用于鉴别可接受胚胎移植的哺乳动物的方法
【专利摘要】本发明涉及选择可接受胚胎移植的哺乳动物以提高所述哺乳动物的生殖效率和产乳量的新颖方法。本发明涵盖三种方法：(1)从哺乳动物的任一群组中选择；(2)从动情阴性哺乳动物中选择；和(3)从动情阴性哺乳动物中选择并汇集所述所选哺乳动物与动情阳性哺乳动物。本发明还涵盖用于选择可接受胚胎移植的哺乳动物的试剂盒。
【专利说明】用于鉴别可接受胚胎移植的晡乳动物的方法
[0001]相关专利申请案的交叉参考
[0002]本申请案主张优先于2011年6月14日提出申请的美国临时申请案61/496，761，所述申请案的全文以引用方式并入本文中。
【技术领域】
[0003]本发明涉及鉴别在本发明技术之前会被归类为不可接受胚胎移植和人工授精方法以诱导妊娠的生殖哺乳动物。
【背景技术】
[0004]近年来，在乳品工业中，母牛的生殖效率已显著降低。这表现为如下工业标准生殖性能测量的不合意降低:(I)首次配种天数，(2)受孕天数，(3)产犊间隔，(4)每次受孕的配种次数，(5)不返情率，(6)动情(或“发情”)检测率，和(7)妊娠率。具体来说，动情或发情检测可用于鉴别如果在动情检测时或之后不久授精可能妊娠的母牛。将母牛错误地鉴别为未“发情”(即，“动情阴性(estrus-negative)”)是生殖效率低的重要因素。这对乳品工业造成相应的重要影响，因为没有生殖效率的乳牛会被淘汰。
【发明内容】
[0005]本发明的一个方面是选择可接受胚胎移植的哺乳动物的方法，其包含:(1)使至少两个哺乳动物的动情周期同步；(2)从步骤(1)中的至少两个哺乳动物中选择在其卵巢中存在黄体(CL)的哺乳动物；(3)将胚胎移植到步骤(2)中所选的哺乳动物中；和(4)测试哺乳动物对妊娠的接受性。
[0006]因此，在一个实施例中，本发明提供鉴别可接受胚胎移植的哺乳动物的方法，其包含(A)使两个或两个以上哺乳动物的动情周期同步；(B)将胚胎移植到具有黄体但已鉴别为不在动情期或动情阴性的哺乳动物中；和(C)测试哺乳动物的妊娠情况，其中妊娠哺乳动物指示哺乳动物对胚胎移植的接受性。
[0007]在一个实施例中，哺乳动物是母牛。在另一个实施例中，同步化是通过向至少两个哺乳动物投与前列腺素来实现。在另一个实施例中，同步化是通过投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
[0008]在另一个实施例中，哺乳动物是母牛且黄体的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
[0009]在另一个实施例中，哺乳动物是母牛且胚胎介于5日龄与10日龄之间。
[0010]在另一个实施例中，哺乳动物为“动情阴性”，即哺乳动物未“发情或不显示明显的发情迹象”。在另一实施例中，至少两个动情阴性哺乳动物是母牛。
[0011]在另一个实施例中，同步化是通过向至少两个动情阴性母牛投与前列腺素来实现。在同步化程序中，可结合其它药物来使用前列腺素。[0012]在另一个实施例中，其中黄体在至少两个动情阴性母牛中的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
[0013]在另一实施例中，待移植到至少两个动情阴性母牛的胚胎介于5日龄与8日龄之间。
[0014]在另一实施例中，待移植胚胎是新鲜胚胎、冷冻胚胎、玻璃化胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和/或通过遗传选择产生的胚胎。
[0015]在另一实施例中，待接收胚胎的哺乳动物在动情周期中的第6天与第10天之间。
[0016]另一实施例包含检测哺乳动物是否在动情期或“在发情期”，以鉴别动情阳性(estrus-positive)和动情阴性哺乳动物。
[0017]另一实施例包 含检测在已鉴别为不在动情期或动情阴性的哺乳动物中是否存在卵巢黄体。
[0018]本发明的另一方面是选择可接受胚胎移植的哺乳动物的方法，其包含:(1)使至少两个哺乳动物的动情周期同步；(2)从步骤(1)中的至少两个哺乳动物中选择动情阴性的哺乳动物；(3)从步骤(2)中的哺乳动物中选择在其卵巢中存在黄体(CL)的哺乳动物；
(4)将胚胎移植到步骤(3)中的所选哺乳动物中；和(5)测试哺乳动物对妊娠的接受性。
[0019]在一个实施例中，选择可接受胚胎移植的哺乳动物的方法进一步包含在步骤(1)与(2)之间从至少两个哺乳动物选择动情阳性哺乳动物，其中将胚胎移植到步骤(3)中所选动情阳性哺乳动物和具有CL的哺乳动物中。在另一个实施例中，至少两个哺乳动物是母牛。
[0020]在一个实施例中，选择可接受胚胎移植的哺乳动物的方法进一步包含在步骤(1)与(2)之间从至少两个哺乳动物选择动情阳性哺乳动物，其中将胚胎移植到步骤(3)中所选动情阳性哺乳动物和具有CL的哺乳动物中，且其中动情阳性哺乳动物和具有CL的哺乳动物的产乳量比仅动情阳性哺乳动物的产乳量高至少1%。就此来说，动情阳性哺乳动物和具有CL的哺乳动物的产乳量可比仅动情阳性哺乳动物的产乳量高1-5^^5-10%.10-15%, 15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、40-45%、45-50%。
[0021]在另一个实施例中，动情阳性母牛是通过选自由以下组成的群组的方法来选择:(i)尾部标记；(ii)察看动情迹象；(iii)使用试情动物(marker animal) ； (iv)爬跨活动检测器；(V)测量甲基庚醇和(vi)测量信息素(vii)测量运动(viii)测量温度。
