一种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培 养基。
【背景技术】
[0002] 有效的细胞免疫治疗离不开在体外大量培养、扩增和活化淋巴细胞。这其中使用 量最大的试剂就是培养基。培养基为淋巴细胞的生长提供了基本的环境，包括为淋巴细胞 存活提供适宜的渗透压，PH值，为淋巴细胞的生长提供了一切所需的营养因子，包括无机 盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等，也是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所。传统的培养 基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有 新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。使用动物 血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病 的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持人淋巴细 胞的生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持人淋巴细胞的生长，但是人AB血清来 源困难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。
[0003] 现有商品化无血清淋巴细胞培养基大都添加有人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性 组分。由于这些组分来源于人的血清，虽然有各种病原体的检测技术和消毒技术，但仍然避 免不了传播疾病的风险；由于来源于不同的供者，造成批次间差异，不利于质量的控制。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能高效扩增人淋巴细胞的无动 物源性培养基，该培养基不采用动物或人的血清及其组分作为添加物，降低了传播疾病的 风险，同时可以保证不同批次质量的均一性。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] -种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培养基，包括基础培养基，还包括血清 替代物和扩增促进剂；
[0007] 所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括 脂质、微量元素化合物和维生素;所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合 物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；
[0008] 所述扩增促进剂为化合物Cephaloziellin N。
[0009] 进一步地，所述重组人血白蛋白的浓度为5mg/L~20mg/L。
[0010] 进一步地，所述重组人转铁蛋白的浓度为40mg/L~80mg/L。
[0011] 进一步地，所述重组人胰岛素的浓度为l〇mg/L~40mg/L。
[0012] 进一步地，胆固醇浓度为0.5mg/L~2.5mg/L，亚油酸浓度为0.2mg/L~0.4mg/L，亚 麻酸浓度为〇 · 3mg/L~0 · 5mg/L。
[0013]进一步地，微量元素化合物中的硝酸铁浓度为〇 . 2mg/L~0.4mg/L，亚硒酸钠浓度 为Ο · lmg/L~Ο · 2mg/L，硫酸铜浓度为Ο · lmg/L~Ο · 2mg/L，硫酸锌浓度为Ο · 3mg/L~Ο · 7mg/L。
[0014] 进一步地，所述维生素包括维生素 Ε，维生素 Ε浓度为4mg/L~8mg/L。
[0015] 进一步地，化合物Cephaloziellin N的浓度为5mg/L~15mg/L。
[0016] 进一步地，所述基础培养基为RPMI 1640培养基。
[0017] 进一步地，所述基础培养基中添加1~3 %体积百分含量的自体血清。
[0018] 本发明的优点：
[0019] 本发明提供的无动物源性培养基能高效扩增人淋巴细胞，且杀瘤活性强。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ] 本发明化合物Cephaloziellin N的制备方法参见文献〖Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat.Prod.2013，76，1700-1708。
[0022] 实施例1:无动物源性培养基组成
[0023] 每1L RPMI 1640培养基中加入重组人血白蛋白10mg，重组人转铁蛋白60mg，重组人 胰岛素25mg，胆固醇1.5mg，亚油酸0.3mg，亚麻酸0.4mg，硝酸铁0.3mg，亚硒酸钠0.15mg，硫 酸铜0.15mg，硫酸锌0.5mg，维生素 E 6mg，化合物Cephaloziellin N 10mg，庆大霉素10 IU， 搅拌使充分溶解，调节pH值为6.8~7.2之间，0. Ιμπι滤膜过滤除菌，分装。
[0024] 实施例2:实施例1的对比，不添加扩增促进剂Cephaloziellin Ν [0025] 每1L RPMI 1640培养基中加入重组人血白蛋白10mg，重组人转铁蛋白60mg，重组人 胰岛素25mg，胆固醇1.5mg，亚油酸0.3mg，亚麻酸0.4mg，硝酸铁0.3mg，亚硒酸钠0.15mg，硫 酸铜0.15mg，硫酸锌0.5mg，维生素 E 6mg，庆大霉素10 IU，搅拌使充分溶解，调节pH值为6.8 ~7 · 2之间，0 · Ιμπι滤膜过滤除菌，分装。
[0026]实施例3:淋巴细胞增殖实验，测定存活率
