一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的NOS3基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供精子细胞凋亡相关基因检测，并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
【专利说明】—种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，可用于评估精子细胞凋亡相关基因检测，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]无精症、少精症是最为常见的男性不育原因之一。据世界卫生组织统计，全球约有10%~15%育龄夫妇因各种因素影响不能正常生育，其中男性因素占到一半，15%~20%的男性病因是由无精子症所致。目前认为生精相关基因的缺失、突变和遗传多态性是男性生精障碍的重要遗传病因。
[0003]精子发生过程受许多基因的精密调控，基因缺失或突变均可导致精子发生过程中断。精子成熟是精原细胞增殖、分化、凋亡的精确调控过程，其中生精细胞凋亡调控尤为重要。生精细胞凋亡参与维持精子发生过程的动态平衡，维持支持细胞与生精细胞的最佳比例，清除基因异常生殖细胞，调节生精过程中精子数量和质量，是机体保持生殖遗传稳定的重要防御机制。精子成熟是精原细胞增殖、分化、凋亡的精确调控过程，其中生精细胞凋亡调控尤为重要。凋亡可清除异常精细胞并稳定精子数量。现已明确FAS/ FASLG、p53和Bcl-2基因家族等基因通过不同途径参与精细胞凋亡。精细胞凋亡是一个自发性的凋亡过程，凋亡相关基因变异而引发精细胞凋亡不足或过度都会影响精子数量和质量，从而引发生精障碍，最终导致男性不育。
[0004]在自然状态和正常生精过程中，环境因素如激素、温度、化学药物和放射线及肿瘤均可诱导生殖细胞凋亡。研究证明，睾丸生精细胞凋亡对电离辐射敏感，很低剂量照射诱导生精细胞凋亡增加。睾酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。促卵泡激素被拮抗或其水平降低，都可导致生殖细胞凋亡调控异常。
[0005]由于遗传体质的不同，不同机体的生精细胞凋亡调控也有所差异，而这种差异会影响到机体不育症的易感性。通过检测可以了解自身凋亡相关基因的情况，远离电离辐射并改善吸烟等不健康的生活方式，适当补充锌硒等营养素，提高精子质量，孕育健康宝贝。
[0006]研究发现N0S3、FASLG基因与中国男性精子细胞凋亡有关。
[0007]基因简介:N0S3全称 nitric oxide synthase 3 (endothelial cell),中文名为内皮型一氧化氮合成酶。定位于7q36，全长23，529bp，mRNA长4，327nt，编码由1，203个氨基酸残基组成的蛋白质。N0S3主要分布于冠状血管及心腔面的内膜，主要功能是参与精氨酸和脯氨酸代谢， 并催化生成一氧化氮(NO)。NO是一种内皮松弛因子，具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和白细胞粘附等重要功能，参与多种疾病的病理生理过程。
[0008]内皮型一氧化氮合成酶(N0S3)合成NO的功能，需要依赖蛋白激酶B (PKB/Akt)的激活。蛋白激酶B (PKB/Akt)通过磷酸化eNOS将其激活，并启动在内皮的一氧化氮合成反应。eNOS上与蛋白激酶B (PKB/Akt)磷酸化反应相关的一些氨基酸如果发生改变，就将影响到eNOS的功能和NO的合成。NO合成后，将启动cGMP依赖的一系列反应。在这个过程中，NO表现为一种第二信使，通过cGMP继续传导信号，可以达到舒张血管、调节血流等功能和作用。NO-cGMP通路还关系到机体的能量平衡，并由此对机体其它各个方面产生影响。
[0009]位点简介:N0S3 G894T是位于基因第8号外显子上的一个G/T突变，其第894位碱基G突变成T，相应蛋白产物第298位上的谷氨酸则被替换成天冬氨酸(Glu298Asp)。此突变为错义突变，导致N0S3结构成分发生改变，从而降低酶活性。
[0010]一氧化氮合酶(NOS)属于黄素蛋白类，包括神经型NOS(nNOS)、诱导型N0S( iNOS)和内皮NOS (eNOS)。NOS是体内催化左旋精氨酸和分子氧相互反应的限速酶，睾丸内反应生成的NO含量可调节性激素水平、睾丸的生精功能、睾丸微循环和精子质量。人eNOS基因发生变异，其编码的NOS成分和含量则发生变化，从而影响睾丸NO含量生成。NO生成过多或过少导致睾丸生精功能及精子生活内环境发生改变，引起少精、死精、精子质量降低等病理变化。
[0011]基因简介=FASLG基因定位于lq23，与0X-40L基因相邻，由5个外显子组成。FASLG只表达于活化T淋巴细胞，其它细胞如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及胸腺细胞都不表达FASLG，但在睾丸组织中，却可见到高表达的FASLGt5FASLG由胞膜外区(179aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(77aa)组成，N端150个氨基酸为TNF超家族同源区，同源性主要表现在形成b折叠股的序列，在b折叠股c和d之间有一对保守的二硫键，对其空间结构的形成有作用。FASLG在胞膜外区有4个N-糖基化位点，经过糖基化的FASLG的分子量为36-43kD。 [0012]FAS / FASLG是介导精细胞凋亡的一对膜蛋白，FAS为I型跨膜受体蛋白，其配体FASL则是II型跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子家族，可触发交叉连接与FAS细胞死亡信号级联。FAS和FASLG基因表达仅限于生殖细胞和支持细胞中，FAS和FASLG交联后传导细胞凋亡信号，引起FAS抗原表达细胞凋亡。人类FAS和FASLG基因在睾丸发育的不同阶段表达引发异常生殖细胞凋亡，上述两个基因启动子序列碱基分布多态性可影响转录活性而导致正常精细胞凋亡引发生精障碍。
