专利名称：：增强哺乳动物精子功能的组合物和方法增强哺乳动物精子功能的组合物和方法相关申请的交叉参考特此要求2006年1月19日申请的临时申请序号60/760,312的优先权，所述临时申请通过引用结合到本文中。发明领域本发明涉及包含育性相关抗原(FAA)和2型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2)的组合的组合物。本发明还涉及使用该组合物的方法，该方法一般地讲增强哺乳动物精子的功能性，更具体地说增强包含在冷冻保存的精液中的精子的功能性。参考书目本文所提及论文的完整参考书目引用包含在其后紧接权利要求书的参考书目章节。在参考书目中提及的论文通过引用结合到本文中。发明背景已有大量文件证实，精液是由雄性副生殖器官(即精嚢、前列腺和尿道球腺)的分泌物组成的复杂混合物。在迄今为止发现并表征的精液组分中，已表明有一些在体外抑制精子获能，另一些在体外刺激精子获能。刺激获能的精液组分包括结合精子射精并运送肝素诱导的获能的肝素结合蛋白(HBP)家族(Miller,1990)。通过用纯化的HBP免疫产生的鼠单克隆抗体(mAb)Ml识别牛精子提取物的免疫印迹中的3种不同蛋白(Bellin等，1996,1998)。3种HBP中的一种表现为单一的31kDa质量，被描述为育性相关抗原(FAA;Bellin等，1998)。称为FAA的肝素结合蛋白的多核苷酸编码序列和FAA的氨基酸序列与其它精液蛋白截然不同。业已描述了编码非人FAA的分离多核苷酸。参见2005年5月10日颁发的美国专利第6,891,029号。2型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2)为公牛(Calvete等，1996,McCauley等，2001)、人(Baumgart等，2002;Shimokawa等，2003)、大鼠(Siu和Cheng,2004)以及公羊和公马(Metayer等，2002)的精液的正常成分TIMP-2在包括睾丸和副性腺在内的多种细胞类型中产生。和FAA—样，TIMP-2也由这些腺体分泌。在射精过程中，TIMP-2结合穿越尿道的精子。已描述了4种TIMP蛋白，它们抑制基质金属蛋白酶(MMP)的催化能力(Nagase等，1999)。MMP是多种生殖过程的介导物，包括排卵、着床、分娩、内巻(involution)以及前列腺和睾丸功能(Hulboy等，1997)。MMP已^C定位于正常和异常的人类精子的顶体和中段(Buchman-Shaked等，2002)。TIMP-2通过抑制失活的前-MMP-2酶原的切割和转变为其活性形式而优先调节MMP-2(Brew等:2000)。在回顾性分析中，Dawson等(2002)报告，在精子变性提取物中具有TIMP-2的公牛的育性比TIMP-2阴性公牛高13%。TIMP-2是一种肝素结合蛋白(McCauley等，2001)。育性相关抗原(FAA)是一种在牛副性腺中产生的精液蛋白质。FAA在射精时结合精子(McCauley等，1999)。其是约31kDa的非糖基化碱性蛋白质，与新出现的DNA酶I样蛋白具有高度同源性。牛FAAcDNA序列与DNA酶-l-样-3(DNaselL3)具有88%的同一性，DNaselL3是由人肝脏表达的序列标签(EST)克隆的基因(Rodriguez等,1997)。文献中的DNaselL3命名包括LS-DNA酶和DNA酶I同源蛋白2。DNaselL3主要在肝细胞和脾细胞中表达。FAA被鉴定(McCauley等，1999)为牛精液HBP中的次要组分。FAA的表达发生于精嚢、前列腺和尿道球腺。已在公牛、公猪、公羊、山羊、狗和人的精液中检测到FAA，其主要定位于精子头部的顶体带(Dawson等，2003)。预测的DNaselL3蛋白与经典的DNA酶I45%相同，DNA酶I是已被充分表征的胰腺酶(Kinshi等，1989)。就酶活性、表达的调节和位置而言，DNA酶I样家族成员与DNA酶I不同，它们的生物学作用还没有被确定。FAA是公牛较高育性的蛋白标记；与没有可检测的FAA的精子提取物相比，含有通过蛋白质印迹可检测的FAA的精子提取物指示较高的公牛育性。此观察结果包括用于自然交配的公牛和在多公畜牧场中以1头公牛/25头母牛的比率接触母牛的公牛(Bellin等，1994;1996;1998)，或者利用单次人工授精与小母牛和母牛交配的公牛(Sprott等，2000)。假定FAA由于其肝素结合特征而参与精子获能的调节和/或顶体反应的诱导。精子在体外对补加肝素的介质的反应以接触适宜的诱导物(Ca^离子载体、透明带或诸如溶血性磷脂酰胆碱的融合剂)时顶体反应的剂量-反应性增加为特征，在这些条件下精子进行顶体反应的能力与公牛育性正相关(Ax和Lenz，1987)。肝素结合蛋白在分离自精清时加强肝素诱导的获能(Miller等，1990)。有可能用称为Ml的单克隆抗体(Bellin等，1998)或近来描述的多克隆抗重组FAA抗血清(McCauley等，2004)检测精液样品中的FAA。在筛选914头/>牛的精液样品的FAA时，26%的样品未检测到产生FAA(McCauey等，20(M)。最近报告了FAA阴性/>牛的类似发生率(Sprott等，2006)。较低育性的公牛产生的精子在体外响应肝素进行获能的能力较差(Ax等，1985;Ax和Lenz,1987;Lenz等，1988)。对人工授精产业(对于人类和其它哺乳动物这二者而言)必须要考虑的是成功率。当然，衡量成功的关键标准是每个人工授精事件产生的活体子代数。因此，有助于提升获能率的条件(该条件又在能够使卯细胞受精的射精中产生更高的精子比例)在高度竟争性的人类和动物繁殖、人工授精方案、使用体外受精的畜牧业等方面极具价值。发明概述本发明涉及改善用于人工授精的精液样品的育性或受精力(fertility)的组合物和相应方法。本发明用于在新鲜的和冷冻保存的精液中改善未按性别分拣的(non-gendersorted)精子和按性别分拣的(gender-sorted)精子的功能性。因此，第一种形式的本发明涉及用于增强精子的活力或顶体完整率(PIA)的物质组合物，所述组合物包含组合的一定量的FAA和一定量的TIMP-2，其中所述量有效增强与该组合物接触的精子的活力、PIA或者活力和PIA。FAA和TIMP-2可配置在精液储存介质中，所述介质例如为Tyrode氏白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐介质(TALP)。组合物中的FAA和TIMP-2的浓度使得在接触时精子被配置在约5昭/mL至约200jig/mLFAA和约5|tig/mL至约200|tig/mLTIMP-2的范围、更优选约5jig/mL至约100昭/mLFAA和约5昭/mL至约100昭/mLTIMP-2的范围、再更优选约10昭/mL至约50(ig/mLFAA和约10吗/mL至约50吗/mL的范围的环境中。优选FAA和TIMP-2均为重组蛋白质。本发明的物质组合物可4皮冻干，在此情况下其在与精子接触前与合适的介质水合。另一种形式的本发明涉及改善精子功能性(以及在使用前冷冻储存精子)的方法。该方法包括使精子与如刚才前段落描述的物质组合物接触。该方法可用于改善按性别分拣的精子和/或未按性别分拣的精子的功能性。该方法任选地还包括在使精子与本发明的物质组合物接触后在该物质组合物存在下冷冻或冷冻保存精子。又一种形式的本发明是用于增强精子的活力或顶体完整率(PIA)的试剂盒。该试剂盒含有组合的如先前段落描述的物质组合物，该组合物配置在适宜的容器中。包含在该试剂盒中的FAA和TIMP-2的量组合地有效增强与该組合物接触的精子的活力、PIA或者活力和PIA。