[0022]在另一个实施例中，至少两个哺乳动物是母牛且同步化是通过向至少两个哺乳动物投与前列腺素来实现。在另一个实施例中，同步化是通过向母牛投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
[0023]在另一个实施例中，至少两个哺乳动物是母牛且黄体的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(?)超声检查；(iii)测量母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
[0024]在另一实施例中，待移植到至少两个母牛中的胚胎介于5日龄与10日龄之间。在另一实施例中，待移植胚胎是新鲜胚胎、冷冻胚胎、玻璃化胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和/或通过遗传选择产生的胚胎。
[0025]在另一实施例中，待接受胚胎的母牛在动情周期中的第6天与第10天之间。
[0026]本发明的另一方面是提高哺乳动物的生殖效率的试剂盒，其包含:(1)至少一种动情检测试剂或装置，(2)至少一种黄体(CL)检测试剂或装置，(3)至少一种升温或解冻培养基和(4)至少一种移植培养基。
[0027]在一个实施例中，至少一种动情检测装置是爬跨活动检测器或运动活动检测器。在另一个实施例中，至少一种CL检测试剂包含针对孕酮的抗体和针对所述针对孕酮的抗体的抗体。
[0028]本发明的另一方面是使一只或一只以上动情阴性母牛受孕的试剂盒，其包含:(I)至少一种黄体检测试剂或装置；和(2)至少一个待移植到至少一只母牛的胚胎，所述至少一只母牛已通过所述黄体检测试剂或装置鉴别为具有黄体。
[0029]在一个实施例中，其中黄体检测试剂包含针对孕酮的抗体和针对所述针对孕酮的抗体的抗体。
[0030]在另一个实施例中，待移植胚胎是新鲜胚胎、冷冻胚胎、玻璃化胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和/或通过遗传选择产生的胚胎。
[0031]本发明的另一方面是提高产乳量的方法，其包含:(1)使至少两个哺乳动物的动情周期同步；(2)从步骤(1)中的至少两个哺乳动物中选择动情阴性的哺乳动物；(3)从步骤⑵中的哺乳动物中选择在其卵巢中存在黄体(CL)的哺乳动物；(4)将胚胎移植到步骤
(3)中的所选哺乳动物中；和(5)测试哺乳动物对妊娠的接受性。
[0032]在一个实施例中，提高产乳量的方法进一步包含使母牛的动情周期同步。
[0033]在另一个实施例中，同步化是通过向母牛投与前列腺素来实现。在另一个实施例中，同步化是通过向母牛投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
[0034]在提高产乳量的方法的另一实施例中，黄体的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
[0035]在提高产乳量的方法的另一实施例中，胚胎介于5日龄与10日龄之间。在另一实施例中，待移植胚胎是新鲜胚胎、冷冻胚胎、玻璃化胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和/或通过遗传选择产生的胚月台。
[0036] 在另一实施例中，待接受胚胎的母牛在动情周期中的第6天与第10天之间。
[0037]本发明的另一方面是提高母牛群体的妊娠率的方法，其包含:将胚胎移植到已鉴别为动情阴性的母牛中，且其中所述动情阴性母牛已通过投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上同步化。【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1:每一同步群组(彼此相同)中动物的受孕率。(P > 0.1)。
[0039]图2:发现已知与未知同步群组中动物的受孕率并无不同。(P >0.1)
[0040]图3:肉用母牛(包括如通过“站立发情”所鉴别的动情阳性母牛、如通过“尾部粉笔(tail chalk) ”所鉴别的动情阳性母牛和如通过CL触诊所鉴别的动情阴性但为CL阳性的母牛)的妊娠率。
[0041]图4:来自乳品场A的重复育种母牛(包括如通过“尾部粉笔”鉴别的动情阳性母牛和如通过CL触诊鉴别的动情阴性但为CL阳性的母牛)的妊娠率。
[0042]图5:如通过“站立发情”鉴别的动情阳性母牛、如通过“尾部粉笔”鉴别的动情阳性母牛、如通过CL触诊鉴别的动情阴性但为CL阳性的母牛和经历定时胚胎移植的母牛的
妊娠率。
【具体实施方式】
[0043]使畜群中可妊娠且因此开始泌乳以产生乳汁的母牛的数目最大化是奶农的主要目标。在乳品工业中，监测母牛的妊娠率是测量个别母牛的生殖性能的标准方式。且妊娠率参数是根据用受孕率乘以动情(“发情”)检测率来计算。在动情周期的动情期中，雌性变得可接受性且经常被观察到“发情”。每只母牛如果不妊娠并居住在全年可获得充足光照和营养的地点，那么每年可经历17个动情周期。动情周期一般由四个时期组成:(I)动情前期；(2)动情期；(3)动情后期和(4)动情间期。黄体是通常从卵巢边缘伸出的结构，且可通过触诊或超声与滤泡相区分。卵巢滤泡通常含有单一卵母细胞且在卵巢的皮质或外层部分处发现。源自卵巢滤泡的黄体也位于卵巢皮质处。在发育中，在每个动情期期间，卵巢滤泡在雌激素和促性腺激素影响下发育成熟。对于一些哺乳动物，例如母牛，可在动情期发生自发排卵，而在其它物种中，排卵需要交媾。
