专利名称：一种细胞表面展示磷脂酶d酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术：
磷脂酰丝氨酸(ph0SphatidylSerine，PQ是一种天然的磷脂，于1942年由Jordi i^olch首次提取并加以定性。PS的结构决定了其具有双亲性的独特性质，带有负电荷的一端具有亲水性(或水溶性)，由脂肪酸组成的另一端具有亲脂性(或脂溶性)，作为磷脂家族中的一员，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，有着独特的理化性质和营养价值1.提高认知能力，特别是识别、学习、记忆能力；2.改善阿尔茨默氏症 (Alzheimer' S Disease) ；3治疗抑郁症；(4)缓解精神压力和身体疲劳。目前工业化生产PS的主流方法是采用浸提法，存在选择性不高、易引入其他杂质、无法获取高纯度PS等问题，而化学合成法生产磷脂酰丝氨酸仅存在于实验室研究，远不能达到实际工业生产要求。磷脂酶D (EC3. 1. 4. 4)，属于催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，分布在从细菌到高等动植物的众多生物类群中，其主要生理功能是参与细胞脂质代谢， 信号转导及生物膜形成等。磷脂酶D具有水解和转酯双重活性，既可水解卵磷脂(PC)形成磷脂酸(PA)和胆碱；又可在高浓度丝氨酸、乙醇胺等亲核物质存在下，催化转酯反应生成具有不同极性头部的稀有磷脂-磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。应用同位素标记技术对酶的反应机理研究发现，该酶表现出Ping-pong反应机制，在水相和底物积聚相的相界面对底物进行“修饰”，同时反应速率不仅取决于底物浓度，还与两性底物、催进剂、 抑制剂有很大关系。磷脂酶D的研究已开展了近五十年，但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，尤其是我国在这方面的研究工作几乎是空白，究其原因，主要有以下几点1.酶源狭窄且在生物体内含量极微，提纯相当困难；2.酶的稳定性差且只能在异相系统中作用；3.该酶在生物体内的功能及作用机理尚未完全搞清，其应用范围不酶的固定化技术是蛋白质工程的一项重要内容能够提高蛋白或酶的稳定性和重复利用性。但要对酶进行分离纯化，且需要较为复杂的设备，增大生产成本。游离磷脂酶D稳定性差，无法回收利用，酶的固定化技术能够提高酶的稳定性和重复利用性，但是传统的固定化方法也会产生一些不利因素，例如，固定化过程可能造成酶的活性收率损失；另外，由于固定化操作需用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用，而酵母细胞细胞表面展示技术为酶的固定化提供了一种新的基于基因重组技术的生物学方法。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理
3是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域都有广泛的应用前景。目前，最常见的酵母细胞表面展示表达系统包括凝集素展示表达和絮凝素展示表达。目前多种酶类包括脂酶、生物素连接酶、有机磷水解酶、羧酸酯酶、差向异构酶、环糊精葡聚糖转化酶、淀粉酶、纤维素酶等被成功地展示表达在酵母细胞表面且具有生物活性。磷脂酶D催化反应是在两相系统中进行的，对于游离酶来讲，有机溶剂常常降低其在非水相催化中的活力，而展示酶有力地改善了上述缺点.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，全细胞催化剂具有固定化酶的优点，稳定性好， 可重复利用，且制备简单，节省酶固定化的设备，降低生产成本。本发明是通过以下技术方案来实现的一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤(1)将酵母全细胞催化剂加入含有丝氨酸、CaCl2, Triton-XlOO的醋酸缓冲液中， 与含有卵磷脂的氯仿溶液等体积混合均勻，在30°C下混合得到均勻的乳状液反应5-6小时；其中全细胞催化剂为lg、丝氨酸的浓度为4. 5M,CaCl2的浓度为5. OmM,Triton-XlOO的浓度为0. 4%、卵磷脂的浓度为20mM ；(2)反应结束后静止自然分层，提取有机相；(3)有机溶剂挥发后剩余物经氯仿洗涤2-4次，即可得到磷脂酰丝氨酸。而且，所述酵母全细胞催化剂用的酵母工程菌由pPIC9K-Flo-pldm转化至宿主毕赤酵母GS115构建获得，所述pPICTK-Flo-pldm为由编码野生型磷脂酶D的基因序列见序列1，定点突变得到的编码高活力磷脂酶D成熟肽基因序列见序列2经EcoRI和MluI双酶切后，将其定向连接至经EcoRI和MluI双酶切后的酵母展示载体pPIC9K-Flo构建获得。而且，所述酵母全细胞催化剂的制备方法步骤如下(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的酵母工程菌接种至YPD液体培养基中， 25-35 °C、230-270r/min 培养 20_30h ；(2)以的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，培养20_30h，然后在4°C、8000r/ min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中；(3)25-35°C>230-270r/min 培养 90_100h，每隔 24h 加入终浓度为 0. 5% V/V 甲醇
