专利名称：磷酸激酶pkd2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种新的磷酸激酶PKD2多肽、其编码序列和抗体以及这些多核苷酸、多肽及其抗体的应用以及所述多肽的制备方法。
背景技术：
“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。
国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。
国内生物医药企业的药物研发仍然以仿制为主，缺乏完整的药物开发平台和研发体系，基本上不寻找新的药物靶点基因。而忽视药靶开发就直接导致了国内大部分新药没有自主知识产权保护，在国内面临恶性竞争，又不可能进入国际市场。同国外一样，国内生物医药企业迫切需要的也是完全鉴定的、原创的药物靶点基因，只有这样才能降低新药开发的成本和风险，开发出有自主知识产权的新药。
在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性(conservativity)，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化，蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而转录因子IκBα等则相反，在磷酸化状态时没有活性，而在非磷酸化状态时具有活性。
蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症(inflammation)反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-κB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。
鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决定性的作用，以及磷酸激酶在信号转导通路极其重要的地位，设计和开发以磷酸激酶为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。目前针对激酶的药物包括PKC活性调节剂、PKA抑制剂、PTK抑制剂和受体介导的钙通道调节剂等，其中部分已经进入临床试验。
但现有的激酶药物靶点尚远远不能满足人类战胜疾病、攻克肿瘤的需求，我们仍需更特异、更有效的新的激酶作为药靶，从而有效拓宽治疗疾病的途径，增进人类的健康。
发明内容
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种分离的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段，其特征在于，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)相对于SEQ ID NO4的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且保留SEQ ID NO4的磷酸激酶PKD2的生物活性的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码上述磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的核酸序列或其互补序列。在较佳的实施方案中，所述核酸序列具有SEQ ID NO3所示的核酸序列。
本发明还涉及含有含有上述核酸序列的载体以及被该载体转化的宿主细胞。
本发明另一方面还提供了一种产生上述磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的方法，其特征在于，该方法包括
(a)在适合磷酸激酶PKD2蛋白多肽表达的条件下，培养上述宿主细胞；(b)分离出权利要求1所述的磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段。
本发明另一方面提供了与上述磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段特异性结合的抗体。
本发明另一方面涉及本发明的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段或其核酸序列在制备用于刺激NF-AT通道的制剂中的用途。
本发明还有一个方面涉及本发明的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段或其核酸序列作为肿瘤标志物中的用途。
本发明另一方面还涉及一种药物组合物，该组合物含有安全有效量的本发明蛋白质以及药学上可接受的载体。
本发明还有一个方面涉及一种体外检测样品中是否存在癌细胞的方法，所述样品来自食管或直肠组织，该方法包括测定样品中的磷酸激酶PKD2的核酸序列的表达量，并将其与标准样品中的表达量相比较，如果样品中的表达量升高，则表明该样品中存在癌细胞。
本发明的磷酸激酶PKD2含有一个磷酸激酶的结构域，其能刺激NF-AT活性，提示PKD2在免疫、炎症反应中具有关键作用。另外，本发明的磷酸激酶在食管、直肠癌组织中表达升高，而在正常组织不表达或表达量很低，提示其可作为检测食管、直肠癌组织的标志物。本发明的其它优点可从以下的详细描述获知。
图1显示了本发明实施例1获得的878个氨基酸长的丝/苏氨酸蛋白激酶的结构，其中P表示富含脯氨酸的结构域；CYS表示富含半胱氨酸的锌指结构域；S表示富含丝氨酸的结构域；AC表示酸性结构域；PH表示pleckstrin同源结构域；Kinase表示激酶催化结构域。
图2显示了PKD2和LCK相互作用的试验结果。分别利用anti-flag、anti-myc的单克隆抗体，通过Westen-blot法检测RX317、LCK表达情况，结果见图(2)上、中。从图中可以看出，RX317、LCK的表达情况良好、表达量稳定。然后我们用anti-myc抗体和Protein G免疫沉淀后，共沉淀产物经SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上，用酶标anti-flag抗体行蛋白免疫印迹杂交。结果见图(2)下，PKD2与LCK在生理条件下存在着相互结合。
图3显示了在Jurkat T细胞中转染PKD2基因对NFAT活性的影响，野生型PKD2可以在anti-TCR药物处理的条件下激活NFAT(活化的T细胞核因子)，其激酶功能缺失突变型PKD2可以抑制NFAT(活化的T细胞核因子)的活化。
具体实施例方式
本发明者成功地建立了从Genebank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库，应用生物信息学方法对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，预测到一个新的尚无任何功能注释的磷酸激酶PKD2。随后本发明者克隆了其全长cDNA，根据其cDNA分析，PKD2编码的蛋白含有一个磷酸激酶的结构域。应用实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)，本发明者在多种肿瘤及其对应正常组织中检测PKD2的表达情况。结果显示，PKD2基因在食管、直肠癌组织中表达升高，而在正常组织不表达或表达量很低。