[0044]对于母牛以及妊娠率的计算，发情检测率是通过以下文方法中讨论的各种方法鉴别为在21天阶段期间正在动情的母牛的分数来确定。重要的是，正确发情检测的差异性可对集体畜群的妊娠率造成显著影响。例如，如果受孕率是40%，且将发情检测率鉴别为50%，那么妊娠率会等于20% (PR = 0.4*0.5 = 0.2)。然而，如果所有母牛都正确鉴别为正在发情或动情，那么妊娠率会倍增为40% (PR = 0.4*1.0 = 0.4)。因此，错误鉴别实际上可通过人工授精或胚胎移植妊娠，但原本因检测为“无发情”而被淘汰的母牛的数目可显著降低整个畜群的生产率。另外，对动情的错误鉴别和对不在动情期母牛进行育种会让奶农浪费精液并因等待确定动物是否妊娠而损失时间。因此，对所有同步化动物进行育种的成本也很高。
[0045]本发明通过鉴别未观察到在动情期(动情阴性)但仍可接受胚胎移植并因此妊娠的其它动物来使选自畜群的可为胚胎移植接受者的母牛的数目最大化。“可接受”通常是指激素诱导的子宫内壁的增厚条件，其为植入的胚胎提供营养。本发明使得乳品制造商可让未显示动情迹象的母牛受孕。尽管这些母牛能妊娠，但使用其它方案无法将其鉴别出来。另外，这种新方案还提供由于可允许随时间向母牛投与较少注射(shot)和较少药物而优于标准定时人工授精方法的使母牛受孕的方法。
[0046]人工授精是指通过机械或仪器方式而不是通过交媾将精液引入阴道或子宫。人工授精经计划以符合预期排卵时间，从而使得可发生受精。定时人工授精方案经设计以使在程序开始时通常处于动情周期的不同阶段的一组母牛之间的排卵同步。简单来说，本发明提供增加妊娠并因此增加终生产乳量的替代性优选方法。
[0047]本发明确定，归类为动情阴性(即，未鉴别为发情的母牛)但卵巢中具有黄体的母牛事实上可接受胚胎移植，且可妊娠。因此，本发明方法允许从畜群中原本已被淘汰的母牛亚群鉴别生殖上健康的母牛。所述亚群通常是奶农将分开并淘汰、或首先使用其它策略(例如定时Al)来增加妊娠数且然后淘汰的亚群。通常，奶农只会使用那些鉴别为正在发情的母牛进行胚胎移植或人工授精以使其妊娠。许多生殖上健康(尤其在产奶)的母牛因诸如场地较差、负能量平衡、过热和通风不足、空间不足、垫料不足等事情而不显示发情，且因此沉默发情或动情阴性发情。然而，通过使用本发明方法，奶农可通过将待淘汰亚群重分类以鉴别动情阴性但仍能妊娠的母牛来提高牛群的生殖效率。因此，可通过检测动情阴性母牛中黄体的存在来校正发情检测的任何差异性，从而使每个畜群中有更多母牛可用于生殖,并由此提高产乳量。
[0048]因此，本发明方法的一个方面是鉴别动情阴性母牛中黄体的存在。根据具体情况，本发明不需要动情的初步检测`，或不检测动情。相反，本发明也适于简单地检测所有母牛中的黄体，不论其是否已经历动情/发情检测。此外，本发明并不仅限用于母牛。其它雌性哺乳动物可进行本发明测试以确定其在生物学上是否适于且可接受生殖活动。因此，在施用生殖技术(例如胚胎移植)之前，可测试其它动物(包括马、狗、猫、绵羊、山羊、骆驼、厚皮动物以及其它动物)中黄体的存在，或将其鉴别为正在发情，或未发情，且随后测试未发情动物中黄体的存在。.因此，如在本文中其它地方所用的对“母牛”的引用只是说明性实例，并不打算诠释为将本发明方法仅限制于所述动物物种。
[0049]因此，在一个实施例中，提供仍可接受胚胎移植的动情阴性母牛亚群。因此，这个具体实施例涉及从畜群中鉴别那些未观察到发情的母牛，且随后测试那些动情阴性母牛以确定含有黄体(CL)的母牛。然后向这些动情阴性、CL阳性的母牛植入胚胎，且所述亚群中的一些母牛将妊娠。因此，本发明与适宜同步化组合来提高畜群的生殖效率。
[0050]就此来说，黄体是在哺乳动物的动情周期的动情后期和动情间期期间从卵巢滤泡发育的临时内分泌结构。黄体产生大量孕酮，其增厚并维持子宫内壁以准备植入胚胎。在不存在活胚胎时，黄体停止分泌孕酮并消退为瘢痕组织，同时子宫内壁因此退化回正常大小。然而，在存在活胚胎时，黄体持续分泌孕酮，其又维持厚子宫内壁以为胚胎发育提供所需营养。
[0051]有三种标准方式来检测黄体:(I)直肠触诊；(2)超声检查；和(3)测量血液或哺乳动物产生的乳汁中的孕酮水平。在母牛的直肠触诊情形中，通常首先通过手、触摸和感觉来检测子宫颈以鉴别子宫，其特征在于两个子宫角之间的外部分岔。下一步是检测卵巢，其通常位于子宫下方或在子宫旁边。黄体是通常从卵巢边缘伸出的结构，且可通过触诊或超声与滤泡相区分。卵巢滤泡含有单一卵母细胞且在卵巢的皮质或外层部分处发现。源自卵巢滤泡的黄体也位于卵巢皮质处。
[0052]在执行超声检查时，通过直肠插入探头并将其定位于卵巢上方。通过探头生成超声脉冲并将其传递到探头的相邻组织。超声脉冲从相邻组织反射回探头。反射的量取决于相邻组织的结构。黄体通常呈现为卵巢间质内的独特淡灰色回声区且可能含有空腔。超声检查提供非常可靠的检测黄体的方式，但设备昂贵。