该试剂盒任选地包括如何使用该试剂盒的说明书。本发明包括含有单位剂量形式的FAA和TIMP-2组合的组合物。也就是说，FAA和TIMP-2的组合以浓缩形式(例如浓缩的溶液或冻干的)提供，并进4亍包装，使得包装内容物在加入到适宜量的精液储存介质中时，整个包装内容物产生的溶液具有适宜浓度的FAA和TIMP-2。附图简述图1A和IB:重组FAA(rFAA)诱导的时程。如本文所述用IPTG诱导细菌培养物。在相对于诱导蛋白表达的0、2和4小时收集1mL样品。用非变性(50mMKPO4、400mMNaCl、100mMKCl、10%甘油、0.5。/。曲通X-100和10mM咪唑，pH7.8)裂解緩冲液(图1A，可溶的)或用变性8M尿素緩沖液(图1B,不可溶的)制备的提取物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)独立分析。绘制在各个时间点的诱导的("i，，)和未诱导的("ui")级分。rFAA表现为不溶性级分中诱导样品的主要蛋白(图1B，泳道"4hi，，)。M-分子量标i己。图2A和2B:rFAA的表达和检测。Sol=用非变性裂解緩沖液4是取的可溶性裂解物；Insol=在Laemmli样品緩冲液中裂解的不溶性包涵体；UI-未诱导的对照裂解物；1=诱导的(0.5mMIPTG)裂解物。图2A图示了SDS-PAGE凝胶。图2B图示了蛋白质印迹。蛋白质印迹用缀合辣根过氧化物酶的抗His(6x)抗体(1:5000稀释度)进行。rFAA由适宜分子量的抗体特异性识别，证实高度可诱导的rFAA表达。M=分子量标记。图3:rFAA的纯化。用4mL变性緩冲液(8M尿素)裂解25mL液体培养物的细菌细胞沉淀(S-起始材料)，并将其与lmL(0.5mL床体积)BDTalon牌金属亲和树脂混合20分钟。收集未结合的(UB)的材料，用5mL(10X床体积)緩沖液洗涤树脂IO分钟(WI),重复该洗涤(W2)，rFAA用含有250mM咪唑的0.5mL(lx床体积)变性緩冲液洗脱(El-5)。高度纯化的重组FAA在洗脱级分中显现为单一条带。M=分子量标记.图4:亲和纯化的重折叠rFAA。透析纯化的rFAA,并如在发明详述中所述重折叠。M-分子量标记；rFAA-最终的纯化产物。图5:rTIMP-2诱导的时程。细菌培养物如在发明详述中所述用IPTG诱导。在相对于诱导蛋白表达的2和4小时收集lmL样品。用变性8M尿素緩沖液制备提取物，并通过SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯蓝染色。绘制在各个时间点的未诱导的("ui")和诱导的("i")级分。相比于2和4小时(ui)，在2和4小时(i)清楚检测到可诱导的rTIMP-2。M-分子量标记。图6A和6B:rTIMP-2的表达和检测。在2小时表达培养后制备诱导的(0.5mMIPTG)裂解物。可溶的和不溶的级分通过SDS-PAGE(图6A)和蛋白质印迹(图6B)分析。图6A图示了考马斯蓝染色的凝胶，图6B显示了用缀合辣根过氧化物酶的抗His(6x)抗体(1:5000稀释度)进行的蛋白质印迹。Sol-可溶性裂解物；Insol-不溶性包涵体；M-分子量标记。rTIMP-2(由图6A和6B中的箭头指示)容易通过不溶级分的考马斯蓝染色检测。尽管蛋白质印迹对检测可溶性级分中的rTIMP-2敏感，但在不溶性级分中存在强得多的rTIMP-2条带，反映出通过考马斯蓝染色检测的差异。图7A和7B:由2小时表达培养物纯化rTIMP-2。用变性緩冲液裂解细菌细胞沉淀(S-起始材料)，并将其与BDTalon牌金属亲和树脂混合20分钟。收集未结合的(UB)材料，用緩沖液洗涤树脂(W1、W2),rTIMP-2用含有250mM咪唑的0.5mL(lx床体积)变性緩冲液洗脱(E1、E2)。M-分子量标记。进行SDS-PAGE(图7A;考马斯蓝染色)和蛋白质印迹(图7B;抗His6)，以证实纯化物质的纯度。图8:亲和纯化的重折叠rTIMP-2。透析纯化的rTIMP-2，并如在发明详述中所述重折叠。M-分子量标记；1和2=在重折叠两个不同批次制备物后的rTIMP-2产物。图9:重组FAA加强的、肝素诱导的体外牛精子获能。数据通过组间方差分析(ANOVA)来分析。显示了最小二乘法平均值和平均值的标准偏差(SEM)。实验重复4次。没有相同字母标志的值显著不同(p<0.05)。图10:重组TIMP-2加强的、肝素诱导的体外牛精子获能。数据通过ANOVA来分析。显示了最小二乘法平均值和SEM。实验重复4次。没有相同字母标志的值显著不同(p〈0.05)。图11:rFAA和rTIMP-2对顶体反应的组合作用。治疗之间没有显著的相互作用。在rTIMP-2剂量中，不同的字母标志显著不同(p〈0.05)。图12:组合的rFAA和rTIMP-2改善经历冷冻保存的、尤其是较低精子浓度(10x106个精子/塑料细管(straw))的公牛精子的顶体完整性(顶体完整率，PIA,固)和活力百分率(--)。图13:rFAA结合精子膜。对新鲜收集的纯公牛精液补加25吗/ml空载体(泳道1和3)或25吗/mlrFAA(泳道2和4)，并温育20分钟，然后进行商业冷冻保存。融化精液，洗涤精细胞3次，通过采用抗His6x抗体的蛋白质印迹评价细胞裂解物。在补加rFAA的样品中检测到单一条带，表明向纯精液加入重组蛋白足以允许精细胞吸收。使用rTIMP-2观察到类似的结果(未显示数据)。发明详述缩写和定义在整个说明书和权利要求中使用以下缩写和定义。在本文中没有明确定义的术语将按照其在酶学、生物化学和/或人工授精
技术领域：
中的通用定义。ANOVA=组间方差分析。BSA-牛血清白蛋白。EST-表达的序列标签。FAA和rFAA=分别为育性相关抗原和重组育性相关抗原。HBP-肝素结合蛋白。IPTG-异丙基P-D-l-硫代半乳吡喃糖苦，一种常见的/gc操作子诱导物。LB培养基-溶菌肉汤(经常还称为Luria-Bertani培养基或Luria肉汤)。LB是一种广泛用于大肠杆菌细胞的一般维持和增殖的市售培养基(例如Invitrogen)。(关于"LB，，含义的令人关注的以往的说明参见Bertani,G.(2004)，"LysogenyatMid-TwentiethCentury:PI,P2,andOtherExperimentalSystems,"Sacte"o/.186(3》595-600)。LPC=溶血性磷脂酰胆碱。MMP=基质金属蛋白酶。PBS-T=含3%吐温-20的磷酸緩冲盐水。PIA-顶体完整率。RACE=5'互补DNA末端的快速扩增。RT-PCR=逆转录酶-聚合酶链式反应。许多常规PCR和RT-PCR方案是本领域已知的，在本文将不描述任何细节。同样，许多市售i式剂盒可用于克隆和表达需要的核酸序列，并用于分隔、鉴定和分离戶斤获蛋白。除非另有说明，否则本文提及的所有分子生物学操作和方案老卩可见于JosephSambrook和DavidW.Russell的"MolecularCloning-ALaboratoryManual,第3版，，，版权所有2001,ColdSpringHarborPress(ColdSpringHarbor,NewYork),ISBN:0-87969-576-5,该文献通过引用结合到本文中。SDS-PAGE=十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。SEM=平均值的标准偏差。精液储存介质=任何设计用于储存新鲜或冷冻(即冷冻保存的)4青液的介质，包括但不限于TALP介质。SOC介质=首字母缩略词的来源模糊，但一般被称为"超级最4圭肉汤-分解代谢产物抑制"。