诱导产酶；(4)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。而且，步骤( 获得的水相经离心取沉淀，用醋酸缓冲液洗涤两次，可重新获取全细胞催化剂，进行下一次反应，达到全细胞催化剂的重复利用。而且，所述醋酸缓冲液与氯仿溶液的体积比为3 1。而且，所述醋酸缓冲液的pH为7. 0。
本发明的有益效果和优点1、本发明制备的全细胞催化剂具有固定化酶的优点，稳定性好，可重复利用，且制备简单，节省酶固定化的设备，降低生产成本。2、本发明利用磷脂酶D的高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸， 有效解决目前浸提法和化学合成法无法获取高纯度磷脂酰丝氨酸的问题，在医药及食品保健品领域具有很大的应用潜力。3、本发明采用细胞表面展示磷脂酶D的酵母工程菌制备全细胞催化剂，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环节，降低了生产成本，使酵母展示技术成为酶法催化卵磷脂生成磷脂酰丝氨酸的一个极具潜力的发展方向。
图1为本发明细胞表面展示磷脂酶D的酵母全细胞催化剂制备工艺流程图；图2为本发明细胞表面展示磷脂酶D的酵母全细胞催化剂催化卵磷脂及丝氨酸合成磷脂酰丝氨酸的工艺流程具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本实施列采用下列分析条件反应停止后双液相自然分层。提取有机相，经挥发后，剩余物经氯仿洗涤两次，最后溶解于适量氯仿甲醇=19 1 (ν/ν)中，以待分析之用。利用HPLC-UV法检测的色谱条件为检测波长206nm；流动相乙腈甲醇85%磷酸=100 10 0.8 ；色谱柱Phenomsil 5 μ C18 (250 X 4. 6mm)；流速lmL/min；进样量15yL;检测时间15min。分别称取磷脂酰丝氨酸标准品适量，用氯仿配成浓度分别为0. 18,0. 5,1. 0,1. 5、 2. 0,2. 5mg/mL的标准溶液，以标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。利用磷脂酰丝氨酸的标准工作曲线，计算产物生成量，从而得出转化率结果。磷脂酰丝氨酸转化率的表征方法为
PS
总磷脂一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的毕赤酵母重组菌株(pPIC9K-Flo-pldm/ GS115)接种至YPD液体培养基中，30°C、250r/min培养Mh ；(2)以的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30°C、250r/min培养Mh，然后在4°C、8000r/min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中；(3)30°C、250r/min培养96h，每隔24h加入终浓度为0. 5% (V/V)甲醇诱导产酶。(4)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗2次，加脱脂牛奶为保护剂， 通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。一种细胞表面展示磷脂酶D的酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法， 步骤如下双液相反应体系30mL的0. Imol/醋酸缓冲液(pH7. 0)中含有4. 5mol/L的丝氨酸、5mmol/LCaCl2，Triton-XlOO的浓度为0. 4%，同时加入Ig全细胞催化剂，与IOmL含有 20mmol/L卵磷脂的有机相混合，在30°C下200r/min混合得到均勻的乳状液进行反应。反应证后，停止转动，双液相自然分层。提取有机相，经挥发后，剩余物经氯仿洗涤两次，最后溶解于适量氯仿甲醇=19 1 (ν/ν)中，以待分析之用。水相经4°C、8000r/min离心 IOmin,取沉淀双蒸水洗涤两次，重新获得全细胞催化剂，可重复使用10次以上，转化率没有明显降低。利用HPLC-UV法检测磷脂酰丝氨酸的转化率。其中细胞表面展示高活力磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化反应时磷脂酰丝氨酸的转化率达到58. 2 %，较细胞表面展示野生型磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化反应时磷脂酰丝氨酸的转化率51. 9%提高了 6.3%。一种细胞表面展示高活力磷脂酶D的酵母工程菌的构建方法如下一、野生型磷脂酶D成熟肽基因的获得1、野生型磷脂酶D成熟肽基因来自色褐链霉菌(AS 4. 331)，购于中科院微生物研究所，提取其基因组DNA。其中色褐链霉菌基因组DNA的提取步骤如下(1)将培养至对数期的菌液取lmL，12000r/min离心Imin收集菌体。(2)将菌体悬浮于90 μ L ddH20中，加50mg/mL溶菌酶10 μ L，充分混勻后37°C水浴保温20min。(3)加入400 μ L裂解液混勻至产生大量泡沫，补加5mol/L NaCl 200 μ L，轻轻颠倒混勻，1200r/min 离心 IOmin0(4)上清转移至另一 Ep管中，加1/2体积苯酚和1/2体积氯仿，温和混勻。12000r/ min 离心 3min。(5)取上清，加入1/2体积的苯酚、氯仿反复抽提，离心，吸上清，重复此步骤直到两相界面看不到白色物质为止。(6)加入等体积的氯仿进行抽提，离心，吸上清。