快速高效获得无菌哺乳动物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及实验动物科学领域。具体地说，本发明涉及一种快速高效获得无菌哺 乳动物的方法以及所获得的无菌哺乳动物的用途。
【背景技术】
[0002] 随着医学和生物学的迅猛发展，作为生命科学支撑条件的实验动物学也得到了前 所未有的重视，不但实验动物学研究内容进一步拓展、加深；而且对于高级别的实验动物的 需求也越来越多，要求越来越严格。从普通级别实验动物的被取消，到清洁级动物，无特定 病原体动物（Specific pathogen-free animal, SPF)的大量需求，再到无菌动物包括各种 已知微生物的实验动物（悉生动物），为生命科学的研究的精细化、数量化、稳定可重复性 提供了支撑。
[0003] 然而，各种高级别的实验动物必须饲养在特定的SPF屏障系统中，而无菌动物饲 养的条件更加严格，稍有不慎很容易感染细菌病毒，即使是非致病菌，也造成了微生物等级 的下滑。低级别的实验动物必须通过环境消毒配合生物净化的手段来重新获得高级别实验 动物。
[0004] 传统的生物净化为剖腹取胎，即将待净化的动物交配怀孕，等到接近临盆的时候， 剖腹，连同子宫和胎儿通过净化药液进入隔离手术操作器内，剖开子宫取出胎儿，待胎儿能 自由呼吸后传送给带奶母鼠，哺乳到断奶。这种传统的剖腹取胎的方式的缺点在于：1、当发 生大规模污染时，不能尽快的恢复较大的种群，需要时间间隔较长；2、剖腹取胎容易造成剖 腹过程中仔鼠死亡，主要由于仔鼠肺部不能及时张开自主呼吸；3、剖腹取胎的仔鼠容易被 带奶母鼠吃仔，因为带奶母鼠天然的母性，会将不是自己所生的仔鼠咬死，甚至吃仔。
[0005] 现有技术中虽然也有一些其它替代方法，但对于最高级别的实验动物-无菌动物 而言，这些方法依然存在存活率低（不足50% )、净化所需要时间周期长（60天左右）、种群 大（制备代乳母鼠的雌鼠及与之交配的雄鼠；需要生物净化的雌鼠及与之交配的雄鼠）等 缺陷。
[0006] 因此，本领域急需一种快速、高效、简便而且成功率高的无菌哺乳动物制备方法， 从而能够用于生物学或医学研究工作。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种快速、高效、简便而且成功率高地制备无菌哺乳动物的 制备方法，以及采用本发明方法制备得到无菌哺乳动物作为标准实验动物的用途。
[0008] 在第一方面，本发明提供一种无菌哺乳动物的制备方法，所述方法包括以下步 骤：
[0009] a).获得雄性哺乳动物的精子并使所得精子获能；
[0010] b).获得雌性哺乳动物的卵子；
[0011] C).利用步骤a)获得的精子与步骤b)获得的卵子制备受精卵；
[0012] d).获得无精雄性哺乳动物；
[0013] e).制备假孕雌性哺乳动物；
[0014] f).利用步骤c)获得的受精卵制备胚胎；
[0015] g).获得含有步骤f)所得胚胎的假孕雌性哺乳动物；和
[0016] h).无菌培养步骤g)获得的雌性哺乳动物，得到无菌哺乳动物。
[0017] 在优选的实施方式中，步骤(1)、6)和〇在36°(：-37°(：的温度以及45%-70%的湿 度下进行。
[0018] 在优选的实施方式中，步骤(1)、6)和〇在36.5°(：-37°(：的温度以及50%-60%的 湿度下进行。
[0019] 在优选的实施方式中，步骤b)所述的雌性哺乳动物是超排卵雌性哺乳动物。
[0020] 在优选的实施方式中，所述超排卵雌性哺乳动物是通过给予药物获得，或者是经 遗传改造获得的，或者商品化购得。
[0021] 在优选的实施方式中，步骤d)所述的无精雄性哺乳动物通过给予药物获得，或者 是经遗传改造获得，或者商品化购得。
[0022] 在优选的实施方式中，步骤f)制备的胚胎是2-8细胞期胚胎，优选2细胞期胚胎。
[0023] 在优选的实施方式中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴。
[0024] 在优选的实施方式中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或豚鼠。
[0025] 在优选的实施方式中，所述方法还包括利用步骤h)获得的无菌哺乳动物制备悉 生哺乳动物。