SOC介质可由众多供应商获得，包招「Invitrogen(目录号15544-034)。另参见Hanahan,D.(1983)"StudiesonTransformationof五scAen'c/n'aco/ZwithPlasmids，"Afo/.5fo/.166(4):557-580。TALP介质=Tyrode氏白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐介质。TALP介质用于制备精子、体外受精、洗涤卵细胞和胚等。TALP介质例如可由Millipore/SpecialtyMedia(Phillipsburg,NewJersey)商购。TIMP-2和rTIMP-2=分别为2型金属蛋白酶组织抑制剂和重i且2型金属蛋白酶组织抑制剂。本发明为在冷冻保存纯精液和/或按性别分拣的精子后增强精子的活力和顶体完整率方面的精子功能的物质组合物和对应方法。TIMP-2和FAAcDNA由牛精嚢克隆，工程化重组融合蛋白，并使用原核表达系统表达，纯化的重组体作为牛精液的治疗添加剂评{介。rTIMP-2和rFAA以剂量依赖性方式刺激精子在肝素诱导的获能后进行顶体反应的能力。含有组合的FAA和TIMP-2的组合物还通过在融化后于38°C的3小时温育后增强精子的活力和具有完整顶体的精子百分率改善冷冻保存后的纯精液和按性别分拣的精液的质量。因此，本发明的用途在于改善哺乳动物精液的育性。这些治疗^:测适用于标准剂量的授精或需要低剂量授精的情况，例如在按性别分拣的精子的商业用途中。本发明对其精子对冷冻保存的反应不佳的公牛的精液样品也特别有益。尽管实施例中描述的实验使用牛精液进行，但已在许多经济学上主要的物种中记录到TIMP-2和FAA表达，这些物种包括马、猪、绵获益。如在实施例中所述，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增585bp的TIMP-2基因区段，该区段已被克隆(产生4个相同的克隆)并测序。SEQ.ID.NO:1显示了TIMP-2基因的编码区；SEQ.ID.NO:2显示了对应蛋白。实际的225个氨基酸的翻译基因产物示于SEQ.ID.NO:11。SEQ.ID.NO:11与SEQ.ID.NO:2的不同之处仅在于其含有由载体自身的3'末端编码的24个残基和6个C端组氨酸残基。栽体编码的残基和His6标记的C-端尾的位置和序列示于序列表。rTIMP-2表达克隆包括牛TIMP-2基因(gb:M32303)的完整成熟肽，产生225个氨基酸的蛋白产物(25.2kDa),该产物含有载体来源的C末端Hise-标签。(参见SEQ.ID,NO:11)。PCR用于由精嚢cDNA扩增603bp的牛FAA片段。SEQ.ID.NO:3显示了FAA基因的编码区；SEQ.ID.NO:4显示了对应蛋白。将该基因克隆入表达载体(pCI^T7/CT-T0PC^)中，并筛选和测序单个克隆。获得6个rFAA克隆其中4个(Al-5、Al醫9、A2-l和A2-3)彼此相同，和设计的完全一样；另2个各自含有在PCR当中导入的单碱基取代。克隆Al-6具有"A562—G"核苷酸取代，该取代在翻译的蛋白中产生"K188—E"突变。克隆A1-10具有"A256~>C"核苷酸取代，该取代在翻译的蛋白中产生"T86~>P"突变。4个相同克隆的603bp的共有核苷酸序列描述于SEQ.ID.NO:3，翻:^的基因产物示于SEQ.ID.NO:4。克隆Al-5被转化入原核表达细胞(BL21(DE3)pLysS)中，生产为His6标记的融合蛋白的rFAA。实际的231个氨基酸的翻译基因产物示于SEQ.ID.NO:12。SEQ.ID.NO:12与SEQ.ID.NO:4的不同之处仅在于其含有由载体自身的3，末端编码的24个残基和6个C端组氨酸残基。重组FAA产物总计为231个氨基酸，分子量为26.7kDa，含有His6标签。(参见SEQ.ID.NO:12)。细菌裂解物的可溶性和不溶性级分的SDS-PAGE分析表明，rTIMP-2主要以包涵体的形式在不溶性级分中表达。温育4小时的诱导培养物中的rTIMP-2表达与2小时相比没有显著上调(参见图5)。因此，rTIMP-2表达培养物在用IPTG诱导后延续2小时。与rFAA的表达(其主要见下文)类似，rTIMP-2主要在不溶性细菌裂解物中表达(参见图6A和6B)。采用抗His6抗体的蛋白质印迹证实了His标记的重组蛋白的身份(参见图6B)。使用基于钴的金属亲和树脂(抗His6)将细胞裂解物的rTIMP-2纯化至接近均一。图7A和7B描绘了通过SDS-PAGE(图7A)和蛋白质印迹(抗His6)(图7B)观察到的rTIMP-2的典型纯化谱。将含有rTIMP-2(图7A和7B中的泳道S)的整个裂解物与金属亲和树脂混合，并由树脂洗脱纯化的rTIMP-2(图7A和7B;透析重折叠。纯化的重折叠终产物(示于图8的凝胶)用于功能性精子测定。重组TIMP-2和FAA在本文所述条件下以相对高水平(>50-75mg/L)表达。重折叠的纯化重组蛋白的回收率在几个实验批次之间为约15J5mg/L培养基(约30%回收率)。(参见实施例的实验细节)。细菌裂解物的可溶性和不溶性级分的SDS-PAGE分析表明，rFAA主要以包涵体形式在不溶性级分中表达。对比图1A(可溶性级分)和图1B(不溶性级分)。最佳rFAA表达的时程为诱导后4小时，如27kDa条带的刺激表达水平所示。对比图1B泳道"4hi"(4小时，诱导的)与图1B泳道"2hi"(2小时，诱导的)或任何标记为"ui"(未诱导的对照)的泳道。因此，所有rFAA表达培养物在用IPTG诱导后都延续4小时。rFAA的表达通过含抗His6抗体的4小时培养物的蛋白质印迹证实(参见图2B)。通过该抗体检测到未诱导的样品(可溶的和不溶的)中低水平组成型表达的rFAA,类似于在诱导的可溶性样品中检测到的水平(参见图2A)。不溶的诱导裂解物明显地主要含有rFAA，以蛋白质印迹中强烈的抗体交叉反应为证(图2B)。使用基于钴的金属亲和树脂(抗HiS6)在变性条件下将细胞裂解物中的rFAA纯化至接近均一。图3显示了通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色观察到的典型纯化i普。将含有rFAA的整个裂解物(图3中的泳道S)与金属亲和树脂混合，以使rFAA特异性结合树脂。在多次洗涤后，用5个床体积的洗脱緩冲液连续地由树脂洗脱纯化的rFAA(图3，泳道E1至E5)。通过在非变性緩冲液中进行多步透析重折叠亲和纯化的变性rFAA,纯化的重折叠终产物(示于图4的凝胶)用于功能性精子测定。rTIMP-2以剂量依赖性方式加强肝素诱导的获能。加入rTIMP-2导致顶体反应性精子的百分率剂量反应性增加(P<0.05),高于用单独的肝素或肝素和溶血性磷脂酰胆碱(LPC)治疗后观察到的百分率。参见图10，该图描绘了随rTIMP-2浓度(昭/mL)变化的顶体反应性精子的百分率。顶体反应的最大刺激(57%)需要加入200|ug/mL的rTIMP-2。然而，以25昭/mL观察到的反应与50或100|Lig/mL没有显著不同。采用空载体裂解物的对照温育与由单独的肝素和LPC诱导的没有差异(未显示数据)。rFAA也以剂量依赖性方式加强肝素诱导的获能。在没有LPC刺激的情况下与单独的肝素温育4小时(图9，"Hep")导致在约16%的精子群中诱导顶体反应(即自发的顶体反应)。在与肝素的4小时温育结束时加入LPC(图14,"0")产生约30%的顶体反应性细胞。加入rFAA导致顶体反应性精子的百分率剂量依赖性增加(p〈0.05)。以25昭/mLrFAA实现了约60%反应性精子的最大响应(参见图9)。