一种抗凋亡高效表达hVEGF₁₆₅细胞模型及其建立方法

专利名称：一种抗凋亡高效表达hVEGF₁₆₅细胞模型及其建立方法
技术领域：
本发明涉及一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型及其建立方法。属于生物医学研究技术领域。
背景技术：
研究表明VEGF的血管生成作用部分是通过诱导血管内皮细胞中BCL-2的表达来实现的。VEGF诱导BCL-2的高表达有助于提高血管内皮细胞在低氧、中毒等条件下的存活 [18]。Xu等的实验表明BMSCs移植改善心梗后的心功能主要是通过旁分泌一些诸如VEGF等的细胞因子进而上调心肌细胞的BCL-2的表达来实现心脏保护作用的[19]。BCL-2还能抑制由NO诱导的血管内皮细胞的凋亡，促进血管的形成_]。肿瘤细胞中BCL-2的过表达促进了 VEGF的表达及肿瘤的血管生成[21]。可见在多种细胞中VEGF和BCL-2之间存在着互相上调的级联关系，生物学功能上形成协同作用。BCL-2和VEGF共表达联合应用于基因治疗上，可能产生较单个治疗基因更为理想的治疗效果。腺病毒载体宿主范围广、转染效率和基因表达水平高、安全性较好，是基因治疗的优良载体，是心肌梗死基因治疗较为理想的载体。目前心肌梗死的基因治疗或对干细胞基因修饰后移植治疗心肌梗死采用的大多为抗凋亡或促血管生成等单基因的治疗方法，少有应用双基因治疗的报道，更罕见应用双基因共表达载体。目前尚未见同时应用人BCL-2和人VEGF165基因治疗心肌梗死或对干细胞基因修饰后移植治疗心肌梗死的报道。骨髓间充质干细胞(BMSCs)在骨髓中含量低，它的分离纯化问题一直是BMSCs研究中的一个重要但至今还没完全解决的问题。目前分离纯化BMSCs的方法有2种1)密度梯度离心法，BMSCs与其他细胞密度不同，根据沉降作用原理，将其置于某一梯度的介质中离心以除去其他细胞。这种密度梯度离心法可获得相对较高纯度的骨髓间充质干细胞 (BMSCs)，但对细胞活性的干扰较大。2)表面标志物筛选法，根据细胞表面的一些特殊表面标志物，用各种单克隆抗体进行阳性或阴性筛选，因BMSCs无特殊的表面标记物，只好采用多种标记物联合筛选的方法进行，目前有流式细胞仪分选法、免疫溶解法、平面粘附分离法、免疫磁珠分离法。上述方法对BMSCs的细胞活性同样有影响，而且需要用到特殊抗体或者分离液，比较费时且花费较多。腺病毒转染细胞最重要的一个步骤是细胞表面有受体与其结合，且转染效率与细胞表面的腺病毒受体密度及数量密切相关。而许多细胞表面上腺病毒受体通常是低水平表达或者不表达，包括许多肿瘤细胞、骨骼肌细胞、淋巴细胞、纤维细胞、造血干细胞。而且腺病毒转染细胞后，对细胞有毒性作用，可导致细胞的死亡。因此，想让重组腺病毒能够表达所携带的基因并提高转染的效率，首先就得选择合适的腺病毒转染目标细胞，而BMSCs往往作为第一选择，但是普通BMSCs在体外培养寿命较短，不能持续高效表达hVEGF165。因此， 如何构建一种使BMSCs凋亡比例降低、寿命延长、持续时间更长、高效表达hVEGF165的细胞模型是本发明的主要任务。

发明内容
本发明的第一个目的，是为了解决现有技术BMSCs在体外培养寿命较短，不能持续高效表达hVEGF165的问题，提供一种活力良好的抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型。本发明的第二个目的，是为了提供一种简单方便、经济有效的抗凋亡高效表达 hVEGF165的细胞模型的建立方法。本发明的第一个目的可以通过以下技术方案达到一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型，其特征是以纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs作为转染细胞，以hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒，将hBCL_2和 hVEGF165双基因共表达重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，构成抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型。本发明的第二个目的可以通过以下技术方案达到一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤1)取得纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs取大鼠股骨，在无菌条件下剔除肌肉组织，剪去两端干骺端，抽取含20%胎牛血清 FBS的DMEM培养基，反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中进行离心后弃去上清，加入 DMEM培养基后放于细胞培养瓶中，将培养瓶置于35°C 39°C、5% CO2的细胞培养箱内培养；经过20-30小时后部分细胞贴壁生长，弃去上清液，然后每2-3天换液1次，直到细胞达到85%-90%融合时，以1 2或1 