的LB平板，涂板。晾干，于37°C培养箱中倒置培养过夜。筛选阳性克隆，质粒 提取，并测序。
[0044] 1 · 1 · 1 · 5质粒提取(去内毒素）
[0045] 将带有质粒的E.coli接种于200ml LB/抗生素培养液中，37°C搖床培养12h;取 200ml的菌液，室温下5000g离心10min收集细菌。倒弃培养基。加入10ml Solution 1/ RNaseA混和液，漩祸振荡使细胞完全悬浮。往重悬混和液中加入10ml Solution II，轻轻颠 倒混匀7-10次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不 要超过5min。加入5ml冰浴Buffer N3,并温和颠倒离心管10次至形成白色絮狀沉淀。准备好 过滤器。把HiBind中量柱套在收集管中，加入3ml Buffer GPS至柱子中，静置3-5min。室温 5000g离心5min。去滤液，把柱子重新放回收集管中。加入10ml无菌水，5000g离心5min。将裂 解液倒进预先准备好的针筒过滤器中（针筒开口朝上，下面出口处接收集管），静置2min。插 入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR， 颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴2〇11^11。42°(：水浴5min后，25°C，5000g离心5min，ETR溶液 将在管底形成蓝色分层。离心后，如果溶液中有大量的液滴悬浮，静置lOmin让液滴自然沉 降。转移上清液移至离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇（室温），混匀后室温静置2min。将 HiBind大量柱装在50ml收集管中。转移20ml混合液至柱子内，室温下5000g离心5min，倒去 滤液。重复该步骤，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。把柱子重 新装回收集管，加入l〇ml HB Buffer，按上述条件离心，弃滤液。把柱子重新装回收集管，加 入15ml DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液，重复一次。把柱子重新装回收集管，最 大速度(<6000g)离心15min以甩干柱子基质。把柱子装在干净的50ml离心管上，加入70°C预 热3ml Endotoxin free Elution Buffer到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓 度），室温下静置5min后4000g速度离心5min以洗脱DNA。取10μ1用微量核酸定量仪定量。 [0046] 1.1.1.6慢病毒包装
[0047]用明胶(0.2% )包被10cm dish在4°C下孵育过夜。胰酶消化前期培养的293Τ细胞， 均匀铺板待细胞融合度达到70%_90%方可进行包装。小心吸取细胞培养基上清液，加入 6mL无血清无双抗DMEM，放入培养箱待用。制备转染试剂与DNA复合物，取无菌无酶EP管2只， 其中1只分别加入1号辅助质粒6.5yg，2号辅助质粒2.5yg，3号辅助质粒3.5yg，目的质粒15μ g(若包装对照慢病毒将目的质粒更换为对照质粒即可）另一只ΕΡ管加入55μ1转染试剂 (lmg/ml)。使用无菌过滤roS或DMED分别将两只ΕΡ稀释至500μ1，吸取转染试剂500μ1加入4 质粒中轻柔吹打混匀(注:切记不可涡旋，不可将加入顺序颠倒）。静止放置20min，快速逐滴 加入待用的培养皿中，8字混匀培养皿后放入培养箱。6h后换新鲜完全培养基12mL。换液后 48h收集上清，1000g lOmin离心或0.45μηι无菌滤器过滤。
[0048] 1 · 1 · 1 · 7慢病毒浓缩 PEG-8000:
[0049] 5倍浓度PEG8000，121°C30min湿热灭绝30min;保存在4°C ;使用0.45μπι滤头过滤慢 病毒上清液；每301111过滤后的病毒初始液，加入5倍浓度1^6-8000加他(：1母液7.51111;每 30min混合一次，共进行3-5次;4°C放置过夜；4°C，4000g，离心20min;吸弃上清，静置管子 2min，吸走残余液体;加入适量的（10ml对应100μ1)慢病毒溶解液(PBS)溶解慢病毒沉淀;浓 缩后的病毒悬液分装成50yl每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在_80°C。
[0050] 1.1.1.8病毒低度检测:利用GFP荧光细胞数进行病毒滴度测定
[0051] 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。"TU"为 "