[0053]最后，可通过测量母牛血液或乳汁中孕酮激素的浓度来检测黄体。可从市场购买分析试剂盒来测定血液或乳汁中的孕酮水平。例如，可从生物金属物质公司(BioMetallicsIncorporated)，普林斯顿，新泽西，美国购买“革巴向马孕酮试剂盒(Target EquineProgesterone Kit)”。可从埃克杜斯育种公司(Exodus Breeders Corporation),约克，宾夕法尼亚，美国购买QUICKCHECK?犬孕酮试剂盒和QUICKCHECK?马孕酮试剂盒。
[0054]如上文所提到的，本发明方法允许鉴别含有黄体的母牛作为胚胎移植的适宜候选者，不论所述母牛是否已归类为发情或未发情。
[0055]有多种传统方法来确定母牛是否发情。发情(即，在动情周期的动情期)哺乳动物通常显示某些动情迹象。在母牛情形中，这些迹象包括:(I)站立以由另一母牛爬跨，这在工业中是最常用的动情检测迹象；(2)身体活动由于增强的神经质和多动而增加；(3)舔嗅其它母牛的性区；(4)经常叫喊或吼叫；(5)阴户排出稀薄透明的水样粘液；和(6)采食量减少。因为这些个别迹象中的许多迹象需要人类观察且甚至可能性状不明显，所以确定母牛或其它哺乳动物是否发情应基于全体所有迹象。如果确定全体所有迹象都指向动情，那么认为哺乳动物为“动情阳性”。反之，如果确定全体所有迹象都不指向动情，那么认为哺乳动物为“动情阴性”。
[0056]特定来说，母牛是否发情或可通过“站立发情”和“尾部粉笔”来鉴别。那些“站立发情”的母牛通过站立以由另一母牛跳上来显示行为动情。此外，可使用“尾部粉笔”、即通过涂抹所有同步化母牛的尾根并观察涂料是否被摩擦掉来鉴别动情母牛。如果涂料被摩擦掉，那么将母牛记录为已显示动情迹象。
[0057]奶农了解多种可检测上文所提到的迹象的实践方式。例如，“试情动物”是手术阉割的公牛或雄激素化的母牛或阉牛，其性活跃并寻找动情母牛。雄激素化的母牛是经睾酮注射并模拟雄性行为的母牛。这些试情动物通常配备有标记装置，例如在试情哺乳动物的颏下方如同圆珠笔一般工作的缰绳。在试情公牛爬跨发情母牛时，颏部球标记器在雌性哺乳动物背上留下标记。然后这些标记可经诠释以确定雌性哺乳动物是否发情。类似地，附接到母牛的爬跨活动检测器可在性活动后变色，同时电子检测器向计算机发射无线电信号，所述计算机记录母牛的身份、以及爬跨的时间和持续时间。电子检测器比其它类型的检测器更精确，因为其可记录多次爬跨以及爬跨的持续时间。或者，母牛阴道分泌物中的甲基庚醇的水平升高指示其发情。甲基庚醇可通过气相色谱来监测，如例如美国专利第4，467，814号中所述，所述专利是全文以引用方式并入本文中。“尾部标记”是另一种通过沿哺乳动物的尾根从髋部到臀部以带状涂抹粉笔或涂料来检测动情的方法。粉笔或涂料因哺乳动物爬跨而被摩擦掉。
[0058]因此，所属领域技术人员可得知如何检测发情或未发情母牛，且随后在后一(动情阴性)亚组中鉴别那些具有黄体的母牛。然后为动情阴性但为CL阳性的母牛可在胚胎移植程序中成为胚胎的候选接受者。
[0059]就此来说，胚胎移植是指各种用于建立妊娠的标准方法，其中从至少一个供体哺乳动物分离一个或若干个胚胎且将其置入至少一个其它哺乳动物的子宫中。活体内胚胎是从供体哺乳动物分离的胚胎。除了产生供体哺乳动物中的胚胎以外，还可使用活体外受精(IVF)的方法产生胚胎。IVF是指通过体外精子使卵子受精的方法。可移植新鲜胚胎或可在通过在液氮中冷冻或玻璃化保藏后移植。在胚胎移植之前根据保藏方法和用于容纳胚胎的工具按照相应方案将冷冻/玻璃化胚胎解冻/升温。可能是由于低温有效地中止了所有生物活动(包括导致细胞凋亡的生物反应)，冷冻胚胎可在长时期内维持其活力。
[0060]在一个实施例中，待移植胚胎是通过体细胞核移植(即，克隆)在活体外产生，此例示于加藤(Kato)等人，科学(Science) 282 (5396) =2095-2098(1998)和威尔穆特(Wilmut)等人，自然(Nature) 385:810-813(1997)中，所述两个文献都是全文以引用方式并入本文中。
[0061]在另一个实施例中，待移植胚胎是通过胚胎细胞核移植在活体外产生，此例示于皮奥拉(Peura)等人，分子生殖与发育(Mol.Reprod.Dev.) 50: 185-191 (1998)和史密斯(Smith)等人，生殖生物学(Biology of Reproduction) 40 (5): 1027-1035 (1989)中，所述两个文献都是全文以引用方式并入本文中。
[0062]在另一实施例中，待移植胚胎是通过胚胎分割或分裂在活体外产生，此例示于加里(Gary)等人,动物生殖学(Therigenology) 35 (I):37-44(1991)和贝克(Baker)等人,动物生殖学23(1) =3-12(1985)中，所述两个文献都是全文以引用方式并入本文中。
[0063]在另一实施例中，待移植胚胎是通过精子显微注射在活体外产生，此例示于休威瑟(Heuwieser)等人，动物生殖学38 (I) =1-9(1992)中，所述文献是全文以引用方式并入本文中。在一个实施例中，待移植胚胎是通过遗传修饰在活体外产生，此例示于杨(Yang)等人，公共科学图书馆综合(PLoS One) 6 (3):el7593 (2011);克拉克(Clark)，美国临床营养学杂志(Am.J.Clin.Nutr.) 63 =633-638(1996);和拉伊(Lai)等人，生殖生物学与内分泌(Reprod.Biol.Endocrinol.) I =82(2003)中，所述所有文献都是全文以引用方式并入本文中。