由于基因并不直接参与人体的生理、病理过程，蛋白才是生命活动的直接体现者，为进一步明确PKD2这一新激酶的功能，本发明者展开了对其蛋白的研究。酵母双杂交是目前最常用的大规模快速研究蛋白-蛋白间相互作用的方法，具有简单、稳定的优点，截至目前还没有可以取代这一技术的其他技术出现。本发明者利用酵母双杂交系统，以PKD2这一基因作为诱饵对Hela、淋巴组织、胎脑文库进行了大规模筛选，获得了LCK基因阳性克隆。随后，通过免疫共沉淀实验，进一步在哺乳动物中验证PKD2与LCK的作用关系。最终，酵母双杂交筛选法和免疫共沉淀法都表明，磷酸激酶PKD2与LCK确实具有直接的相互作用。
LCK(Homo sapiens lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)由509个氨基酸残基组成，分子量为56K。属于以p60v-src/c-src为代表的蛋白酪氨酸激酶家族成员，同这个家族的其它成员一样都具有酪氨酸激酶活性。目前发现，p56LCK相对特异地存在于淋巴细胞中，尤其是成熟的静止T淋巴细胞中。p56LCK在T细胞活化信号转导以及分化调节过程中起着重要的作用，在TCR(T细胞受体)途径中起着关键作用。
本发明者进一步利用报告基因系统研究PKD2基因的功能。结果显示在JurkatT细胞中转染PKD2基因对Anti-TCR刺激的NF-AT活性有影响。NF-AT通路是TCR途径中重要的信号转导通路，调节免疫反应中白介素、多种细胞因子的转录和表达。PKD2能刺激NF-AT活性，提示PKD2在免疫、炎症反应中具有关键作用。
基于上述发现，本发明一方面提供了一种分离的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)相对于SEQ ID NO4的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且保留SEQ ID NO4的磷酸激酶PKD2的生物活性的氨基酸序列。
在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别包括抗体。本发明的多肽还可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。
本发明的术语“磷酸激酶PKD2(蛋白)多肽”指具有磷酸激酶PKD2蛋白活性的SEQ ID NO4所示的多肽。该术语的含义还包括了具有与PKD2相同生物活性或功能的、SEQ ID NO4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)相对于SEQ IDNO4的序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。
该术语还包括PKD2蛋白的片段、衍生物或其融合蛋白，较佳的是该片段或衍生物保留了PKD2蛋白的生物活性。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PKD2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有PKD2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明所用的术语“具有(保留)磷酸激酶PKD2的生物活性”指该蛋白或其类似物能与LCK蛋白相互作用并能刺激NF-AT活性。
本发明还涉及PKD2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然PKD2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。本发明还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码上述磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的核酸序列或其互补序列。
在本发明中，术语“核酸(序列)”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的生物活性或性能，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。术语“核酸”可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。另外，本发明的核酸序列可经过修饰以使用针对特别细胞类别而言较佳的密码子。本发明的核酸序列还包括核酸片段或核酸亚序列，只要该核酸片段或核酸亚序列具有与本发明的核酸序列同样的生物活性。而且，本发明的核酸序列也包括其保守性修饰的变体和互补序列。特定核酸序列的“保守性修饰”指那些核酸，它们编码相同或基本相同的氨基酸序列，或当核酸不编码氨基酸序列时，具有基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码了一给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子确定的每个精氨酸位置，密码子可以变成上述相应密码子的任一个而不改变编码的多肽。这种核酸变化是“沉默变化”，它是“保守性修饰变化”中的一种。本领域技术人员会认识到，核酸中的每个密码子(除AUG外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)均可用标准技术修饰产生功能相同的分子。因此，每一序列意味着包括了编码某多肽的核酸的“沉默变化”。
另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与SEQ ID NO3所示的核酸序列相同(同源)或基本上相同(同源)以下的核酸序列。例如，其包括了与SEQ ID NO3的核酸序列有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性百分数”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一(或本领域技术人员可获得的其他算法)或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。这样的“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。为了比较序列和确定同源性，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)来进行。
两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在严谨条件下相互杂交。术语“与…特异性杂交”指，当某序列存在于一个DNA或RNA复杂混合物中(例如总细胞)时，该分子在严谨条件下只与一特定的核苷酸序列结合、形成双链或杂交。在核酸杂交实验中，“严谨的杂交条件”和“严谨的杂交洗涤条件”取决于序列，而且在不同的环境参数下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，选择高度严谨的杂交和洗涤条件使得比在确定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO3的核酸序列杂交的核酸序列。