(7)用两倍体积的无水乙醇-70°C沉淀DNA大约30min，12000r/min离心8min， 200 μ L70%乙醇洗涤两次，12000r/min离心5min，室温晾干。(8) DNA 溶于 2O μ LddH2O 中 _20 "C 短期保存。2、根据已报道磷脂酶D成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶D成熟肽基因的扩增引物如下上游Pl CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下划线部分为 MluI 酶切位点)下游Ρ2 :CCGGAATTCctacttatcRtcRtcatccttRtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC (下划线部分为EcoRI酶切位点，小写为flag标签)
扩增模板为色褐链霉菌基因组DNA，其扩增的反应条件为95°C 5min -MV lmin, 60°C lmin40s，72°C lmin，30 个循环；72°C延长 IOmin ；扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，得到1500bp左右的条带，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型磷脂酶D成熟肽基因pld。二、磷脂酶D基因的定点突变。(1)野生型磷脂酶D基因连接入T载体。将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，将其连入T载体。利用电转化法将该重组质粒转入大肠杆菌JM109中，EcoRI、MluI双酶切和PCR验证结果表明磷脂酶D基因已成功克隆到T载体上。将其测序可知扩增到磷脂酶D的序列如SEQ ID No. 1。(2)定点突变基于重叠PCR技术进行定点突变，构建高活力磷脂酶D基因。Gly69 — Glu、 Ser285 — Ala设计引物如下上游CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下划线部分为 MluI 酶切位点)下游CCGGAATTCctacttatcgtcgtcatccttgtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC(下划线部分为EcoRI酶切位点，小写为flag标签)重叠弓丨物 P3 :5，-cacgcgccgagagcgaccacacc-3，重叠弓丨物 P4 :5，-ggtgtggtcgctctcggcgcgtg-3，重叠弓丨物 P5 :5，-caggccgccacggccagcggt-3，重叠弓丨物 P6 :5，-accgctggccgtggcggcctg-3，在上游引物和下游引物5’端分别引入MluI和EcoRI酶切位点。重叠引物P3与重叠引物P4互补，重叠引物P5与重叠引物P6互补。重叠引物P3与P4中包含了对69位氨基酸残基的突变。而重叠引物P5与P6中则包含了对285位氨基酸残基的突变。Gly69 — Glu用引物PI、P4扩增上游片段pldl，P3、P2扩增下游片段pld2。PCR反应体系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5yL，重组质粒pUC-T-pld IOOng, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，无菌去离子水补充至 50 μ L0PCR扩增条件为94 V预变性5min，共1个循环；94 °C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，共1个循环。PCR产物切胶回收，适当稀释。以pldl、pld2为引物，进行PCR。PCR反应体系为 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pldl、pld2 各 1 μ L，LA Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，无菌去离子水补充至48 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性5min，l个循环；94°C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5个循环；加入引物P1、P2各1 μ L，进行PCR，PCR扩增条件为-MV 预变性5min, 1个循环；94°C变性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C 延伸lOmin，共1个循环。对PCR反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到Gly69 — Glu的磷脂酶D突变体。Ser285 — Ala用磷脂酶D突变基因Gly69 — Glu为模板，引物P1、P6扩增上游片段pld3，P5、P2 扩增下游片段Pld4。PCR反应体系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5 μ L，磷脂酶D突变基因Gly69 — Glu 2 μ L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，无菌去离子水补充至50 μ L0PCR扩增条件为94 V预变性5min，共1个循环；94 °C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，共1个循环。PCR产物切胶回收，适当稀释。