3传代培养，再以DMEM培养基继续培养，直到获得纯化的的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；2)重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs调整纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs的细胞悬液密度，以5X104/ml密度接种在多孔板上，每孔加入DMEM培养基，在细胞培养箱以35°C 39°C、5% CO2的条件下培养； 经过40-50小时后，吸除旧培养液，再次每孔加入DMEM培养基，按病毒感染复数MOI = 0、 10、50、100、200、400分别加入相应体积的重组腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；对所述大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞转染、经过20-30小时后，弃去旧培养液，换为更低含量FBS 的DMEM培养液，继续对所述大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞转染，在此次转染过程中的不同时间段分别观察细胞绿色荧光蛋白的表达，继续培养60-80小时后，然后消化多孔板细胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；将每孔的细胞消化后重悬于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式细胞仪专用检测管中，用吸管轻轻吹打为单个细胞悬液，在流式细胞仪上逐管检测绿色荧光蛋白阳性细胞的比例，测得转染效率最高的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；3)然后，采用转染效率最高的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs建立的细胞模型，抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型。本发明的第二个目的还可以通过以下技术方案达到步骤1)对大鼠BMSCs分离纯化过程可以为如下所述将大鼠用3%戊巴比妥钠aiil/kg腹腔注射麻醉后置于75%酒精中浸泡lOmin， 剪去其皮毛；取大鼠股骨，在无菌条件下剔除肌肉组织，剪去两端干骺端，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的DMEM培养基，反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中，以1200rpm/min离心lOmin，弃去上清，加入含有10% FBS的DMEM培养基，吹勻后放于细胞培养瓶中，将培养瓶置于35°C 39°C、5% CO2的细胞培养箱内培养；经过24h后，部分细胞贴壁生长，弃去上清液，然后每2-3天换液1次，当细胞达到85%-90%融合时，以1 2或 1 3传代培养，以10% FBS的DMEM培养基继续培养，从而获得大量纯化的BMSCs ；步骤2)重组腺病毒转染BMSCs过程可以如下所述用细胞计数仪调整BMSCs细胞悬液的密度，以5X 104/ml密度接种在6孔板上， 每孔加入1. 5ml含10% FBS的DMEM培养基，在细胞培养箱以35°C 39°C、5% CO2的条件下培养；经过4 后，吸除旧培养液，每孔加入1.5ml的DMEM，按病毒感染复数MOI = O、 10、50、100、200、400分别加入相应体积的重组腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 (滴度为 5X109pfu/ml)；转染24h后，弃去旧培养液，换为含2% FBS的DMEM培养液，经过24h、48h、 7 分别在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达，结果得出7 时表达最强；继续培养72h，然后消化6孔板细胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；将每孔的细胞消化后重悬于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式细胞仪专用检测管中，用吸管轻轻吹打为单个细胞悬液，在流式细胞仪上逐管检测绿色荧光蛋白阳性细胞的比例，从而测得MOI = 400时转染效率最高；然后，采用MOI = 400转染72h的BMSCs建立细胞模型。步骤1)步中所述大鼠可以为SD大鼠，重100_150g。步骤1)步中所述细胞培养瓶可以为2个T-25cm2细胞培养瓶。步骤2~)步中所述观察细胞绿色荧光蛋白的表达可以通过普通光镜或荧光显微镜观察。本发明所述抗凋亡且高效表达hVEGF165细胞模型的用途，1)用于治疗心肌梗死等疾病；2)用于移植至受体器官。本发明具有如下突出的有益效果1、本发明筛选出BMSCs作为hBCL_2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒理想的转染目标细胞，测定出转染重组腺病毒后BMSCs高效分泌hVEGF165并且在模拟血清剥夺环境下转染后的BMSCs凋亡比例降低；解决了 hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒不易转染细胞及在目标细胞里面表达的问题，也解决了普通BMSCs移植到缺氧心脏后寿命较短，不能持续高效表达hVEGF165的问题；本细胞模型将在干细胞移植治疗心肌梗死领域开辟新的道路，具有广泛的临床应用前景。2、本发明通过改良的分离纯化可以快速大量获得活力良好的BMSCs，转染效率达 70 %，为临床上BMSCs细胞移植治疗心肌梗死等疾病提供便利。3、本发明转染重组腺病毒BMSCs较普通BMSCs的细胞凋亡比例有明显减少，寿命延长，能够高效表达hVEGF165，有利于将该细胞模型移植至受体器官，并且可以提高治疗疾病的效果，具有广泛的应用前景。