用空载体(没有插入片段的阴性对照)转化的培养表达细胞在用细菌提取物治疗后的顶体反应性精子的百分率与由单独的肝素和LPC诱导的没有差异(未显示数据)。因为rTIMP-2和rFAA以25|ug/mL的浓度独立地刺激顶体反应，所以进行实验，以检查rTIMP-2和rFAA对顶体反应的组合作用。0、25和50昭/mL的rTIMP-2和rFAA的交叉治疗表明治疗之间没有显著的相互作用。在没有rFAA治疗的情况下，没有观察到独立的rTIMP-2作用，表明rTIMP-2的作用被公牛改变。然而，以每个剂量加入rFAA都加强rTIMP-2作用(参见图11)，导致所诱导的顶体反应百分率增加与在单独的rFAA和TIMP-2的剂量-反应实验中所观察到的类似。25(ig/mL的rTIMP-2浓度产生的作用与在50昭/mL的较高剂量观察到的作用没有差异。然后用含有组合的rTIMP-2和rFAA的组合物处理精子。具体地说，评价处理的和未处理的精子在冷冻保存后的活力和顶体完整性。因此，在进行冷冻保存之前，用25昭/mL组合的rFAA和rTIMP-2处理新鲜收集的精液样品。冷冻保存按照工业标准进行。在融化后(O小时)立即盲评活力(％)和顶体完整性(顶体完整率，PIA)。然后将样品于38。C温育3小时，此时重复进行检测。3小时温育期代表了人工授精工业的标准质量控制测试，用于确定精液样品在多大程度上能够经受与冷冻保存和融化相关的损害。对比融化后3小时的处理样品和对照样品表明，治疗使活力显著提升。与处理样品的活力(55.7土1.6;参见表l)相比，对照样品的活力(50.4土1.7)在3小时温育期后降低(p〈0.0001)。同样，在3小时时间段后，对照样品在融化后具有完整顶体的精子百分率(66.9土1.6)与处理的样品相比(70.9士1.3;参见表1)显著下降(p〈0.01)，表明(一般相信)重组蛋白在冷冻保存过程中保护细胞的浆膜。另参见图12中显示的曲线图。如在该曲线图中所示，用组合的rFAA和rTIMP-2处理的精液改善经历冷冻保存的公牛精液的PIA0)和活率(——)。该作用在较低精子浓度(1(^106个精子/塑料细管)时特别显著。另外，已确认rFAA和rTIMP-2这二者在所述重组蛋白直接加入纯精液时结合精子膜。参见图13，该图为证实结合作用的凝胶。对新鲜收集的纯公牛精液补加25吗/ml空载体(图13的泳道1和3)或25吗/mlrFAA(图13的泳道2和4)，并温育20分钟，然后进行商业冷冻保存。然后融化精液，洗涤精细胞3次，通过采用抗HiSfe抗体的蛋白质印迹评价细胞裂解物。如在图13中所示，在补加rFAA的样品中检测到单一条带，表明向纯精液直接加入重组蛋白足以允许精细胞吸收。使用rTIMP-2观察到类似的结果(未显示数据)。这些结果的意义在于，它们确认所述治疗可直接应用于纯精液(以及已由精液中分离出来并重悬浮在不同介质中的精细胞)。表1.在冷冻保存、融化和于38。C温育3小时之后评价rTIMP-2和rFAA对精子活力(百分率)和顶体完整性(顶体完整率，PIA)的组合作用。精子被包装成10x106、20xl(^或25《106个精子/塑料细管。数据表示为平均值土SEM。提供所有剂量(25头公牛的65次射精液)的组合数据，之后提供通过多种精子浓度评价的一部分样品的组合数据。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>1实验精液样品在收集时补加25|ig/mlrTIMP-2和25貼/mlrFAA。所有样品都使用工业标准技术冷冻保存。2通过Studentt检验分析数据；上标表示于所示水平达到的显著性***p<o.ooOi、**p<o.01、*p<0.05、卞pO.lO。表1提供的结果表明了本发明的用途。含有FAA和TIMP-2组合的组合物为经受冷冻保存和融化的精子赋予统计学显著的活力增加以及统计学显著的PIA增加。两个参数(活力和PIA)均正好与人工授精的成功成正比。精子必须既是运动的，又具有完整顶体，以穿透卵子。先前按性別分拣以分离携带X-染色体的精子和携带Y染色体的精子的精液样品在冷冻保存后也经受3小时的应力测试。初步数据表明，精子与含有组合的rFAA和rTIMP-2的组合物接触将精子活力(％)和PIA分别改善了平均33.1%和42.5%。参见表2。表2.按性别分拣的精子在融化后3小时的活力和顶体完整率(PIA)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2提供了3头公牛的数据。使用按性别分拣的精子的其它实验正在进行中，以马全证rFAA和rTIMP-2在这些特化类型的精液样品中的冷冻保护作用。尽管样本量小，但提供于表2的数据是引人注目的。该数据强有力地表明，含有组合的FAA和TIMP-2的冷冻保存溶液显著增加冷冻保存精子的活力和PIA。如在表2中所示，治疗过的精子的活力与未治疗的对照相比增加33.1%。治疗过的精子的PIA与未治疗的对照相比增加42.5%。这些显著改善证实了本发明增加冷冻保存精子的功能性的用途。因此，本发明包括能够大量生产为重组融合蛋白的两种独立精液蛋白(rFAA和rTIMP-2)的转化细胞系。这些蛋白可用作精液添加剂，以改善精子功能，尤其是在冷冻保存精液中。根据经历冷冻保存的细胞对肝素诱导的获能的响应和顶体完整性的测定，含有这两种重组蛋白组合的组合物改善精子功能。(参见实施例和以上讨论)。这些精液添加剂增强顶体反应，精子膜被保护，在融化后产生更有功能的精液产物。在标准的冷冻保存精子和按性别分拣的冷冻保存精子中均表现出有益作用。本发明特别适合于按性别分拣精子的领域，因为已知按性别分拣的精子的活力和育性不如常规(未分拣的)精子，原因在于与分拣细胞群相关的应力。性控精液样品由本发明极大地获益，因为本发明的组合物和方法能够降低对融化后的活力和完整顶体的负面作用。因为与未性控的常规冷冻精液相比，当前的精子性控技术使每个授精塑料细管的性控精子更少，所以有益作用被进一步加强。因此，增加每塑料细管中存在的精子的功能性的本发明还改善对常规冷冻的响应不佳的公牛精液的育性。本发明还增加精子数减少的塑料细管和按性别分拣的塑料细管中的精子的功能性。简而言之，本发明能够增加性控塑料细管中的精子的功能性，以使这些按性别分拣的精液样品的育性与它们的未分拣的对应物相同。编码本文所述的重组蛋白的FAA和TIMP-2基因在哺乳动物之间具有高度同源性。因此，本发明适用于广泛范围的哺乳动物物种，包括所有的经济学上重要的牲畜、濒危动物和人。实施例包括以下的实施例仅是为了提供本文描述并要求保护的本发明的更完整的公开内容。实施例不以任何方式限制本发明的范围。除非另有说明，否则化学品和试剂由SigmaChemical(St.Louis，Missouri)商购获得。1.克隆和序列分析(a)2型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2):先前报告了24kDa精液肝素结合蛋白(HBP-24)的纯化(McCauley等，2001)。由精液纯化的HBP-24的微序列分析鉴定出20个N末端氨基酸残基，其与被鉴定为金属蛋白酶-2组织抑制剂(TIMP-2;DeClerck等，1989)的牛金属蛋白酶抑制剂的N-末端具有90%同一性。为克隆精液TIMP-2基因，基于已公布的牛大动脉cDNA序列(Boone等，1990)设计牛TIMP-2基因特异性引物。总RNA由牛副性腺组织(精嚢、尿道球腺和前列腺)提取。如McCauley等(2001)所述进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。部分TIMP-2cDNA的扩增是成功的，由每个牛副性腺产生RT-PCR产物。