[0064]在一个实施例中，待移植胚胎是通过遗传选择在活体外产生，此例示于博德(Bodo)等人，匈牙利兽医学报(Acta Vet.Hung.) 49 (I):99-109 (2001)和陈(Chen)等人，生殖生物学.67 (5) =1488-1492(2002)中，所述两个文献都是全文以引用方式并入本文中。
[0065]对于新鲜或活体内供体产生的胚胎，胚胎移植程序一般包含7个步骤:(I)选择供体哺乳动物；(2)使供体哺乳动物与接受者哺乳动物同步；(3)使供体哺乳动物超排卵(操纵供体哺乳动物以产生最大数目的卵子的方法)；(4)对供体进行授精(通过来自所选雄性的镜子使供体卵子受精)；(5)冲洗胚胎(从供体子宫分离胚胎)；(6)评估胚胎(将胚胎归类为不同等级，例如极佳、优良、中等、较差和死亡)；(7)选择接受者哺乳动物(选择可接受胚胎移植的雌性哺乳动物)；(8)移植胚胎，其为将胚胎“加载”到移植枪中，通过子宫颈插入移植枪且随后在子宫角与黄体同侧的前部尖端中放出胚胎的方法。在活体外产生的胚胎的情形中，通常只会施用步骤(5)、(6)和(7)。有时需要选择被认为“在遗传上优于”其物种的其它成员的供体哺乳动物。因此，在本发明的一个实施例中，可使用胚胎移植来增加遗传上优良的哺乳动物的后代数。例如，与饲养公牛相比，人工授精是低成本替代方案。人工授精还使得能从大量公牛中选择那些具有特别需要的性状的公牛。胚胎移植已用于使可用那些公牛来育种的所述良种母牛的生殖潜能最大化。例如，藉助激素刺激，良种母牛可经历超排卵以在每个排卵周期产生7-12个待移植到其它代孕母牛的胚胎。因此，在约50 %的成功移植率下，良种母牛在每个排卵周期的产犊数从一个增加到六个以上。母牛一年可经历多次超排卵。[0066]用于胚胎移植的各种培养基为业内已知。例如，在从供体子宫移除活体内胚胎时，可使用胚胎冲洗剂。市售胚胎冲洗剂包括(例如)来自生殖资源(ReproductionResources)的EmCare?完全冲洗培养基和Vigro?完全冲洗培养基，以及来自美国米尼图(Minitube of America)的BoviPro?恢复培养基。此外,在工作台上操纵胚胎时,可使用保持培养基。市售保持培养基包括(例如)来自生殖资源的EmCare?保持培养基、Vigro?保持补加培养基和同步保持培养基，以及来自美国米尼图的BoviPro?保持培养基。另外，可使用解冻培养基来解冻冷冻胚胎。市售解冻培养基包括(例如)来自生殖资源的EmCare?CSU解冻试剂盒，以及来自美国米尼图的BoviPro?再水合培养基。
[0067]在执行动情检测和/或黄体检测之前，有时可能需要使一群母牛“同步”以确保乳畜群中的实质上所有成员都处于其动情周期的相同或相似生殖期。使动情周期同步一般意味着操纵一组雌性哺乳动物的生殖过程以在大致相同的时间进行排卵。例如，母牛的同步化动情周期允许育种者在预定阶段期间安排一组母牛的育种活动，由此提高人工授精、胚胎移植或其它育种技术的效率，此可用于使整个畜群的生殖效率最大化。
[0068]同步化 可通过施加三个主要群组的激素来实现:前列腺素、黄体酮和促性腺素。可获得每个群组的激素的市售产品。前列腺素产品包括律胎素(Lutalyse)、氯前列烯醇(Estrumate)和IN-SYNCH。黄体酮产品包括阴道植入物CIDRiIP饲料添加剂美仑孕酮(Melengestrol)乙酸盐(MGA)。促性腺素产品包括戈那瑞林(Cystrorelin)、盐酸戈那瑞林(Factrel)和氟他吉尔(Fertagyl)。可使用抗体来检测这些激素。如业内所熟知,抗体是免疫系统用来识别并中和诸如细菌和病毒等外来目标的蛋白质。抗体的靶称为抗原。抗体通常识别抗原的独特部分(“表位”)。除了细菌和病毒以外，目前现代分子生物学技术允许所属领域技术人员针对几乎任何蛋白质产生抗体，且随后使用所述抗体作为分析工具以及诊断或治疗工具。
[0069]“前列腺素”是一组由子宫内膜分泌的20碳脂肪酸激素，其引起黄体消退且由此诱导由黄体产生的孕酮急剧减少。通过移除孕酮，释放促性腺素的激素(GnRH)开始发挥更大影响。较高水平的GnRH产生较高水平的滤泡刺激激素(FSH)和黄体化激素(LH)，其在哺乳动物进入动情周期的动情前期时支持滤泡发育。“孕酮”是通过细胞内孕酮受体起作用以发挥包括以下多种生理学效应的21碳激素:(I)将子宫内膜或子宫内壁转化到其分泌阶段以为受精卵的植入做准备；(2)在植入期间降低雌性哺乳动物身体的母体免疫以接受妊娠而不引起免疫反应；(3)降低子宫平滑肌的收缩性；和(4)在妊娠期间抑制泌乳。在动情周期的动情后期期间，刚形成的黄体开始分泌低水平的孕酮。然后黄体在动情间期期间分泌高水平的孕酮。
[0070]可采用多种方案来实现同步化，例如投与一种激素或激素组合。例如，可以以下四种方式中的一种个别注射前列腺素:
[0071](I)投与前列腺素的单次注射并在随后2-5天中检测动情。
[0072](2)在最初5天中检测动情，且对所有发现发情的雌性哺乳动物进行育种。然后在第5天向未发情雌性哺乳动物投与前列腺素的单次注射。
[0073](3)投与前列腺素的第一次注射并在随后5天中检测动情。在第11天，向未发情雌性哺乳动物投与前列腺素的第二次注射。
[0074](4)投与前列腺素的第一次注射并在随后5天中检测动情。在第14天，向未发情雌性哺乳动物投与前列腺素的第二次注射。