图1A-1C为原代培养的大鼠BMSCs图。图1D-1F为传代培养的大鼠BMSCs图。图2A-2H为BMSCs细胞表面标记物流式细胞仪检测结果示意图。图3A、3C、3E为转染重组腺病毒后的BMSCs的普通光镜Mh、48h、7ai变化图。
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图;3B、3D、3F为转染重组腺病毒后的BMSCs的荧光显微镜变化图。图4A-4F为流式细胞仪测定重组腺病毒转染BMSCs效率示意图。图5为VEGF165分泌水平示意图。图6A-6C为BMSCs凋亡检测流式细胞仪散点示意图。
具体实施例方式具体实施例1 本实施例涉及的抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型，以纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs作为转染细胞，以hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒，将hBCL_2 和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，构成抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型。本实施例的建立方法以及检测过程包括以下步骤1)取得纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；2)重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；3)然后，采用转染效率最高的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs建立的细胞模型，抗凋亡且高效表达hVEGF165 的细胞模型。具体操作方法如下一、对大鼠BMSCs分离纯化1、大鼠BMSCs的分离1)取100_150g的雄性SD大鼠，3 %戊巴比妥钠^il/Kg腹腔注射麻醉，将其置于 75%酒精中浸泡10分钟，继而将老鼠放在一个消毒过的塑料盆中。2)戴无菌手套，剪开SD大鼠下肢皮肤，完全暴露下肢肌肉，钝性分离肌肉组织，显露股骨和胫骨，从股骨和胫骨连接处小心进行分离，完整取出股骨；同法取出胫骨，然后转移至超净工作台，放于含无菌0. OlM胎牛血清FBS的培养皿中。3)将分离的SD大鼠股骨和胫骨置于装有IOml无菌胎牛血清FBS培养皿中，换新的无菌手套，换用超净台里面的无菌镊子及剪刀，剔除脂肪及肌肉组织，露出骨髓端。然后放到另外一个含无菌胎牛血清FBS的培养皿中去除骨头外面的血液及附着的肌肉，用无菌胎牛血清FBS反复冲洗三遍，直至骨头外面无血液及肌肉残留。4)用大剪刀剪去骨头两端的软骨，止血钳夹住骨头，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的H-DMEM培养基5ml，将针头插入骨髓腔内反复冲洗，可见骨髓液从软骨端呈云雾状流出，待骨髓腔变白时可停止冲洗，同法获取其余骨头的骨髓。5)收集骨髓悬液于15ml离心管中，1200rpm室温离心lOmin，弃上清，用8ml含 20%胎牛血清FBS新鲜培养基重悬细胞，转移至2个T-25cm2细胞培养瓶中。2、大鼠BMSCs的原代培养将细胞培养瓶置于37°C、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，刚接种时骨髓中体积较大的单个核细胞呈球形，悬浮于培养液中，8-10h开始逐渐沉降贴壁；24h后弃去未贴壁细胞，更换培养液，用含10 %胎牛血清FBS的H-DMEM培养基培养细胞，可见细胞基本贴壁，但细胞数量较少，细胞呈长条形或多角形，如图IA所示；以后每2-3天换液1次，培养至第3天可见细胞多逐渐变成长梭形，如图IB所示；之后细胞快速增殖，细胞核居中，偶有双核，至接种后第6天细胞形成集落，形似短棒状或纤维样，呈平行或旋涡状排列，如图IC所示；贴壁细胞接近80% -90%融合后，结束原代培养。3.大鼠BMSCs传代扩增培养1)细胞融合至80%-90%时，弃去旧培养液，加入2ml灭菌0. OlM的胎牛血清FBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。幻加入Iml 0.25%胰酶，置于倒置显微镜下观察细胞形态，待镜下细胞之间突起消失、变圆后，弃去胰酶；加入含10%胎牛血清FBS的H-DMEM细胞培养基6ml终止消化，用吸管轻柔吹打成单细胞悬液。3)按1 2传代分至2个新的T-25cm2培养瓶，置于37°C ,5% CO2的培养箱中继续培养，此时记为Pl (第1代)，以后每3-4天细胞传代一次。