[0027]使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个 核细胞。加入含5 %热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清。计数细胞， 用相应的培养基配成IX l〇6/ml细胞悬液。分为以下几组：
[0028]阴性对照组:RPMI 1640+10%FBS;
[0029 ]实施例1组:实施例1制备的培养基；
[0030] 实施例2组:实施例2制备的培养基；
[0031] 阳性对照组:实施例1组唯一不同在于使用人源性白蛋白和转铁蛋白分别替代重 组人白蛋白和重组人转铁蛋白。
[0032] 按每孔加入2ml培养基接入6孔板，每组3个复孔。第1天加入1000IU/ml IFN-r，培 养24小时后加入50ng/ml CD3单抗(0KT3)、300IU/ml IL-2和 100IU/ml IL-la。以后每3天计 数，补加含300IU/ml IL-2培养液至1 X 106/ml。培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和 存活率，结果见下表。 「nrml
[0034]上述结果表明，本发明提供的培养基可以显著提高淋巴细胞的增殖倍数，促进淋 巴细胞增殖，效果与阳性对照组基本一致，优于不添加扩增促进剂的培养基。
[0035]实施例4:杀瘤活力测定 [0036] 分组同实施例3。
[0037] 取培养15天的CIK细胞为效应细胞，以K562细胞为靶细胞，按效靶比10:1接种到96 孔板内，37度5 % C02培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。
[0038] 杀瘤率％ = 1_(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔 [0039]结果见下表。
[0040]
'[0041]上述结果表明，本发明提供的培养基可以显著提高淋巴细胞的杀瘤活力，效果优 于不添加扩增促进剂的培养基。
[0042] 本发明中，RPMI1640培养基可以添加1~3 %体积百分含量的自体血清。
[0043]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培养基，包括基础培养基，其特征在于:还 包括血清替代物和扩增促进剂； 所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、 微量元素化合物和维生素;所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包 括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌； 所述扩增促进剂为化合物Cephaloziellin N。2. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述重组人血白蛋白的浓度 为5mg/L~20mg/L〇3. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述重组人转铁蛋白的浓度 为40mg/L~80mg/L。4. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述重组人胰岛素的浓度为 10mg/L~40mg/L〇5. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述脂质中的胆固醇浓度为 0 · 5mg/L~2 · 5mg/L，亚油酸浓度为0 · 2mg/L~0 · 4mg/L，亚麻酸浓度为0 · 3mg/L~0 · 5mg/L。6. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:微量元素化合物中的硝酸铁 浓度为〇 · 2mg/L~0 · 4mg/L，亚硒酸钠浓度为0 · lmg/L~0 · 2mg/L，硫酸铜浓度为0 · lmg/L~ 0 · 2mg/L，硫酸锌浓度为0 · 3mg/L~0 · 7mg/L。7. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述维生素包括维生素 E，维 生素 E浓度为4mg/L~8mg/L。8. 根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于:化合物Cephaloziellin N的 浓度为5mg/L~15mg/L。9. 根据权利要求1~8任一所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述基础培养基为 RPMI 1640培养基。10. 根据权利要求9所述的无动物源性培养基，其特征在于:所述基础培养基中添加1~ 3 %体积百分含量的自体血清。
【专利摘要】本发明公开了一种能高效扩增人淋巴细胞的无动物源性培养基，包括基础培养基，还包括血清替代物和扩增促进剂；所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、微量元素化合物和维生素；所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；所述扩增促进剂为化合物Cephaloziellin？N。本发明提供的培养基可以显著提高淋巴细胞的增殖倍数，促进淋巴细胞增殖，效果与阳性对照组基本一致，优于不添加扩增促进剂的培养基；本发明提供的培养基可以显著提高淋巴细胞的杀瘤活力，效果优于不添加扩增促进剂的培养基。
【IPC分类】C12N5/0781, C12N5/0783
【公开号】CN105602898
【申请号】CN201610197482
【发明人】谷超
【申请人】谷超
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月31日