[0075]所属领域技术人员通常将投与前列腺素的多次注射称作两次注射法。参见杜庞丽(DuPonte MW)和李KK (Lee KK)，夏威夷肉牛育种季节的三种简化动情同步化程序(ThreeSimplified Estrus Synchronization Programs for Hawaii’s Beef Breeding Season),家畜管理(Livestock Management)(合作推广服务(Cooperative Extension Service),夏威夷大学马诺阿分校)，2007年4月，LM-14，1_2，所述文献是全文以引用方式并入本文中。
[0076]前列腺素也可与孕酮类饲料添加剂美仑孕酮乙酸盐(MGA) —起投与。可将MGA喂14天且随后停用。然后在MGA停用后17到19天投与前列腺素的单次注射。
[0077]在一个实施例中，在用前列腺素的单次注射使母牛同步后，在检测黄体之前不向母牛投与其它同步化剂。在另一个实施例中，在用前列腺素的单次注射使母牛同步后，在胚胎移植之前不向母牛投与其它同步化剂。
[0078]同步化也可通过前列腺素与阴道植入物CIDRie的组合来实现。通常，在第O天插入CIDR植入物，在第6天给予前列腺素的一次注射，且在第7天移除CIDR植入物。可从第8天到第11天检测动情。同步化方法的其它实例包括促性腺素与前列腺素的组合。在所谓的“选择同步方案”中(参见兰姆GC(Lamb GC)等人，在更换肉用小母牛中选择同步(释放促性腺素的激素和前列腺素F2 α )对使动情同步的有效性(Effectiveness of SelectSynch(Gonadotropin-Releasing Hormone and Prostaglandin F2 a ) for SynchronizingEstrus in Replaceme nt Beef Heifers),职业动物科学家(The Professional AnimalScientist), 20:27-33 (2004)，其全文以引用方式并入)，在第0天投与促性腺素的注射且在第7天投与前列腺素的注射。动情通常发生在前列腺素注射之前36小时且直到前列腺素注射后6天。“选择同步方案”可经进一步修改以包括在前列腺素注射后2天的另一次促性腺素注射。
[0079]因此，本发明方法的一个实施例使得需要使多个母牛同步，在同步化母牛群体中检测动情，和随后在动情阴性母牛中检测黄体的存在。
[0080]通过增加鉴别为可接受胚胎移植且随后妊娠的母牛的数目，本发明也增加泌乳母牛的数目，从而相应地增加每单位时间可产生的乳汁的量。诸如霍尔斯坦(Holstein)等乳牛已经反复且选择性地育种以增加产乳量，且在本发明技术中可使用所述母牛。尽管产乳量水平在育种之间可变，但一只母牛在每个泌乳期通常可产生约15，000到25，0001b乳汁。母牛在一生期间可能泌乳10次或10次以上。但大多数母牛在两次泌乳后就被淘汰，主要是由于以下四种原因:(I)不育；(2)持续且可能致命的乳腺感染；(3)引起不育和产量损失的持续性足部感染或腿部问题；和(4)所产生乳汁的经济水平不足以抵消其维持成本。因此，本发明解决淘汰乳牛的第一个原因且通过鉴别可接受胚胎移植的其它母牛使妊娠率的效率最大化，而且还使产乳效率最大化。
[0081]如本文中其它地方的揭示内容所显示，动情是使用单次肌内注射到母牛中的律胎素可注射前列腺素来同步，且动情是通过每天一次观察尾部粉笔来检测。然后在律胎素注射后11天，在母牛动情周期的第6天到第10天，将第6.5天和第7.5天的新鲜的活体外产生的(IVP)胚胎移植到观察到在动情期的母牛中。然后对那些不显示动情迹象的母牛进行黄体(CL)触诊。如果检测到CL，那么移植IVP胚胎。在约40天时通过触诊检测妊娠。重要的是，未显示动情但缺失具有黄体的母牛的受孕率为38.7% (图1和表1)。[0082]类似地，在本文所揭示的相同研究中，通过CL触诊鉴别出31只其它母牛用于胚胎移植，此将所移植胚胎的总数增加26%。此研究显示，这些原本不会被检测出来的母牛能用IVP胚胎妊娠。
[0083]此外，胚胎具有加速或延迟发育的独特能力以符合子宫环境的阶段。因此，对于待发生的妊娠，胚胎和子宫不需要完全同步。但人工授精(Al)不能如此。在发生Al时，其必须在极短时间段(12小时窗口)内实施。有一些方案用于定时Al，因此不需要发情检测。然而，这些方案需要多次注射且可能从方案开始到Al耗时数周。如果配种不成功，再次重复方案又要多耗时数周。
[0084]因为直到动情周期的第4-5天时，在人工授精的必需时间之后的4-5天，在卵巢上不存在黄体结构，因此在同步化后对黄体结构进行触诊的方法不适用于人工授精程序。然而，黄体触诊在胚胎移植中有效，因为胚胎是在动情周期的第6-10天移植。例如，如实例中详细解释，此研究的结果显示，不显示动情迹象但具有黄体且其中移植胚胎的母牛的受孕率与观察到在动情期且已知待同步化的母牛并无不同。
[0085]因此，这种新方案将节省乳品制造商的同步化成本，并且提高获得尚未显示动情迹象的妊娠动物(例如母牛)的效率。尽管这些动物能妊娠，但其不会被当前现有的方案鉴别出来。
[0086]* * * [0087]除非另外定义，否则本文所用全部技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。通常，本文所用术语和本文所述实验室程序为业内所熟知且常用。使用标准技术进行哺乳动物育种和维持、分析化学、分子生物学、酶分析以及医药调配和递送。通常，酶反应和纯化和/或分离步骤是根据制造商的说明书来执行。
[0088]以下实例用于阐释本发明的各个实施例且不应视为以任何方式限制本发明的范围。