传代培养3-4h开始贴壁，6-8h 贴壁完全，至P1、P2、P3以备实验用时细胞形态未见明显变化，但生长更为迅速，同样时间内更快长满瓶底，均勻有序地以成纤维细胞样分布特征，如图1D-1F所示。4.大鼠BMSCs的鉴定1)P3细胞融合至90%左右，用0. 25%胰酶消化细胞，具体步骤同上。2)收集细胞悬液，细胞计数仪计数后，调整每个检测样本的细胞数为5X105。3) 1200rpm室温离心5分钟，弃上清。4)灭菌胎牛血清FBS洗涤2遍并于相同条件下离心，弃上清，于待检测的样本中各加入IOOul灭菌1 X胎牛血清FBS溶液，轻轻混勻，分别加入⑶四、⑶34、⑶44、⑶45、⑶90 一抗及同型阴性对照各10ul。5)37°C避光孵育15分钟，每管加入胎牛血清FBS溶液Iml后上流式细胞仪检测。 检测结果如图2A-2H所示。二、重组腺病毒转染BMSCs1、重组腺病毒转染BMSCs效率的测定1)用细胞计数仪调整消化后细胞悬液的密度，以5 X IOVml密度接种在6孔板，每孔加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS DMEM在细胞培养箱以5% CO2, 37°C条件下培养。2)培养24h后吸除旧培养液，每孔仍加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS的DMEM培
养基，继续在培养箱中培养。3)24h后，吸除旧培养液，每孔加入1. 5ml DMEM培养基。为获得最佳的病毒感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)，按 MOI = O、10、50、100、200、400 分别加入相应体积的重组 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 (滴度为 5X K^pfu/mL)病毒液。4)转染24h后弃去旧培养液，换为含2%胎牛血清FBS的DMEM培养基，经过Mh、 48h,72h分别观察细胞绿色荧光蛋白的表达，结果表明在72h时达到最强，其后不再增加， 如图3A-3F所示。5)继续培养72h，然后消化6孔板细胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；将每个孔的细胞消化后重悬于含0. 5ml 0.01M PBS的流式细胞仪专用检测管中，用吸管轻轻吹打为单个细胞悬液。6)在流式细胞仪上逐管检测检绿色荧光蛋白阳性细胞的比例，测得其转染效率在 8. 08% 70. 65%之间，可知最佳MOI = 400，如图4A-4F所示。三、ELISA检测转染后BMSCs培养上清中VEGF165的含量1、BMSCs培养上清液的收集
1)消化细胞接种于6孔板，并用病毒液转染BMSCs。2)分为3组第1组为正常BMSCs组；第2组为转染Ad-EGFP的BMSCs组；第3组为转染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 组。在转染病毒后第 1、3、5、7、9、11、13、15、17 天收集培养孔的细胞上清液，每次收集完上清液后，每孔再重新加入1. 5ml新鲜的DMEM培养基。 直至第15天。收集后的上清液以3000rpm/min，4°C离心20min，然后放于_20°C冰箱保存。 待收集完所有时间点的细胞上清液后，将各个标本同时进行检测。2. ELISA试剂盒检测上清液中VEGF165浓度1)标准品的稀释与加样在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第1、第2孔中分别加入标准品lOOul，然后在第1、第2孔中加标准品稀释液50ul，混勻；然后从第1、第2孔中各取IOOul分别加到第3孔和第4孔，再在第3、第四孔分别加标准品稀释液50ul，混勻 ’然后在第3孔和第4孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加入到第5、第6孔中，再在第5、 第6孔中分别加入标准品稀释液50ul，混勻；混勻后从第5、第6孔中各取50ul分别加到第 7、第8孔中，再在第7、第8孔中分别加入标准品稀释液50ul，混勻后从第7、第8孔中分别取50ul加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分别加入标准品稀释液50ul，混勻后从第9 第10孔各取50ul弃掉。(稀释后各孔加样量都为50ul，浓度分别为600pg/ml，400pg/ml， 200pg/ml,100pg/ml，50pg/ml)。2)加样分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、 待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品 IOul (样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混勻。3)温育用封板膜封板后置于37°C温育30分钟。4)配液将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5)洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6)加酶每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外。