全部3个腺体的RT-PCR产物的DNA序列的分析表明，在它们之间以及与公布的cDNA序列(Boone等，1990)具有95%以上的同源性。随后，如下所述克隆和测序TIMP-2基因的完整编码区。(b)PCR扩增进行逆转录PCR，以由精嚢RNA扩增首链cDNA。cDNA合成由用5昭总RNA作为模板的SuperscriptIIRNA酶H—RT(GibcoBRL,GrandIsland,NewYork)催化。首链cDNA产物在TIMP陽2基因的部分cDNA区段的PCR扩增中用作模板，所述区段如McCauley等(200l)所述基于牛大动脉TIMP-2序歹ij(M32303)设计。基因特异性引物设计用于由精嚢扩增牛TIMP-2基因的完整编码序列。使用的引物为正向5'-atgggcgccgccgcccgcagcctgccgctcgcgttctgcctcctgctgctg-3，(SEQ.ID.NO:5)和反向5，-tcaatgatgatgatgatgatgcgggtcctcgatgtccagaaact-3，(SEQ.ID.NO:6)。PCR循环条件为45秒，94。C;45秒，57°C;和1分钟，72。C,35个循环。按照生产商的说明将扩增的PCR产物克隆到pCR4-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,California)中，并使用AppliedBiosystems373A自定化DNA测序仪使用DyeDeoxy牌终止子化学品测序。所有序列数据都用GCG软件(也称为Wisconsin软件包)(可由美国国立卫生研究所在线公开获得，10.0版)分析。分离并表征两种不同的克隆bTIMP-215L和bTIMP-225。第一个克隆bTIMP-215L具有包含bTIMP-2的完整前体的所有密码子的目标基因。bTIMP-225克隆编码成熟TIMP-2肽。除了TIMP-2序列以夕卜，每个克隆还都含有在cDNA的3'末端掺入的6xHis标签和终止密码子。对于该实施例，亚克隆bTIMP-225克隆，用于重组TIMP-2生产。TIMP-2cDNA用作模板，以扩增585bp的TIMP-2片段(SEQ.ID.NO:1),该片段编码成熟TIMP-2肽(195个氨基酸，SEQ.ID.NO:2)。为按读框保持可信的TIMP-2翻译，PCR产物设计成在蛋白的C-末端加入掺有His-标签的pCRT7/CT-TOPO载体(SEQ.ID.NO:11)。正向引物的序列为5，-atgtgcagctgctccccg-3，(SEQ.ID.NO:7);反向引物的序歹寸为5，-cgggtcctcgatgtccagaaactc-3，(SEQ.ID.NO:8)。在"MASTERCYCLER"⑧牌梯度热循环仪(Eppendorf,Westbury,NewYork)上用于PCR的循环条件为95°C,2分钟，后接35轮的94。C，l分钟；58°C,l分钟；和72°C，1分钟；最后的延伸于72°C进行10分钟。使用"TOPOTA"牌克隆试剂盒(Invitrogen)按照生产商的说明将新鲜PCR产物克隆入pCRT7/CT-TOPO载体中。2.育性相关抗原(FAA)由精清纯化出天然蛋白之后，首先通过反向高效液相层析(RP-HPLC)和微测序分析(McCauley等，1999)描述了FAA的化学特性。获得完整蛋白的N-末端序列以及lys-C消化的FAA的两个内部肽，并确定其与推断的人DNA酶I样蛋白(DNaselL3;Genbank登录号U56814)的肽序列同源。使用DNaselL3的5'和3'区賴:设计的寡核苷酸产生由牛副性腺RNA转录的592bpPCR产物。分离出该PCR产物，并连接入pCR③2.1-TOPCf克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,California)中，通过5，RACE(即5'互补DNA末端的快速扩增；参见Atow"Me,Ao^(2005),第2巻，629-630页，该文献通过引用结合到本文中)延伸。这导致鉴定出FAA的900bpcDNA(其描述于美国专利第6,891,029号)。起始密码子在92bp的5'UTR之前，终止密码子不在ORF中。因此，分离的cDNA序列代表部分FAAcDNA。使用SignalP3.0(生物序列分析中心，Lyngby,Denmark)检验预测的蛋白揭示，氨基酸残基1-20代表信号肽(Bendtsen等，2004)。成熟肽序列由此在肽切割位点之后的bp153开始。将先前报告的天然FAA蛋白的氨基酸序列(McCauley等，1999)嵌入FAAcDNA的推断蛋白序列中，由此验证已克隆了对应于天然FAA的可信cDNA。用Blast检索引擎(Altschul等，1990)进行序列分析揭示了与DNA酶I样III(U56814)的763bp区段的同一性(88%),DNA酶I样III为1079bp的cDNA，具有305个氨基酸的ORF(在切割信号肽之后为285个氨基酸)。一级蛋白结构使用保守区数据库(ConservedDomainDatabase)(可通过美国国家生物#支术信息中心，Bethesda,Maryland获得)和ExPASy(蛋白质专家分析系统(ExpertProteinAnalysisSystem))蛋白质组服务器序列分析工具(可通过瑞士生物信息学研究所，Geneva,Switzerland获得)分析。部分FAAcDNA(约全部的90%)编码269个氨基酸的蛋白，该蛋白的估计分子量为30.8kDa(在切割信号肽后为28.7kDa)，预测的等电点(pl)为9.0(Wilkins等，1998)。这些预测与通过SDS-PAGE测定的为31kDa的天然FAA的表观分子量和通过2-D电泳卩险测的石威性pi(McCauley等，1999)相一致。牛FAAcDNA克隆(参见美国专利第6,891,029号)用作模板，以通过PCR扩增新的重组核苷酸片段(603bp，SEQ.ID.NO:3)，该片段被用作生产rFAA的表达克隆。新设计的寡核苷酸正向引物5，-atggagaagctaaacggaaat-3，(SEQ.ID.NO:9)和反向引物5，-gctgacatccagggccttc-3，(SEQ.ID.NO:10)成功地扩增了FAA基因的603bp产物(DNA示于SEQ.ID.NO:3，编码蛋白示于SEQ.ID.NO:4)。用于在mastercycler梯度热循环仪(Eppendorf，Westbury,NY)上进行PCR的循环条件为94。C,2分钟，接着94°C，1分钟，35个循环；55°C，l分钟；以及72。C，1分钟；于72°C进行10分钟的最终延伸。如上所述使用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen)按照生产商的推荐将新鲜的PCR产物直接克隆入pCRT7/CT-TOPO表达载体中。使用TOP10F，OneShot⑧化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)转化克隆的产物。转化反应于冰上温育(30分钟)，并于42。C热激30秒。在加入250|ulSOC介质后，将每个转化反应置于37°C、200rpm的EnvironLab-line摇床(BarnsteadInternational,Dubuque,Iowa)中达1小时。将等份(50fil)的每种转化物分布在预温热的、补加50fig/mL氨苄青霉素的选择性LB平板(1.0%胰胨、0.5%酵母提取物、1.0%NaCl、1.5%琼脂糖，pH7.0)中，并于37°C过夜温育。然后选择来自各个转化的单细菌菌落，并接种入含氨千青霉素(50pg/mL)的LB培养基中，于37°C的振摇(225rpm)温育箱中再温育16小时。