以pld3、pld4为引物，进行PCR。PCR反应体系为 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pld3、pld4 各 1 μ L, LA Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L，无菌去离子水补充至48 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性5min，1个循环；94°C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5个循环；加入引物P1、P2各1 μ L，进行PCR，PCR扩增条件为-MV 预变性5min, 1个循环；94°C变性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C 延伸lOmin，共1个循环。对PCR反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到 Gly69 — Glu、Ser285 — Ala的高活力磷脂酶D基因pldm。序列如SEQ ID No. 2 三、磷脂酶D基因工程菌的构建1、重组质粒pPIC9K-Flo-pldm的构建与鉴定将重叠PCR纯化产物与载体pPIC9K_Flo经EcoRI和MluI双酶切后，分别用小量 DNA回收试剂盒回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16°C的条件下连接 12h，将磷脂酶D目的基因pldm定向连接至载体pPIC9K-Flo，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli DH5a感受态中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用EcoRI和MluI双酶切鉴定，测序，命名为pPIC9K-Flo-pldm。其中大肠杆菌化转感受态的制备方法(1)从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落，接种于2mL LB培养基试管中，37°C 180r/ min摇床培养过夜；(2)取500 μ L菌液转接到一个含有50mL LB培养基的250mL锥型瓶中，37°C 180r/ min摇床培养2 汕。(3)将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置IOmin ；(4)4°C,4000r/min离心lOmin，回收菌体细胞，倒出培养液，将管倒置lmin，以便
液体培养基流尽；(5)用冰冷的0. ImoVLCaCl2溶液IOmL悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min ；(6)4°C>4000r/min 离心 lOmin，回收菌体细胞；(7)用冰冷的0. ImoVLCaCl2和15%的甘油混合液2mL重悬细胞；(8)分装细胞，每份50 μ L，即得到感受态细胞。其中重组质粒pPIC9K-Flo-pldm化学转化E. coli DH5 α感受态的具体步骤为(1)加入10 μ L质粒DNA连接产物于100 μ L感受态中，充分混勻；(2)冰上放置 30min，42°C水浴 90s ；
8
(3)冰上放置1 2min ；(4)将感受态细胞加入800 μ LLB培养基中，摇床37°C，180r/min复苏培养Ih ；(5)复苏培养后，取菌液8000r/min离心aiiin，吸掉1/3上清液后，将菌体重悬，涂布于Amp抗性平板，37°C倒置培养12 16 ；2、毕赤酵母GS115基因工程菌的构建将测序正确的重组质粒经MlI线性化后，LiCl法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，挑取阳性转化子，进行诱导表达。其中毕赤酵母GS115感受态的制备方法为(1)在YPD平板上划线培养，挑取单菌落，接种于50mLYPD液体培养基中，30°C， 250r/min 振荡培养至 OD600 = 0 . 8 1. 2。(2)收集菌体细胞，用30mL的无菌水冲洗3次，4°C，5000r/min离心lOmin。(3)除净无菌水后用ImL 0. lmol/L的LiCl轻轻重悬菌体细胞。(4)在超净工作中将菌体细胞悬浊液转移至1. 5mL无菌的离心管中。(5)室温12000r/min离心lmin，沉淀菌体细胞并用无菌枪头除净LiCl。(6)加入400 μ L 0. lmol/L的LiCl重悬菌体细胞。(7)将50 μ L的细胞悬浊液分装到1. 5mL的无菌离心管中。其中重组质粒pPIC9K-Flo-pldm化学转化GS 115感受态的具体步骤为(1)煮沸单链DNA5min，快速置于冰上冷却。(2)取新制备的感受态细胞12000r/min离心IOmin除净LiCl。(3)将每个转化的样品按顺序加入以下试剂240μ 40%的PEG，36yL IM LiCl，10μ LDNA。(4)剧烈涡旋细胞沉淀至其完全混勻(大约需:3min左右)。(5)在30°C的水浴中静止放置30min。(6)在42°C的水浴中热击20 25min。(7)30°C，6000r/min 离心 5min，除净上清溶液。(8)用0. 5mL的无菌水重悬菌体细胞沉淀。(9)在MD平板上均勻涂布100 300 μ L的重悬细胞溶液，在30°C倒置培养48 96h。其中诱导表达的具体方法为将重组毕赤酵母pPIC9K-Flo-pldm/GS115接种于20mL含有0. 5%甘油的BMGY培养基中，280C，250r/min振荡培养Mh，然后每隔Mh向培养基中加入终浓度0. 