一种酶法合成二元酸1，3?甘油二酯的方法
【专利摘要】一种酶法合成二元酸1，3?甘油二酯的方法，包括将单甘酯和游离脂肪酸或脂肪酸乙烯酯以1：1～3摩尔比混合，加入有机溶剂，预热，搅拌，再加入脂肪酶，在30～60℃条件下，反应1～8h，去酶，取上清液减压旋转蒸发除去溶剂。本发明制得的二元酸1，3?甘油二酯得率可达到90.4％，同时本发明反应条件温和，较低的反应温度有利于抑制酰基转移和增加固定化脂肪酶的使用次数，提高了反应效率，降低了后续分离纯化操作的难度。
【专利说明】
一种酶法合成二元酸1，3-甘油二酯的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于结构酯的合成技术领域，具体涉及一种酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法。
【背景技术】
[0002]甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)是重要的两亲性乳化剂和表面活性剂，广泛应用在食品、药品和化妆品领域。除此之外，二元酸I，3-DAG还具有很多生物学功能，如二元酸I，3-DAG与二元酸1，2-DAG相比，可对体内的磷脂酶A2产生相同的活性(Dawson et al., 1984,B1chemical&B1physical Research Communicat1ns)。
[0003]目前为止，仅有少量文献报道了二元酸I，3_DAG的合成方法。文献中的主要方法有一步酶法酯化反应和化学法合成两种。以甘油和混合脂肪酸为底物，Lipozyme RM頂为催化剂经一步酶法酯化反应得到的二元酸1，3-DAG的含量为15%(Lo SK et al.,2007,Journal of Agricultural&Food Chemistry)，但此反应过程中产生了诸多的副产物如单甘酯、一元酸I，2-DAG，二元酸I，2-DAG，一元酸I，3-DAG和甘三酯，从而使二元酸I，3-DAG的分离十分困难。通常经化学法可合成高纯度的二元酸I，3_甘油二酯，但是化学法这种合成方式需要使用有毒的溶剂如二氯甲烷、三乙胺，以及有毒的催化剂如二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC) (Craven et al.，2011，Crystal Growth&Design; Hui，2003，Lipids)。并且化学合成法需要较高的反应温度，能耗高，易造成环境污染。
[0004]此外，当使用乙烯酯作为酰基供体时，由于反应后，生成甲醛，甲醛的沸点低(19.8°C)，在室温下就会挥发，使得酰胺化反应不断向正反应方向进行，因此将乙烯酯作为反应酰基供体，酶法酰胺化反应是不可逆的，反应效率特别高。而当使用游离脂肪酸或脂肪酸酯作为酰基供体时，反应是可逆的，反应效率差。
【发明内容】
[0005]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有合成二元酸I，3_甘油二酯中存在的问题，提出了本发明。
[0007]因此，本发明的目的是解决现有技术化学法合成的不足，提供一种在有机相体系中酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于，包括，将单甘酯和游离脂肪酸或脂肪酸乙烯酯以1:1?3摩尔比混合，加入有机溶剂后预热搅拌，再加入固定化脂肪酶，在30?65 °C的温度下搅拌反应，去酶，除去溶剂，得到二元酸I，3-甘油二酯产品。
[0009]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述固定化脂肪酶包括，固定化酶Lipozyme RM IM、固定化酶Novozym 435、固定化酶Lipozyme 435、固定化酶Lipozyme TL IM或固定化酶NS40086中的一种或几种，其添加量为底物总质量的4?12%。
[0010]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述固定化脂肪酶为固定化酶Lipozyme RM IM，其添加量为底物总质量的6?10%。
[0011]作为本发明所述酶法合成二元酸1，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述脂肪酸乙烯酯包括，油酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯中的一种或几种。
[0012]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述单甘酯包括，油酸单甘酯、棕榈酸单甘酯、硬脂酸单甘酯、亚油酸单甘酯、二十碳五烯酸单甘酯、二十二碳六烯酸单甘酯或花生四烯酸单甘酯中的一种或几种。
[0013]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述预热搅拌，其中，所述预热，其预热温度为30?65°C ;所述搅拌，其转速为100?600rpm。
[0014]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述有机溶剂包括，正己烷、氯仿、石油醚、无水乙醚或异辛烷中的一种或几种，其添加量与已加入混合液的质量比为0.3?3:1。
[0015]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述搅拌反应，其是在100?600rpm的转速下，搅拌反应I?8h。
[0016]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述除去溶剂，其是取混合物上清液在真空度为400?600mm Hg的条件下减压旋转蒸发0.5?2h除去溶剂。
[0017]作为本发明所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法的一种优选方案，其中:所述单甘酯为油酸单甘酯，所述脂肪酸乙烯酯为棕榈酸乙烯酯，所述有机溶剂为正己烷，所述预热搅拌为预热温度30°C、搅拌转速550rpm，所述固定化脂肪酶为固定化脂肪酶LipozymeRM頂，其中，
[0018]所述油酸单甘酯与所述棕榈酸乙烯酯的摩尔比为I: I;
[0019]所述固定化脂肪酶Lipozyme RM頂，其添加量为底物总质量的6% ;