收获细胞，通过小型制备方法(Qiagen小型制备离心柱；Qiagen，Valencia,Califomia)按照生产商的说明纯化DNA。Re-PCR使用上述的相同寡核普酸引物进行，以证实在质粒DNA制备物中存在或不存在FAA插入片段。选择阳性克隆，并在亚利桑那大学的DNA测序工作室测序(AppliedBiosystems373A自动化DNA测序仪，使用DyeDeoxyTM终止子化学)。PCR产物通过在含有溴化乙锭(EtBr;5jug/mL)的TBE緩冲液(90mMTris，90mM硼酸，2mMEDTA,pH8.3)中进行琼脂糖凝胶(2。/。重量/体积)电泳来分析，并通过紫外线照射来显现。在水平凝胶装置(Bio-Rad)中以75V进行20分钟的凝胶电泳，接着以100V进行，直至完成。100bp的PCRDNA梯(EZLoad100bpMolecularRuler,Bio-Rad)用作参比标准。分析凝胶图像，并使用紫外灯箱和连接AlphaImager软件(AlphaInnotechCorporation,SanLeandro,CA)的CCD照相机捕获。用GCG软4牛(10.0版,GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin.)和可由SanDiego超级计算机中心(SanDiego，California)在线获得的BiologyWorkBench3.2版软件进行核苷S吏序列分析和比较。3.rTIMP-2和rFAA的转化和表达按照生产商的说明将rTIMP-2和rFAA构建体(10ng)单独转化入OneShotBL21(DE3)pLysS细胞(Invitrogen)中。将细胞与DNA混合，在冰上温育30分钟，于42。C热激30秒。加入培养基(250piSOC)，并于37。C在振摇温育箱(Innova4000,NewBrunswickScientificCo.Inc.,Edison,NewJersey)中温育30分钟。然后将溶液加入含有100昭/mL氨千青霉素和34|ug/mL氯霉素的10mLLB培养基中，将细胞于37°C振摇过夜培养。未用DNA(空载体)转化的OneShotBL21(DE3)pLysS细胞用作蛋白表达研究的阴性对照。将过夜培养物接种入500mL至1L的含有氨千青霉素和氯霉素的LB培养基(1%胰胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl)中并培养，直至它们达到约0.6的O.D.(约2-3小时)。以0.5mM终浓度加入IPTG(异丙基(3-D-硫代半乳糖苷)，以诱导rFAA或rTIMP-2的表达，培养物在振摇下于37°C再生长4小时。通过离心(3，000xg,20分钟，4。C)收集细胞，储存于-20。C,直至纯化。进行初步实验，以确定最佳蛋白表达的时程，并确定重组蛋白是表达为可溶性蛋白还是包涵体形式的不溶性物质。在用IPTG诱导后0、2和4小时收集0.5mL液体培养物的细菌细胞沉淀，并用0.5mL裂解緩冲液(50mMKPO4、400mMNaCl、100mMKCl、10%甘油、0.5。/。曲通X-100、10mM咪唑，pH7.8)提取。将样品重悬浮在裂解缓沖液中，在干水上冷冻，于42。C融化3次。通过以13,000xg离心1分钟沉淀不可溶蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝胶对溶解性和不溶性级分进行SDS-PAGE(Laemmli,1970)。将预染色的分子量标记(PrecisionPlus-牌双色标准品，Bio-RadLabs,Hercules,California)力卩至1条泳道。进行平行凝胶电泳，1个凝胶用考马斯蓝(亮蓝R-250)染色，另一个凝胶的蛋白转移至硝酸纤维素膜(Trans-blot(0.2pm),Bio-Rad)，该膜用抗-His(C-末端)-HRP缀合抗体(Invitrogen,用含3%吐温-20(PBS-T)的磷酸緩沖盐水1:5000稀释)探测。两种重组蛋白的检测基于存在掺入到表达蛋白的C-末端上的C-末端聚组氨酸标签(His6-标签)。(参见SEQ.ID.NO:11和12)。印迹的膜用PBS-T+5Q/。牛血清白蛋白(BSA)封闭，之后与抗体温育。膜用PBS-T+1%BSA淋洗3次，印迹通过在HRP底物(TMB，Promega,Madison,Wisconsin)中温育显色。4.rTIMP-2和rFAA的纯4b以每升培养物(12.5倍浓缩提取物)80mL变性提取緩冲液(8M尿素、50mMNaP04、300mMNaCl,pH7.0)裂解所收集的rTIMP-2或rFAA表达培养物的细菌细胞沉淀，并进行3次冻融循环，以确保如上所述的细胞完全破碎。通过以13,000xg离心澄清提取物，重组蛋白使用BDTalon-牌固定化金属亲和层析树脂(BDBiosciences,MountainView,Califomia)按照生产商的说明纯化。澄清的提取物与平衡的Talon树脂混合(8mL浓缩提取物/mL树脂)20分钟，未吸附的物质通过离心去除，用变性提取緩冲液洗涤树脂2次。通过向提取緩冲液加入250mM咪唑由树脂洗脱重组蛋白。收集并合并3个床体积，之后取等份试样进行电泳。重组蛋白的纯度通过SDS-PAGE评价，蛋白的鉴定通过如本文所述的采用抗His抗体的蛋白质印迹来证实。5.复性(a)rT證-2:纯化的rTIMP-2通过多步透析复性。对于rTIMP-2重折叠，合并洗脱的级分，并在还原剂存在下透析(SnakeSkin透析管，10kDaMWCO,Pierce,Rockford,Illinois)，以防止在初始重折叠过程中的二硫化物交联。通过透析去除还原剂，加入碌u氧还试剂，以催化正确的二碌b4建形成，并用^f奮改的Novagen所述方法(EMDBiosciences,SanDiego:California)抑制非生产性二碌u化物中间体的形成。初始透析于25°C在50X体积的变性还原緩冲液(20mMTris-Cl、6M尿素、10mM卩-巯基乙醇(I3-ME)，pH8.5)中进行4小时。用新鲜的变性、还原緩冲液更换緩冲液，并于25°C继续透析4小时。接着，将透析緩冲液换为非变性的还原緩沖液(20mMTris-Cl、10mM(3-ME，pH8.5)，于4°C进行至少4小时的透析。然后用20mMTris-Cl,pH8.5更换緩沖液，于4。C继续透析至少4小时。然后，蛋白于4。C对25X体积的已冷却的氧还重折叠緩冲液过夜透析，所述緩沖液含有20mMTris-Cl、1mMGSH(还原的谷胱甘肽)、0.2mMGSSG(氧化的谷胱甘肽)，pH8.5。错折叠蛋白的不溶性聚集物通过离心去除，并澄清。重折叠的蛋白于4°C对20mMTris-Cl，pH7.4透析3小时。可溶性蛋白通过超滤(iCON浓缩器，9kDaMWCO,Pierce)浓缩，通过蛋白测定(BCA测定，Pierce)定量。吸光度用光度适应计(Eppendorf,Westbury，NewYork)测定，使用在最后的透析緩沖液中制备的BSA标准品经非线性回归多点校准曲线计算浓度。等分蛋白样品，并储存于-20。C。(b)rFAA:通过首先对50X体积的含有50mMNaP04、150mMNaCl、6M尿素、0.2ML-精氨酸，pH8.0的緩冲液(25。C)进行多步透析，逐渐地4吏纯化的rFAA复性。4小时后，用含有50mMNaP04、150mMNaCl、4M尿素、0.2ML-精氨酸，pH8.0的緩沖液更换透析緩冲液，时间达4小时，之后对50mMNaP04、150mMNaCl、2M尿素、0.1ML-精氨酸，pH8.0过夜透析。