[0089]本文引用的所有参考文献(包括专利、专利申请案和公开案)都是全文以引用方式并入本文中，其中先前明确并入或未并入。
[0090]尽管现在已全面阐述本发明，但所属领域技术人员应了解，无需过多实验，可在等效参数、浓度和条件的宽范围内执行本发明。本申请案打算涵盖一般遵循本发明的原理的本发明的任何变化形式、用途或调整，其包括例如在本发明所属领域的已知或常规实践范围内且可应用于上文所述的基本特征的对本发明的更改。
[0091]实例
[0092]实例I
[0093]在2010年7月与2011年I月之间，148只霍尔斯坦、霍尔斯坦杂交种和泽西(Jersey)母牛因泌乳超过120天或不成功人工授精配种已超过4次而被鉴别为重复育种。使用单次肌内注射律胎素可注射前列腺素(25mg，辉瑞(Pfizer)，纽约，纽约州)使动情同步。通过每天一次观察尾部粉笔来检测动情。在律胎素注射后11天，在母牛动情周期的第6天到第10天，将第6.5天和第7.5天的新鲜的活体外产生的(IVP)胚胎移植到观察到在动情期的母牛中。对那些未显示动情迹象的母牛进行黄体(CL)触诊。如果检测到CL，那么移植IVP胚胎。在约40天时通过触诊检测妊娠。
[0094]根据母牛天数减去胚胎天数计算母牛与胚胎的同步性，且其介于-0.5天到2.5天范围内。最高比例的动物为0.5天和1.5天。(η = 85)。31只接受胚胎但未显示动情迹象的动物具有未知同步性。对于此研究中的动物，总体第40天受孕率为31.3%。那些具有未知同步性的、未显示动情但确实具有CL的母牛的受孕率为38.7% (图1和表1)。[0095]在此研究中，用一次注射律胎素使乳牛同步。在卵巢上存在功能完全的CL时，律胎素(前列腺素)能在动情周期的第5天到第17天引起黄体(CL)消退。黄体解体是CL的消退，其使得可开始动情。如果未建立妊娠，那么那些动物的CL在周期的第17天后会自然消退。只有那些在第O天与第5天之间的动物不会被同步化。因此，在随后5天内将针对动情同步化的动物的平均百分比可为76.2%。然而，这些动物中许多不会显示发情或可能不会被观察到发情。在此研究中，使用尾部粉笔通过每天观察来检测动情。对未检测的动物进行CL触诊。如果存在CL，那么移植胚胎。鉴别出31只其它动物用于胚胎移植，此将所移植胚胎的总数增加26%。此研究显示，这些未检测动物能用IVP胚胎妊娠。
[0096]胚胎具有加速或延迟发育的独特能力以符合子宫环境的阶段。因此，对于待发生的妊娠，胚胎和子宫不需要完全同步。但人工授精(Al)不能如此。在发生Al时，其必须在极短时间段(12小时窗口)内实施。有一些方案用于定时Al，因此不需要发情检测。然而，这些方案需要多次注射且可能从方案开始到Al耗时数周。如果配种不成功，再次重复方案要耗时数周。
[0097]因为直到动情周期的第4-5天时，在人工授精的必需时间之后的4-5天，在卵巢上不存在CL结构，所以在同步化之后对卵巢上的CL结构进行触诊的过程不适用于Al程序。然而，CL触诊在胚胎移植中有效，因为胚胎是在动情周期的第6-10天移植。此研究的结果显示，未显示动情迹象但具有CL且移植胚胎的动物的受孕率与观察到在动情期且已知待同步化的动物并无不同。此新方案节省乳品制造商的同步化成本，并且使尚未显示动情迹象的动物受孕。尽管这些动物能妊娠，但使用其它方案无法将其鉴别出来。另外，这种新方案还提供由于允许随时间向动物投与较少注射和较少药物而优于标准定时人工授精方法的使动物受孕的方法。此方案提供增加妊娠并因此增加终生产乳量的替代性优选方法。
[0098]根据母牛天数减去胚胎天数计算母牛与胚胎的同步性，且其介于-0.5到2.5天范围内。最高比例的动物为0.5天和1.5天。(η = 85)。31只接受胚胎但未显示动情的动物具有未知同步性。总体第40天受孕率为31.3%。那些具有未知同步性、未显示动情但确实具有CL的母牛的受孕率为38.7% (图1)和表1 (每个群组中的动物数目和怀孕动物的％，P > 0.1)。
[0099]表1
【权利要求】
1.一种用于鉴别可接受胚胎移植的哺乳动物的方法，其包含(A)使两个或两个以上哺乳动物的动情周期同步；(B)将胚胎移植到具有黄体但已被鉴别为不在动情期的哺乳动物；和(C)测试所述哺乳动物的妊娠情况，其中妊娠哺乳动物指示所述哺乳动物对胚胎移植的接受性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是母牛。
3.根据权利要求2所述的方法，其中同步化是通过向所述哺乳动物投与前列腺素来实现。
4.根据权利要求2所述的方法，其中黄体的存在是通过以下方式来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量所述母牛血液中孕酮的浓度；或(iv)测量所述母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述胚胎介于5日龄与8日龄之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含检测所述哺乳动物是否在动情期。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含检测在已鉴别为不在动情期的所述哺乳动物中卵巢黄体是否存在。