[0020]保持整个体系在35°C、550rpm的条件下，搅拌反应2h，去酶，取混合物上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发2h除去溶剂。
[0021 ]本发明所具有的有益效果:
[0022](I)本发明所提供的酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法，利用单甘酯和游离脂肪酸或脂肪酸乙烯酯作为反应底物，利用酶的专一性和高效性，一步合成二元酸I，3_甘油二酯，反应时间短，效率颇高，进一步优选棕榈酸乙稀酯作为反应底物，固定化酶LipozymeRM頂作为选定脂肪酶，效率可进一步提高，得率可达到90.4%。
[0023](2)本发明所提供的酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，与现有的以甘油和游离脂肪酸为反应底物经一步酶法酯化反应合成方法相比，避免了副产物单甘酯的形成;克服了现有化学方法合成的毒性大、温度高的缺点，整个反应条件温和、没有毒性试剂。
[0024](3)本发明所提供的酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，以脂肪酸乙烯酯和单甘酯为反应底物，此反应为不可逆反应，合成的中间产物沸点较低，在反应过程中促使反应不断向合成方向进行，使得反应温度显著降低，反应时间明显缩短且合成的得率显著提高。并且较低的反应温度还有利于抑制酰基转移和增加固定化脂肪酶的使用次数，提高了反应效率，同时也降低了后续分离纯化操作的难度。由此可见，本发明提供酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，是一种高效、绿色，便于大规模推广工业化生产二元酸I，3-甘油二酯的方法。
【附图说明】
[0025]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
[0026]图1为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯的得率随加酶量变化的关系示意图，反应条件为:油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1摩尔比混合，加入ImL正己烷并加入占底物总质量4?12%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，在35°C下反应lh。
[0027]图2为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯的得率随溶剂添加量变化的关系示意图，反应条件为:油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1摩尔比混合，加入0.5?2mL正己烷并加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，在35°C下反应lh。
[0028]图3为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯的得率随反应温度变化的关系示意图，反应条件为:油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1摩尔比混合，加入0.5mL正己烷并加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，在30?50°C下反应lh。
[0029]图4为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯的得率随反应时间变化的关系示意图，反应条件为:油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1摩尔比混合，加入0.5mL正己烷并加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，在35°C下反应I?4h。
[0030]图5为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯分离纯化前的气相色谱图。该反应产物为实施例3的反应产物。
[0031]图6为本发明反应产物中二元酸I，3_甘油二酯分离纯化后的气相色谱图。该反应产物为实施例3的反应产物。
【具体实施方式】
[0032]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0033]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0034]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0035]本发明的反应体系为混合反应体系，通过反应温度、时间、酶添加量等因素的优化，确定该混合反应体系的最佳合成工艺。
[0036]1、反应温度
[0037]反应中温度的控制非常重要，由于酶促催化反应是一个热动力学过程，影响着酶的催化活性、底物的溶解状态及粘度、底物和产物的传质速度等。温度太低，不利于达到反应所需的活化能，脂肪酶不能与底物有效结合，反应速率较低，反应时间延长，产物中二元酸I，3-甘油二酯较少;温度太高，则会导致脂肪酶变性，降低酶活。
[0038]2、反应时间
[0039]酯交换反应包括催化剂接入、形成中间体、另一脂肪酸的接入以及催化剂的断开四个阶段，整个过程需要一定的时间。时间不足，则这一反应过程还无法达到平衡，时间过长，则不但无益于二元酸1，3_甘油二酯含量的增加，反而还会增加副反应的程度，不利于产品的质量。
[0040]3、脂肪酶添加量
[0041]加酶量的大小和反应速度直接相关，如果底物的量能够保持足够大，且反应速度与酶量也符合动力学关系，当酶量增加时，反应速度亦随之增大。脂肪酶添加量太少，则降低反应速率。脂肪酶添加量过多，也就是底物含量相对较低时，虽然这时反应速度也随着增大，但底物和产物的传质阻力的影响已开始大于酶反应催化速度的影响，其反应速度的增量减少，酶的催化效率降低。
[0042]4、搅拌速率
[0043]发明人研究发现，随着反应的进行，一定速率的搅拌对酶法合成反应的形成具有促进作用，但过搅拌速率过高却反而不利于目标产物的生成。不同搅拌速率下，样品的硬度等存在差异可能与其微观交联度有关。同时交联结构的强度和数量也直接影响到体系的粘弹性能。借助于其相同条件下粘弹性能的变化，能进一步阐明搅拌剪切对二元酸I，3_甘油二酯质构的影响。