通过在透析后离心去除错折叠蛋白的不可溶聚集物。通过超滤浓缩溶解性蛋白，并通过如上所述的蛋白测定定量。6.肝素诱导的获能将纯化的重组蛋白加入在获能条件下温育的精液样品，以确定rTIMP-2和/或rFAA是否加强用肝素获能后的顶体反应。在37。C水浴中将冷冻保存的精液融化15秒，用1mLTALP(tyrode氏白蛋白、乳酸盐、丙酮酸盐)介质(100mMNaCl、3.1mMKCl、25mMNaHC03、0.3mMNaH2PO4、21.6mM乳酸钠、2mMCaCl2、0.4mMMgCl2、10mMHepes、1mM丙酮酸盐、6mg/mLBSA、50吗/mL庆大霉素，pH7.4)洗涤3次。如前所述(Parrish等，1988)，在肝素(IO昭/mL;来自猪'J、肠粘月莫的钠盐；ScientificProteinLaboratories,Waunakee,Wisconsin)存在下，将4头公牛的洗涤过的精子与渐增浓度的纯化的rTIMP-2或rFAA(O、6.25、12.5、25、50、100或200吗/mL的TALP介质溶液)于38°C温育4小时，以诱导获能。将两种重组蛋白以0、25或50pg/mL的浓度加入交叉剂量反应实验，以检验重组体对获能的加合或协同作用。来自用空载体转化的细胞的细菌细胞裂解物(200吗/mL)用作阴性对照。在4小时温育后，加入100吗/mL的融合剂溶血性磷脂酰胆碱(LPC),以在先前获能的精子中诱导顶体反应。将每个剂量反应测定中的1个样品与单独的肝素温育4小时，不加入LPC，以确定自发顶体反应的发生率。在LPC处理后，离心精子，将沉淀重悬浮在PBS中，再通过离心沉淀精子。立即将精子在冷乙醇中固定20分钟，用PBS淋洗，在预温载玻片(Esco氟载玻片，ErieScientific,Portsmouth,NewHampshire)上风干。于4°C将精子与5吗/mL缀合荧光素的PSA(FITC-豌豆凝集素，VectorLabs,Burlingame，California)在黑暗中温育30分钟，以染色顶体内容物。用双蒸H20淋洗载玻片，加入vectashield封片剂，覆盖盖玻片，并用指甲油密封。用配有400X放大率的Nomarski镜片的Leica(LeitzDiaplan)落射焚光显微镜检查载玻片的顶体反应。因在精子的顶体帽中的细胞具有荧光染色观察到具有完整顶体的未反应精子，而顶体反应性精子由赤道带的荧光染色模式或无头部荧光指示。7.膜稳定性于38。C对来自25头公牛的新鲜射精的纯精液补加20分钟的rTIMP-2和rFAA(各25昭/mL)(剂量基于上述的顶体反应剂量反应研究)或未诱导的细胞裂解物(阴性对照)。分析25头公牛的一部分的复份射精液，以便评价总共65个射精液。奶牛和肉牛均示于数据集中。以一步卵黄柠檬酸盐TRIS混合剂稀释精液，并在水夹套中冷却至5°C;包装塑料细管，并在液氮罐中的架子上于静态蒸汽中冷冻(60个塑料细管/架子)。以总计IO、20或25xl(^个精子/塑料细管包装精液。融化塑料细管，精子于38。C温育3小时。然后在配备Nomarski镜片的NikonEclipse80i显^t镜上测定活动精子数和失去顶体膜的精子数。如上所述，对来自3头公牛的按性别分拣的精子补加rTIMP-2和rFAA(各为0或25|ug/mL)，冷冻保存，融化，并温育3小时。按照所述方式记录活力(％)和完整顶体(％)。8.育性实验为确定向用于人工授精的精液加入rTIMP-2和rFAA是否改善育性，在育性实验中使用分步射精液。等分新鲜射精液，一半用rTIMP-2十rFAA(各25昭/mL)强化，余下样品不进行处理，以用作阴性对照。以恒定精子浓度(20x106个精子/塑料细管，使用标准技术)分批冷冻保存精子。质量控制标准证实用于实验的精子在融化后表现出>50%的活力。5头Holstein公牛用作精液供体。在两个区域每头公牛每次处理分配至少300次授精(总共1200次授精)，以便产生充足的统计效力，从而检测对育性的治疗效力。育性基于妊娠诊断计算，妊娠诊断在授精后约45-60天由畜群兽医经直肠触诊进行。预期育性呈统计学显著性增加。使用相同的重组物质进行另外的育性实验。然而，在此第二个育性实验中，要强化的样品含有按性别分拣的精子，而不是纯精液。在分离携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子之后，向样品加入上述形式的重组蛋白，精液以多种浓度的精子/塑料细管冷冻保存。9.统计学分析使用Excel和SAS/STAT软件进行数据分析。使用成对的双样品T检验分析对照和重组体治疗的精子在具有完整顶体膜的精子百分率(PIA)或活力方面的差异。通过ANOVA和FisherLSD4t验分析获能治疗之间的差异。计算所有数据的最小二乘法平均值。显著性水平设定为p<0.05。使用SAS中的CATMOD方法分析由计划的育性实验产生的分类育性数据(成功的授精对不成功的授精)，以使治疗组之间不等授精数的有害效应最低。主要作用包括雄性、治疗、精子浓度、批次(射精)和所有相互作用。参考书目Altschul,S.F.,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers和D丄Lipman.Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol"1990;215:403-410.Ax,R丄.,K.Dickson,R.W.Lenz.InductionofAcrosomeReactionsbyChondroitinSulfatesInVitroCorrespondstoNonreturnRatesofDairyBulls.J.DairySci.,1985;68:387-390.Ax,R丄.和R.W.Lenz.GlycosaminoglycansasProbestoMonitorDifferencesinFertilityofBulls.J,DairySci.,1987;70:1477-1486.Baumgart,E.，S.V.Lenk，S.A.Loening和K.Jung.Tissueinhibitorofmetalloproteinases1and2inhumanseminalplasmaandtheirassociationwithspermatozoa.Int.J.Androl"2002;25(6):369-371.Bellin,M.E.，H.E.Hawkins和R丄.Ax.Fertilityofrangebeefbullsgroupedaccordingtopresenceorabsenceofheparin-bindingproteinsinspermmembranesandseminalfluid.J.Anim.Sci.，1994;72:2441-2448.Bellin,M.E.,H.E.Hawkins,J.N.Oyarzo，R丄Vanderboom和R丄.Ax.Monoclonalantibodydetectionofheparin-bindingproteinsonspermcorrespondstoincreasedfertilityofbulls.J.Anim.Sci.,1996;74:173-182.Bellin,M.E.，J.N.Oyarzo,H.E.Hawkins,H.M.Zhang,R.G.Smith,D.W.Forrest,LR.Sprott和R丄.Ax.Fertilityassociatedantigenonbullspermindicatesfertilitypotential.J.Anim.Sci.，1998;76:2032-2039.Bendtsen,J.D.