7)温育操作同3)步。8)洗涤操作同5)步。9)显色每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻振荡混勻，37°C避光显色15分钟。10)终止每孔加终止液50ul，终止反应。11)测定以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。12)绘制标准曲线，SPSS10. 0软件拟合二次方程，将样品OD值转换为浓度。转染重组腺病毒后BMSCs的VEGF165分泌水平(pg/ml)如图5所示，除了 ld、3d、 7d及lld，转染Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒的BMSCs上清中VEGF165的分泌水平与正常 BMSCs组相比，均显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)；除了 Id及3d，其余时间点与转染Ad-EGFP的BMSCs组相比，VEGF165的分泌水平有统计学差异(P < 0. 05)；正常组与转染Ad-EGFP组VEGF165的分泌水平差异无统计学意义(P > 0. 05)。随着时间的推移，转染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒组VEGF165分泌量逐渐增加，至13d达到高峰(924. 3士56. 5)pg/ml, η = 3。此后，VEGF165分泌逐渐下降，但仍保持在一个可检测水平之上，并持续至 17d(4682 士83. 3) pg/ml 以后。转染 Ad-EGFP 的 BMSCs 组(494. 6 士 114. 8) pg/ml 及正常 BMSCs 组(592. 0士 135. 8)pg/ml都于Ild达到分泌峰值。四、转染重组腺病毒后BMSCs在模拟血清剥夺环境下凋亡检测1、用Annexin V-PE/7-AAD检测盒对细胞凋亡检测1)消化细胞接种于6孔板，并用病毒液转染BMSCs。2)分为3组第1组为正常BMSCs组；第2组为转染Ad-EGFP的BMSCs组；第3组为转染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 组。3)在转染病毒24h后，各个组的细胞用0. OlMPBS漂洗2次，以去除残留的培养基， 加入不含FBS的H-DMEM培养基，以无血清环境下培养6天。4)吸除培养孔里面的旧培养液，每个孔用0. OlM的胎牛血清FBS漂洗一遍。5)每孔加入0. 25%胰酶消化细胞lmin，加样枪轻轻吸除胰酶。6)每孔加入Iml胎牛血清FBS溶液，用吸管吹打孔里面的贴壁细胞，然后将单细胞悬液转移到15ml离心管。7) 1200rpm/min，4°C离心 5min。8)加入IOOul IXBinding Buffer，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，然后转移到流式细胞仪专用检测管。9)每个检测管依次加入 5ul Annexin V-PE 及 5ul 7-AAD。10)轻轻振荡检测管，室温下避光反应15min。11)每个管再加入400ul IXBinding Buffer，轻轻振荡混勻。12)在Ih内于流式细胞仪上机检测。如图6A-6C所示，分别为第1组、第2组和第3组BMSCs凋亡检测流式细胞仪散点图，左下象限显示活细胞，为(PE-/AAD-)；右上象限是非活细胞，即坏死及晚期凋亡细胞， 为(PE+/AAD+)；而右下象限为早期凋亡细胞，显现(PE+/AAD-)，可以看到第3组细胞左下象限细胞数少，凋亡细胞比例低，而第1组及第2组细胞左下象限凋亡细胞比例较高。第3组细胞的凋亡率(3. 43士 1.61% )明显比第2组(9. 92士5. 99% )及第1组 (10. 51 士4. 54% )低，且有统计学差异(ρ < 0. 05)。而第1组与第2组的凋亡率差异则没有统计学意义(P>0. 05)。凋亡检测的结果证明转染重组腺病毒后BMSCs表达BCL-2蛋白增加，可以抑制细胞的凋亡，降低凋亡细胞比例，具有实际的生物学效应。如下表1所示。
权利要求
1.一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型，其特征在于以纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs作为转染细胞，以hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒，将hBCL_2和 hVEGF165双基因共表达重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，构成抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型。