5%的甲醇， 继续在^°C，250r/min条件下振荡培养120h。3、全细胞催化剂水解活力的测定采用酶联比色法进行活性检测磷脂酶D催化水解L-α -卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A = 500nm下具有吸光值。反应体系将220mg的L- α -卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6mL IM NaOAc缓冲液(pH = 8. 0)、39mL的去离子水、 0. 272mL17. 9%的乙醇溶液(终浓为)的混合体系作为底物溶解液。将39mg 4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化物酶溶于5. 5mL的IOOmM Tris HCl (pH = 8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2. 4mL底物溶液、0. 3mL的500mM CaCl2溶液、0. 2mL的去离子水混合并置于 37°C水浴。然后加入0. ImL的酶液，混合均勻，于37。C反应lOmin，沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0. 05mL 2M Tris HCl (pH = 9)缓冲液，混合并离心后，上清液用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取滤液2mL与0. ImL胆碱显色剂、0. ImL胆碱氧化酶溶液室温反应2.证。在反应混合物中加入2. OmL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A5tltlnm检测吸光值。 酶活定义pH = 8.0、T = 37°C时，磷脂酶D Imin内催化水解L-α -卵磷脂释放l.Oymol 的胆碱所需要的酶量。测得表面展示高活力磷脂酶D的全细胞催化剂酶活为120U/(g·干细胞)，较野生型磷脂酶D提高了 11%。SEQUENCE LISTING<110>天津科技大学<120> 一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法<130>2011-07-14<160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1533<212>DNA<213>野生型磷脂酶D成熟肽基因<400>1
0150]gccgaccaggCgCCCgCCttcctgcacggcgtcgcctccggtgacccgctgcccgacggc600151]gtcctgctgtggacccgggtgaccccggtgcccgaggcgatacccggctccggagtgggc1200152]ccggacaccgaggtcggctgggtcgtcgcccgcgacaaggcgttcaccgacgtcgtcgcc1800153]aagggctcgaccaccgcacgcgccgggagcgaccacaccgtcaaggccgacatccgcggc2400154]CtggCCCCggccaccgactactggttccgcttcacggccggcggcacggactccccggtg3000155]gcgcgcacccgcaccgcgccggcggcggacgcggcggtgtcctccctgcgCttCggCgtg3600156]gtgtcctgcgccaactgggaggcgggctacttcgccgcctaccgccacctCgCggCCCgC4200157]aacgacctggacgcctggctgcacctcggcgactacatctacgagtacaagtccggcgag4800158]tacgcggcccggggcaccgtCgtgCggCCgcacgcgccggccaacgagatcctcaccctc5400159]gccgactaccgcacccggcacgccaagtacaagaccgaccccgacctgcaggccctgcac6000160]ctgaaggcgccggtcatcgcgatctgggacgaccacgagttcgccgacaacgcctggtcc6600161]ggcggcgcggtgaaccacaccgagggcgccgagggcacctggtcggcccgtcaggccgcc7200162]gccaagcaggcctacttcgagtggatgccggtgcgccccgccatcgccggcaccacctac7800163]CggCggCtgCgcttcggcaagctcgccgacctctccctgctggacctgcgctccttccgc8400164]tcccagcaggcctccacggccagcggttcggtggacgacccggaccgtacgctcaccggc9000165]cgcgcgcagctcgactggctcaaggccggcctgaaggcctccgacaccaggtggcggctg9600166]gtcggcaactccgtgatgatctcgccgttcgccgtcggctcactctccgccgacctgctc10200167]aagccgctcgccaagctgctgggcctgccg caggagggca tcgccgtcaa