，H.Nielsen,G.vonHeijne和S.Brunak.Improvedpredictionofsignalpeptides:SignalP3.0.J.Mol.Biol"2004;340:783-795.Blom,N.,S,Gammeltoft和S.Brunak.Sequence-andstructure-basedpredictionofeukaryoticproteinphosphorylationsites.J.Mol.Biol.,1999;294:1351-1362.Boone，T.C.,MJ.Johnson,Y.A.DeClerck和K.E.Langley.cDNAcloningandexpressionofametalloproteinaseinhibitorrelatedtotissueinhibitorofmetalloproteinases.Proc.Natl.Acad.Sci"1990;87:2800-2804.Brew,K.，D.Dinakarpandian禾口H.Nagase.Tissueinhibitorsofmetalloproteinases:evolution,structureandfunction.Biochim.Biophys.Acta.,2000;1477:267-283.Buchman-Shaked,O.,Z.Kraiem，Y.Gonen禾口S.Goldman.Presenceofmatrixmetalloproteinasesandtissueinhibitorofmatrixmetalloproteinaseinhumansperm.J.Androl"2002;23(5):702-708.Calvete，J丄，P.F.Varela,LSanz，A.Romero,K.Mann和E.Topfer-Petersen.Aprocedureforthelargescaleisolationofmajorbovineseminalplasmaproteins.ProteinExpr.Purif.，1996;8:48-56.Dawson,G.R.，M.E.Bellin,J.N.Oyarzo，H.E.Hawkins,M.J.ArnsandR丄.Ax.PresenceofTIMP-2onspermcorrespondstofertilityofrangebeefbulls.27thAm.Soc.Androl.Mtng.,2002;Seattle,WA(Abstr.121).DeClerck,Y.A.，T,D.Yean,B丄Ratzkin，H.S.Lu和K.E.Langley.Purificationandcharacterizationoftworelatedbutdistinctmetalloproteinaseinhibitorssecretedbybovineaorticendothelialcells.J.Biol.Chem.,1989;264:17445-17453.Hulboy,D丄.，L.A.Rudolph和L.M.Matrisian.Matrixmetalloproteinasesasmediatorsofreproductivefunction.Mol.HumanReprod.,1997;3(l):27-45.Kishi,K.，T.Yasuda，S.Awazu和K.Mizuta.GeneticpolymorphismofhumanurinedeoxyribonucleaseI.Hum.Genet"1989;81:295-297.Lenz,R.W.,J丄.Martin,M.E.Bellin和R.L.Ax.PredictingFertilityofDairyBullsbyInducingAcrosomeReactionsinSpermwithChondroitinSulfate.J.DairySci.,1988;71:1073-1077.McCauley，T,C.,H.M.Zhang,M.E.Bellin和R.L.Ax.PurificationandcharacterizationofFertility-AssociatedAntigen(FAA)inbovineseminalfluid.Mol.Reprod.Dev.,1999;54:145-153.McCauley,T.C.,H.M.Zhang,M.E.Bellin,andR丄.Ax.Identificationofaheparin-bindingproteininbovineseminalfluidastissueinhibitorofmetalloproteinases-2.Mol.Reprod.Dev.,2001;58:336-341.McCauley,T.C.,G.R.Dawson,J.N.Oyarzo,J.McVicker,S.H.F.MarksandR.L.Ax.Developingandvalidatingalateral-flowcassetteforfertilitydiagnosticsinbulls.InVitroDiagnosticTechnology,2004;10:35-40.Metayer,S.,F.Dacheux,J丄.DacheuxandJ丄.Gatti.Comparison,characterization,andidentificationofproteasesandproteaseinhibitorsinepididymalfluidsofdomesticmammals.Matrixmetalloproteinasesaremajorfluidgelatinases.Biol.Reprod.,2002;66(5):1219-1229.Nagase，H.禾口丄F.Wbessner，Jr.Matrixmetalloproteinases.J.Biol.Chem"1999;274:21491-21494.Parrish,J丄，J丄.Susko-Parrish，M.A.WinerandN丄.First.Capacitationofbovinespermbyheparin.Biol.Reprod.，1988;38:1171-1180.Rodriguez,A.M.,D.Rodin，H.Nomura,C.C.Morton,S.WeremowiczandM.C.Schneider.Identification,localization,andexpressionoftwonovelhumangenessimilartodeoxyribonucleaseI.Genomics,1997;42:507-513.SAS用户指引Statistics,8.0版，1999.SASInst.，Inc.,Cary,NC.Shimokawa,K,M.Katayama，Y.Matsuda,H.Takahashi，I.HaraandH.Sato.Complexesofgelatinasesandtissueinhibitorofmetalloproteinasesinhumanseminalplasma.J.Androl.,2003;24(l):73-77.Siu，M.K.和C.Y.Cheng.Interactionsofproteases,proteaseinhibitors,andthebetalintegrin/laminingamma3proteincomplexintheregulationofectoplasmicspecializationdynamicsintherattestis.Biol.Re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