[0013]位点简介:FASLG C844T是位于FASLG基因启动子区的一个C/T多态，位于CAAT/增强结合蛋白p元件(C/EBP ^ )的一段结合序列内。FASLG C844T多态性可能会影响FASLG的表达，进而影响FASLG介导的凋亡信号转导。
[0014]本发明的目的是提供一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
【发明内容】
[0015]本发明的目的是提供一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
[0016]为实现以上目的，本发明提供一种精子细胞凋亡相关基因检测方法。其具体步骤为:
步骤1:检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2:基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一 2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3:荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即一氧化氮合酶(N0S3)rsl799983,TNF-a家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?_MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为IOMl,即浓度为20ng/m的DNA模板2W ,m IOX荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去离子水4.98W、3个位点分别采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向引物(20剛，0.225|^1)、￥1(:荧光探针(10剛，0.25W )和FAM荧光探针(10剛，0.25W)工具进行检测，基因序列及其引物探针如下:
一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983
【权利要求】
1.一种精子细胞凋亡相关基因检测方法，其特征在于，具体步骤为 步骤1:检测的样品类型与采样方法 用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本； 步骤2:基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一 2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测； 步骤3:荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即一氧化氮合酶(NOS3)rsl799983,TNF-a家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔； 每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?_MGB技术，进行检测试剂合成； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为IOMl,即浓度为20ng/m的DNA模板2W ,m IOX荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mMd NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5W 25mM MgCl2溶液、0.02W (5unitsM)TaqDNA聚合酶、去离子水4.98W、3个位点分别采用不同的正向引物(20剛，0.225W )、反向引物(20剛，0.225|^1)、￥1(:荧光探针(10剛，0.25W )和FAM荧光探针(10剛，0.25W)工具进行检测，其引物探针如下: 带VIC荧光A型探针 TGAgCCCCCAGAA 带FAM荧光G型探针 TGAtCCCCCAGAA 正向引物 CTCCCCACAGCTCTGCAT 反向引物 CAGTCAATCCCITTGGTGCT 带VIC荧光C型探针 ITGcGAAATACAA 带FAM荧光G型探针 TTGtGAAATACAA 正向引物 GATAGCACCACTGCACTCCA 反向引物 TCATCTCTTCCCCACACACA 将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热:50°C、2分钟，95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983, TNF-a家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110两张图； 步骤4: SNP基因型分析 将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型； (I)、一氧化氮合酶(NOS3) rsl799983 在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，(2)、TNF-a 家族成员 Fas 配体基因(FASLG) rs763110 在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型。
2 .权利要求书I中的所述的N0S3基因与FASLG基因的组合检测模式。
【文档编号】C12Q1/68GK103642932SQ201310722584
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】毛丹丹, 王校 申请人:上海中优医药高科技有限公司