2.如权利要求1所述的一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤1)取得纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs取大鼠股骨，在无菌条件下剔除肌肉组织，剪去两端干骺端，抽取含20%胎牛血清FBS 的DMEM培养基，反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中进行离心后弃去上清，加入 DMEM培养基后放于细胞培养瓶中，将培养瓶置于35°C 39°C、5% CO2的细胞培养箱内培养；经过20-30小时后部分细胞贴壁生长，弃去上清液，然后每2-3天换液1次，直到细胞达到85%-90%融合时，以1 2或1 3传代培养，再以DMEM培养基继续培养，直到获得纯化的的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；2)重组腺病毒转染纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs调整纯化的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs的细胞悬液密度，以5X104/ml密度接种在多孔板上，每孔加入DMEM培养基，在细胞培养箱以35°C 39°C、5% CO2的条件下培养；经过40-50小时后，吸除旧培养液，再次每孔加入DMEM培养基，按病毒感染复数MOI = 0、10、 50、100、200、400分别加入相应体积的重组腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；对所述大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞转染、经过20-30小时后，弃去旧培养液，换为更低含量FBS 的DMEM培养液，继续对所述大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞转染，在此次转染过程中的不同时间段分别观察细胞绿色荧光蛋白的表达，继续培养60-80小时后，然后消化多孔板细胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；将每孔的细胞消化后重悬于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式细胞仪专用检测管中，用吸管轻轻吹打为单个细胞悬液，在流式细胞仪上逐管检测绿色荧光蛋白阳性细胞的比例，测得转染效率最高的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs ；3)然后，采用转染效率最高的大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs建立的细胞模型，抗凋亡且高效表达hVEGF165的细胞模型。
3.如权利要求2所述的一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型的建立方法，其特征在于步骤1)中，在将取大鼠股骨前，先将大鼠用3%戊巴比妥钠aiil/kg腹腔注射麻醉后置于75%酒精中浸泡lOmin，剪去其皮毛；所用冲洗骨髓腔的DMEM培养基为含20%胎牛血清FBS的DMEM培养基；用于培养细胞的的DMEM培养基为含10%胎牛血清FBS的DMEM培养基。
4.如权利要求2所述的一种抗凋亡高效表达hVEGF165的细胞模型的建立方法，其特征在于步骤1)中，用于第一次培养细胞的DMEM培养基为含10%胎牛血清FBS的DMEM培养基，用于第二次培养细胞的DMEM培养基为含2%胎牛血清FBS的DMEM培养基。
5.根据权利要求2所述的一种抗凋亡且高效表达hVEGF165细胞模型的建立方法，其特征在于1)步中所述的大鼠为SD大鼠，重100-150g。
6.根据权利要求2所述的一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型的建立方法，其特征在于1)步中所述的细胞培养瓶为二个T-25cm2细胞培养瓶。
7.根据权利要求2所述的一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型的建立方法，其特征在于 步中所述的观察细胞绿色荧光蛋白的表达通过普通光镜或荧光显微镜观察。
全文摘要
本发明涉及一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型及其建立方法，该细胞模型以BMSCs作为转染细胞，与hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒。其建立方法包括以下步骤1)对大鼠BMSCs分离纯化，从而获得大量纯化活力良好的BMSCs；2)重组腺病毒转染BMSCs，采用病毒感染复数MOI＝400转染72h的BMSCs建立细胞模型。其用途特征是1)用于治疗心肌梗死等疾病；2)用于移植至受体器官。本发明转染重组腺病毒BMSCs较普通BMSCs的细胞凋亡比例有明显减少，寿命延长，能够高效表达hVEGF165，有利于将该细胞模型移植至受体器官，并且可以提高治疗疾病的效果，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N7/01GK102329777SQ201110206260
公开日2012年1月25日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者何晓青, 倪晓彬, 刘世明, 林育辉, 罗承锋, 陈敏生 申请人:广州医学院第二附属医院