[0026] 在优选的实施方式中，本发明方法获得无菌哺乳动物的存活率为多30%，优选 彡50% ;最优选彡70%。
[0027] 在第二方面，本发明提供通过本发明第一方面所述方法制备的哺乳动物作为标准 实验动物的用途。
[0028] 在优选的实施方式中，所述哺乳动物可用于研究某些疾病的病原、研究微生物与 宿主、微生物间的拮抗作用、研究病毒病、研究细菌学、免疫发生发展机制、放射医学等等。
[0029] 在优选的实施方式中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴；优 选地，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或豚鼠。
[0030] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具体实施方式】
[0031] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在特定的温度和湿度下，结合体 外受精-胚胎移植技术，可以迅速、方便地完成低微生物级别的生物净化工作；由于胚胎直 接移植给高级别的假孕母兽，这样可以让假孕母兽自然分娩，自然哺乳，避免了剖腹取胎中 出现的仔兽的死亡和被死亡，从而显著提高仔鼠的存活率。在此基础上完成了本发明。
[0032] 本文所用的术语，"悉生动物"（Gnotobiotic animal)，也称为已知菌动物或已知 菌丛动物（Animal with Known Bacterial Flora)，是指采用与无菌动物相同的方法取得 饲养（剖腹取胎，在隔离器内饲养）、但明确给予已知微生物的动物，即，含有已知的单菌 (Monoxenie)、双菌（Dixenie)、三菌（Trixenie)或多菌（Polyxenie)的动物。
[0033] 悉生动物的培育、悉生状态的维持、悉生动物与其体内外栖息体或栖息体间以宿 主为载体展开的相互竞争、拮抗的复杂生态过程，以及这种过程导致的后果的控制和利用， 称为悉生动物学。实验动物在现代化发展过程中，吸取悉生动物的净化与悉生工程的屏障 技术，发展了以控制动物体内外微生物寄生虫为核心的实验动物的环境控制，并以这种生 物控制为标准，把实验动物分为以下几个级别：1)无菌实验动物（Germ-free animal) ;2) 悉生实验动物（Gnotobiotic animal):包括无抗体实验动物（Antibody-free animal)、 已知微生物体实验动物（Gnotophoric animal) ;3)无特定病原体实验动物（Specific pathogen-free animal) ;4)清洁级实验动物（Cleaning animal);和5)普通级实验动物 (Conventional animals)。2001年颁布的《实验动物质量管理办法》和《实验动物许可证 管理办法》中明确不再提供普通级实验动物，实验动物必须达到清洁级或以上标准。
[0034] 高级别实验动物在医学和生命科学的运用，保证了实验结果的可靠性、可重复性、 精确性，并能以最小数量的实验动物获得最多的、可用的实验数据，这也符合国际实验动物 领域一直宣传的3R原则（减量化（reducing)，再利用（reusing)和再循环（recycling))。 清洁级实验动物是目前国内科研工作主要要求的标准实验动物，适用于大多数科研实验。 无特定病原体实验动物（SPF)是理想的健康动物，用它来研究，可排除疾病或病原的干扰， 适用于所有科研实验、生物制品生产及检定，是国际公认的标准实验动物。
[0035] 本文所用的术语"无菌动物"(GF)是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。 从微生物学的观点看，通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒， 而且还都难于排除某些潜在的传染病。此外，普通实验动物的血清中含有抗体。所以用普 通动物进行医学科学研究，将会存在各种各样的干扰，实验结果往往不确切。使用无菌动 物作实验就可以克服普通实验所存在缺点，使实验结果正确可靠。无菌动物是一种非常规 动物，仅适用于特殊研究目的，如微生物与宿主、微生物间的相互作用，免疫发生发展机制， 放射医学等方面的研究。例如，无菌动物可用于研究某些疾病的病原：无菌动物可提供组 织培养的无菌组织