8.一种选择可接受胚胎移植的母牛的方法，其包含在不在动情期(动情阴性)母牛群体中检测卵巢黄体的存在或不存在，和将胚胎移植到具有黄体的动情阴性母牛中，其中在胚胎移植后随后妊娠的母牛是可接受胚胎移植的母牛。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包含使所述母牛的动情周期同步。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述同步化是通过向所述母牛投与前列腺素来实现。`
11.根据权利要求8所述的方法，其中黄体的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量所述母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量所述母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述胚胎介于5日龄与8日龄之间。
13.一种提高哺乳动物的动情效率的试剂盒，其包含:㈧至少一种动情检测试剂或装置；和(B)至少一种黄体检测试剂或装置。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述至少一种动情检测装置是爬跨活动检测器。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述至少一种黄体检测试剂包含针对孕酮的抗体和针对所述针对孕酮的抗体的抗体。
16.一种提高产乳量的方法，其包含在不在动情期(动情阴性)母牛群体中检测卵巢黄体的存在或不存在，和将胚胎移植到具有黄体的动情阴性母牛中，其中在胚胎移植后随后妊娠的母牛是可接受胚胎移植的母牛。
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包含使所述母牛的动情周期同步。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述同步化是通过向所述母牛投与前列腺素来实现。
19.根据权利要求16所述的方法，其中黄体的存在是通过选自由以下组成的群组的方法来检测:(i)直肠触诊；(ii)超声检查；(iii)测量所述母牛血液中孕酮的浓度；和(iv)测量所述母牛产生的乳汁中孕酮的浓度。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述胚胎介于5日龄与8日龄之间。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎选自由以下组成的群组:新鲜胚胎、冷冻胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和通过遗传选择产生的胚胎。
22.根据权利要求1所述的方法，其中接受所述胚胎的所述哺乳动物在动情周期的第6天与第10天之间。
23.根据权利要求2所述的方法，其中同步化是通过向所述母牛投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
24.根据权利要求8所述的方法，其中所述胚胎选自由以下组成的群组:新鲜胚胎、冷冻胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和通过遗传选择产生的胚胎。
25.根据权利要求8所述的方法，其中接受所述胚胎的所述母牛在动情周期的第6天与第10天之间。
26.根据权利要求9所述的方法，其中同步化是通过向所述母牛投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
27.根据权利要求 16所述的方法，其中所述胚胎选自由以下组成的群组:新鲜胚胎、冷冻胚胎、活体内胚胎、活体外受精胚胎、通过体细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎细胞核移植产生的胚胎、通过胚胎分割产生的胚胎、通过精子显微注射产生的胚胎、通过遗传修饰产生的胚胎和通过遗传选择产生的胚胎。
28.根据权利要求16所述的方法，其中接受所述胚胎的所述母牛在动情周期的第6天与第10天之间。
29.根据权利要求17所述的方法，其中同步化是通过向所述母牛投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上来实现。
30.一种提高母牛群体的妊娠率的方法，其包含:将胚胎移植到动情阴性母牛中，其中如果母牛未发情或不显示明显的发情迹象，那么所述母牛为动情阴性，且其中所述动情阴性母牛已通过投与前列腺素、促性腺素和黄体酮中的一种或一种以上同步化。
31.一种使一只或一只以上动情阴性母牛受孕的试剂盒，其中如果母牛未发情或不显示明显的发情迹象，那么所述母牛为动情阴性，所述试剂盒包含:(A)至少一种黄体检测试剂或装置；和(B)至少一个待移植到至少一只母牛的胚胎，所述至少一只母牛已通过所述黄体检测试剂或装置鉴别为具有黄体。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述黄体检测试剂包含针对孕酮的抗体和针对所述针对孕酮的抗体的抗体。
【文档编号】G01N33/53GK103648435SQ201280034563
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年6月13日 优先权日:2011年6月14日
【发明者】布拉迪·希克斯, 唐纳·S·克拉克 申请人:杰.尔.辛普洛公司