cacgacccag10800168]tgggacggctacaccgacgaccggcgcgaactcctcgcccacctgcgctcgaacgccatc11400169]ggcaacaccgtcttcctgaccggtgacatccacatggcgtgggccaacgaCgtgCCggtg12000170]gacgcgggcacctatccgctgtcggcgtccgcggccaccgagttcgtggtcacgtcggtc12600171]acctccgacaacctcgacgacatcgtgaaggtgcccgagggcaccgtctcggccgtcgcc13200172]tcgccggtcatcaaggccgccaaccggcacgtccactgggtggacaccgaccggcacggc13800173]tacggcgtgctggacatcaccgccgaccgcgcgcagatggactactacgtgctgtccgac14400174]cgcaccgacgcgaacgcgacctcggcgtgggtgcggtcgtaccgcacgcgcagcggcacg15000175]cagcgggtagagcgcaccta cgaccccgtg tag1533
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0179]<213>高活力磷脂酶D成熟肽基因
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<213>上游引物序列
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<213>下游引物序列
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<212>DNA
<213>重叠引物P6
<400>8
accgctggccgtggcggcctg2权利要求
1.一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将酵母全细胞催化剂加入含有丝氨酸、CaCl2,Triton-XlOO的醋酸缓冲液中，与含有卵磷脂的氯仿溶液等体积混合均勻，在30°C下混合得到均勻的乳状液反应5-6小时；其中全细胞催化剂为lg、丝氨酸的浓度为4. 5M、CaCl2的浓度为5. OmM, Triton-XlOO的浓度为0. 4%、卵磷脂的浓度为20mM ；(2)反应结束后静止自然分层，提取有机相；(3)有机溶剂挥发后剩余物经氯仿洗涤2-4次，即可得到磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于所述酵母全细胞催化剂用的酵母工程菌由pPIC9K-Flo-pldm转化至宿主毕赤酵母GSl 15构建获得，所述pPIC9K-Flo-pldm为由编码野生型磷脂酶D的基因序列见序列1，定点突变得到的编码高活力磷脂酶D成熟肽基因序列见序列2经EcoRI和 MluI双酶切后，将其定向连接至经EcoRI和MluI双酶切后的酵母展示载体pPIC9K_Flo构建获得。
3.根据权利要求1所述的细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于所述酵母全细胞催化剂的制备方法步骤如下(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，25-35°C、 230-270r/min 培养 20_30h ；(2)以的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，培养20-30h，然后在4°C、8000r/min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中；(3)25-35°C>230-270r/min培养90_100h，每隔24h加入终浓度为0.5% V/V甲醇诱导产酶；(4)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。
4.根据权利要求1所述的细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤( 获得的水相经离心取沉淀，用醋酸缓冲液洗涤两次，可重新获取全细胞催化剂，进行下一次反应，达到全细胞催化剂的重复利用。
5.根据权利要求1所述的细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于所述醋酸缓冲液与氯仿溶液的体积比为3 1。
6.根据权利要求1所述的细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于所述醋酸缓冲液的PH为7. O。
全文摘要
本发明涉及一种细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，步骤为将全细胞催化剂加入含有丝氨酸、CaCl2、Triton-X100的醋酸缓冲液中，与含有卵磷脂的氯仿溶液混合均匀，在30℃下混合得到均匀的乳状液反应5-6小时；反应结束后静止自然分层，提取有机相；有机溶剂挥发后剩余物经氯仿洗涤两次，即可得到磷脂酰丝氨酸。本发明利用磷脂酶D的高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸生成磷脂酰丝氨酸，且全细胞催化剂具有固定化酶的优点，可重复使用，有效解决了目前提浸法和化学合成法存在的问题，制备工艺简单，适合工业化生产。
文档编号C12P13/06GK102277394SQ201110206069
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者刘逸寒, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申请人:天津科技大学