用于哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于晡乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物
[0001 ] 本申请为国际申请日2010年11月9日、国际申请号PCT/US2010/055956于2012年5月11日进入中国国家阶段、申请号201080051269.2、发明名称“用于哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物”的分案申请。
[0002]本专利申请要求2010年4月22日提交的序列号为61/326,799的美国临时申请和2009年11月12日提交的序列号为61/260，441的美国临时申请的优先权益，所述每个临时申请的教导内容在此以其全文引为参考。
技术领域
[0003]本发明提供了用于制造哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞(GRP)群的方法，以及使用这些细胞的方法，所述细胞群具有减少的可能不想要的细胞表型和/或降低的群细胞中的标准偏差。在本发明中还提供了用于表征GRP的抗体组及其在表征GRP细胞中的使用方法。
【背景技术】
[0004]神经胶质限制性祖细胞(GRP)由它们与抗体A2B5的反应性来确定，所述抗体识别C-系列神经节苷脂亚组(Dietrich等，Glia 2002 40: 65-77 ;Rao和Mayer-Proschel,Dev.B1l.1997 188:48_63;3&;[1:0等，]\如111'0。116111.2001 78:64_74;Windrem 等，Nat.Med.2004 10:93-97) ARP的其它抗原性特征包括星形细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的中度表达和神经元标志物E-CAM(多唾液酸化N-CAM或PSA-NCAM)和β-1II微管蛋白(TuJI)的低表达(Di etr i ch等，Gl ia 2002 40: 65-77 ; Rao和Mayer-Proschel，Dev.B1l.1997 188:48-63)。
[0005]在GRP被分离时，它们已经内源性分化至超出神经干细胞的范围，成为定型的谱系限制性细胞。尚未观察到GRP诱导或产生畸胎瘤。
[0006]脑和脊髓中非常重要的一类神经元包括那些轴突被包裹在髓磷脂中的神经元。当该髓鞘受损时，其生命过程构成神经元轴突周围的绝缘性髓磷脂层的少突神经胶质细胞被破坏。脱髓鞘的神经元不能正确传导信号，并最终将死亡。
[0007]当损坏不完全时，内源性修复机制被激活，引起髓鞘重新形成和功能部分或完全恢复(Lassmann 等，Mult.Scler.1997 3:133-136; Prineas 和Conne 11 ,Ann.Neurol.19795:22-31)。这证实了髓鞘重新形成确实能导致功能恢复这一关键点。然而，由于各种疾病或创伤而发生脱髓鞘的大多数患者不发生足够的内源性重新形成髓鞘(Prineas等，Ann.Neuro1.1993 33:137-151)，并且尽管存在大量需求和努力，但在开发能够帮助恢复丧失的功能的产品方面几乎没有获得进展。这可以部分归因于为了在体内实现受损的产髓磷脂少突神经胶质细胞的再生，必须存在大量信号和复杂的细胞间相互作用。重要的是，在脱髓鞘的动物模型中，引起髓鞘重新形成的细胞疗法已被证明是有益的。
[0008]Totoiu 等(Exp.Neurol.2004 187: 254-265)报道了在病毒诱导的鼠 MS 模型中鼠GRP的局部移植物在治疗脊髓病变中的益处。GRP迀移并分化成少突神经胶质细胞，引起看起来与轴突保留相关的髓鞘重新形成。他们也观察到运动的改善。后续研究(Hardison等，Exp.Neurol.2006 197:420-429)证实了鼠GRP能够在炎性T细胞和巨噬细胞两者存在下存活并重新形成髓鞘。
[0009]由于髓磷脂碱性蛋白编码基因突变而表现出正常髓磷脂产生缺陷的战栗小鼠(shiverer mouce)是用于研究外源性细胞移植物对髓磷脂产生的影响的模型。通过战栗小鼠中的细胞移植，证实了髓磷脂产生与许多脱髓鞘疾病包括TM和MS以及髓鞘形成障碍相关。已显示，人GRP在围产期异种移植后能在战栗小鼠脑中广泛并高效地形成髓鞘(Windrem等，Nat.Med.2004 10:93-97)。证实了分化成区域适合的细胞类型(星形细胞和少突神经胶质细胞)，并且没有肿瘤的迹象。对这些研究进行了扩展以显示脑和脊髓两者的髓鞘重新形成，其在部分移植动物中伴有显著的表型援救(Windrem等，Cell Stem Cell 2008 2:553-565) ο