[0044]实施例1:
[0045]将油酸单甘酯和硬脂酸乙烯酯以1:1的摩尔比加入反应器中，加入ImL正己烷，放入搅拌子，在温度为35 °C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在400rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量10%的固定化脂肪酶Lipozyme RM頂，开始反应，反应2h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发Ih除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为83.6 %。
[0046]实施例2:
[0047]将二十二碳六烯酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1的摩尔比加入反应器中，加入2mL正己烷，放入搅拌子，在温度为40°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在500rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量8%的固定化脂肪酶Novozym 435，开始反应，反应Ih后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为450mm Hg的条件下减压旋转蒸发0.5h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸1,3-DAG的得率为81.6%。
[0048]实施例3:
[0049]将油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1的摩尔比加入反应器中，加入0.5mL正己烷，放入搅拌子，在温度为35 °C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在550rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM頂，开始反应，反应2h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发2h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为90.4%。产物分离纯化前后气相色谱图见附图5、
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[0050]实施例4:
[0051 ] 将油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:3的摩尔比加入反应器中，加入3mL正己烷，放入搅拌子，在温度为50°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在450rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，开始反应，反应4h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为400mm Hg的条件下减压旋转蒸发1.5h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为81.3 %。
[0052]实施例5:
[0053]将花生四烯酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:2的摩尔比加入反应器中，加入0.5mL正己烷，放入搅拌子，在温度为50°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在400rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量6 %的固定化脂肪酶Lipozyme 435，开始反应，反应3h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为450mm Hg的条件下减压旋转蒸发0.5h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为85.6 %。
[0054]实施例6:
[0055]将硬脂酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1的摩尔比加入反应器中，加入ImL无水乙醚，放入搅拌子，在温度为35°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在600rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量8%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，开始反应，反应Ih后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为400mm Hg的条件下减压旋转蒸发Ih除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为84.5 %。
[0056]实施例7:
[0057]将棕榈酸单甘酯和油酸乙烯酯以1:2的摩尔比加入反应器中，加入0.5mL石油醚，放入搅拌子，在温度为35 °C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在350rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM頂，开始反应，反应Ih后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发Ih除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为86.8 %。
[0058]实施例8:
[0059]将油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:1的摩尔比加入反应器中，加入2mL异辛烷，放入搅拌子，在温度为50°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在500rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量6%的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，开始反应，反应4h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发0.5h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为80.2 %。
[0060]实施例9:
[0061]将油酸单甘酯和棕榈酸乙烯酯以1:2的摩尔比加入反应器中，加入1.5mL氯仿，放入搅拌子，在温度为50°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，在450rpm的条件下搅拌，加入占底物总质量10 %的固定化脂肪酶Novozym 435，开始反应，反应3h后取出产物，去除脂肪酶，取上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发2h除去溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为83.2 %。
[0062]实施例10(对比实施例):
[0063]将油酸单甘酯和游离棕榈酸以1:1的摩尔比加入反应器中，加入ImL正己烷，放入搅拌子，在温度为50°C的超级循环水浴锅中预热，打开磁力搅拌器，加入占底物总质量10%的固定化脂肪酶Novozym 435，开始反应，反应3h后取出产物，去除脂肪酶，减压旋转蒸发脱除溶剂，通过HPLC分析，产物中二元酸I，3-DAG的得率为45.2 %。
[0064]由此可见，本发明所提供的酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，利用单甘酯和游离脂肪酸或脂肪酸乙烯酯作为反应底物，利用酶的专一性和高效性，一步合成二元酸I，
3-甘油二酯，反应时间短，效率颇高，进一步优选棕榈酸乙烯酯作为反应底物，固定化酶Lipozyme RM IM作为选定脂肪酶，效率可进一步提高，得率可达到90.4% ;本发明所提供的酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，与现有的以甘油和游离脂肪酸为反应底物经一步酶法酯化反应合成方法相比，避免了副产物单甘酯的形成;克服了现有化学方法合成的毒性大、温度高的缺点，整个反应条件温和、没有毒性试剂。
[0065]应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:包括， 将单甘酯和游离脂肪酸或脂肪酸乙烯酯以1:1?3摩尔比混合，加入有机溶剂后预热搅拌，再加入固定化脂肪酶，在30?65°C的温度下搅拌反应，去酶，除去溶剂，得到二元酸1，3_甘油二酯产品。2.如权利要求1所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述固定化脂肪酶包括，固定化酶Lipozyme RM IM、固定化酶Novozym 435、固定化酶Lipozyme 435、固定化酶Lipozyme TL IM或固定化酶NS40086中的一种或几种，其添加量为底物总质量的4?12%。3.如权利要求1或2所述酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法，其特征在于:所述固定化脂肪酶为固定化酶Lipozyme RM頂，其添加量为底物总质量的6?10%。4.如权利要求1或2所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述脂肪酸乙烯酯包括，油酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯中的一种或几种。5.如权利要求1或2所述的酶法合成二元酸I，3_甘油二酯的方法，其特征在于:所述单甘酯包括，油酸单甘酯、棕榈酸单甘酯、硬脂酸单甘酯、亚油酸单甘酯、二十碳五烯酸单甘酯、二十二碳六烯酸单甘酯或花生四烯酸单甘酯中的一种或几种。6.如权利要求1所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述预热搅拌，其中，所述预热，其预热温度为30?65 °C ；所述搅拌，其转速为100?600rpm。7.如权利要求1所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述有机溶剂包括，正己烷、氯仿、石油醚、无水乙醚或异辛烷中的一种或几种，其添加量与已加入混合液的质量比为0.3?3:1。8.如权利要求1所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述搅拌反应，其是在100?600rpm的转速下，搅拌反应I?8h。9.如权利要求1、2、6、7或8中任一项所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述除去溶剂，其是取混合物上清液在真空度为400?600mm Hg的条件下减压旋转蒸发0.5?2h除去溶剂。10.如权利要求9所述酶法合成二元酸I，3-甘油二酯的方法，其特征在于:所述单甘酯为油酸单甘酯，所述脂肪酸乙烯酯为棕榈酸乙烯酯，所述有机溶剂为正己烷，所述预热搅拌为预热温度30°C、搅拌转速550rpm，所述固定化脂肪酶为固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，其中， 所述油酸单甘酯与所述棕榈酸乙烯酯的摩尔比为I: I; 所述固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，其添加量为底物总质量的6% ; 保持整个体系在35°C、550rpm的条件下，搅拌反应2h，去酶，取混合物上清液在真空度为500mm Hg的条件下减压旋转蒸发2h除去溶剂。
【文档编号】C12P7/64GK106047955SQ201610619745
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月31日
【发明人】王小三, 张晋芳, 祝雨筱, 金青哲, 王兴国
【申请人】江南大学