【发明内容】
[0010]本发明的一个方面涉及用于制造哺乳动物神经胶质限制性祖细胞(GRP)的方法。
[0011]本发明的另一方面涉及用于减少GRP细胞群中的不想要的细胞表型和/或降低GRP细胞群细胞中的标准偏差的方法。
[0012]本发明的另一方面涉及用于表征GRP细胞的抗体组，以及使用该抗体组将细胞表征为GRP细胞的方法，所述抗体组包含针对c系列神经节苷脂(使用A2B5抗体)、GFAP的抗体以及选自 01181、01182、01、卩06卩1?-0、巢蛋白(1168^11)、吣2、？5厶-从^1、1\^1、灯-67和恥_的一种或多种抗体。
[0013]本发明的另一方面涉及可用于表征GRP细胞的基因表达谱。
[0014]本发明的另一方面涉及用于制造A2B5阳性细胞缺失的哺乳动物神经细胞的方法。
[0015]本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞产生星形细胞和/或少突神经胶质细胞的方法。
[0016]本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞在患有与神经元脱髓鞘相关的疾病、障碍、损伤和损坏的哺乳动物中增加神经元的髓鞘重新形成的方法。
[0017]本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞减少神经胶质瘢痕形成的方法。
[0018]本发明的又一方面涉及用于在哺乳动物中使用这些制造的哺乳动物GRP细胞治疗神经变性疾病或障碍或神经系统或其一部分的损坏或损伤的方法。
【附图说明】
[0019]图1A、1B和IC显示了按照本发明制造的三个独立细胞制备物的试验规模生长曲线。
[0020]图2A和2B显示了按照本发明制造的细胞的生产规模生长曲线。
[0021 ]图3A和3B显示了细胞在悬液与聚L-鸟氨酸处理的表面上的存活率(图3B)以及在每次传代和最终收获时的存活率(图3A)的比较。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供了用于制造哺乳动物神经胶质祖细胞(GRP)的方法。在文献中，GRP也被称为神经胶质限制性前体细胞或神经胶质祖细胞。
[0023]本发明的哺乳动物GRP细胞可以源自于能够产生A2B5阳性细胞的任何哺乳动物组织源。这样的哺乳动物组织源的实例包括但不限于胚胎/胎儿和成体(包括出生后的所有年龄)源，其全都来自于包括但不限于神经、脑、脊髓、视神经、嗅上皮、内分泌腺、皮肤、肌肉、脂肪、结缔组织、胎盘、脐带血、血液、骨髓、骨、胚胎干细胞和诱导的多能细胞的组织。所谓能够产生A2B5阳性细胞，它指的是包括分化成A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源、去分化成A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源、以及去分化然后分化成A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源。
[0024]根据本发明，哺乳动物神经胶质限制性祖细胞(GRP)通过从能够产生A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源中分离A2B5抗体反应性细胞来制造。然后将A2B5阳性细胞在基质上体外培养大于6天(DIV)。然后收获培养的细胞。
[0025]在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将哺乳动物神经组织例如但不限于胎儿尸体前脑组织、胎儿尸体脊髓组织、哺乳动物脑或脊髓活检组织等解离成细胞悬液。在一个实施方案中，哺乳动物神经组织在神经管闭合后获得。对于人GRP来说，神经组织在例如妊娠约14至约24周时神经管闭合后获得，此时，组织被证实产生一致的产物。按照已知方法通过酶法、机械法或酶法与机械法两者进行解离。
[0026]A2B5抗体反应性细胞能通过本技术领域的专业人员已知的各种手段来分离。例如，在一个实施方