本发明还包括编码磷酸激酶PKD2多肽的核酸序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内PKD2的表达。本发明还包括可用作探针和引物的核酸分子，该分子通常具有SEQ ID NO3所示核酸序列的约8-100个，较佳地约15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码PKD2的核酸分子。
因此，本发明还包括检测样品中PKD2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。在较佳的方法中，可采用实时定量PCR方法进行所述检测。另外，该样品宜是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于编码PKD2多肽的序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
本发明还提供了一种体外检测样品中是否存在癌细胞的方法，所述样品来自食管或直肠组织，该方法包括测定样品中的PKD2核酸序列的表达量，并将其与标准样品中的表达量相比较，如果样品中的表达量升高，则表明该样品中存在癌细胞。在较佳的方法中，可采用实时定量PCR方法进行所述检测。
因此，本发明还有一个方面涉及用本发明的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段或其核酸序列作为肿瘤标志物来检测肿瘤，如食管癌或直肠癌。
本发明的PKD2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠(overlapping)扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
本发明另一方面涉及一种载体或构建物，所述载体或构建物包含本发明上述的核酸序列或其片段。在较佳的实施方案，所述载体是表达载体，其包含本发明上述的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
在较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达启动子。选择适合在靶组织中高度或过量表达的表达调控序列，如启动子(例如35S启动子)。另外，增强元件(增强子)的存在，联合上述启动子元件也通常会提高表达水平。
本发明另一方面还涉及被上述载体转化的宿主细胞。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电穿孔；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。
本发明另一方面提供了一种制备上述磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的方法，该方法包括(a)在适合磷酸激酶PKD2蛋白多肽表达的条件下，培养上述宿主细胞；(b)分离出所述的磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段。
本发明磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase PeptideSynthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本发明另一方面还包括对磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，较佳的是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于磷酸激酶PKD2多肽或片段，较佳地指那些能与磷酸激酶PKD2多肽或其片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制磷酸激酶PKD2多肽的分子，也包括那些并不影响磷酸激酶PKD2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的磷酸激酶PKD2结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的磷酸激酶PKD2或者其具有抗原性的片段可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达磷酸激酶PKD2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断磷酸激酶PKD2生物活性的抗体。本发明的各类抗体可以利用PKD2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与磷酸激酶PKD2的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
通过各种常规筛选方法，还可以筛选出与磷酸激酶PKD2发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。术语“相互作用”意味着包括直接相互作用的形式，如结合、切割和间接的相互作用。一种较佳的筛选方法是酵母双杂交筛选法，其中通过在酵母细胞中导入编码第一蛋白与DNA结合域的融合物的第一表达载体以及编码第二蛋白与DNA激活结构域的融合物的第二表达载体，可以测定蛋白-蛋白的相互作用。如本说明书实施例所述，经酵母双杂交筛选表明，本发明的磷酸激酶PKD2与LCK有直接的相互作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1、PKD2基因的筛选本发明者从已建立的由Genebank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库中，应用现代生物信息学PFAM/Profile模式对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，找到一个新发现的878个氨基酸长的丝/苏氨酸蛋白激酶，其可以被DAG激活，其结构如图1所示。
实施例2、PKD2基因的获得为了获得PKD2基因的全长，本发明者设计了如下引物，上游引物5’acgctGGCCAATCCGGCCATGGCCACCGCCCCCTCTTATCC3’(SEQ ID NO1)下游引物5’acgctGGCCTCTAAGGCCTCAGAGAACACTGATGCGCTCCGC3’(SEQ ID NO2)该对引物含有SfiI穿梭克隆位点、起始密码子和终止密码子，以人体组织混合RNA为模板，通过常规PCR方法进行扩增，获得了全长的PKD2基因。然后对其进行测序。该基因序列显示在SEQ ID NO3中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO4中。
实施例3、筛选与PKD2相互作用的蛋白本发明者构建了PKD2全长cDNA，并以它为诱饵基因，用Gal4酵母双杂交系统筛选Hela细胞的cDNA文库，获得了2个阳性克隆，经测序鉴定为LCK基因(淋巴细胞的靶标)。
实施例4、验证PKD2与LCK的相互作用为了排除酵母双杂交技术可能引起的假阳性，本发明者将PKD2、LCK基因分别克隆至含Flag、Myc等tag的真核表达载体上，转染人胚肾293T细胞系，24-48小时后破碎细胞，用Flag、Myc等tag的抗体确定它们是否有共沉淀。实验结果表明PKD2与LCK相互作用(图2)。
实施例5、PKD2基因的功能鉴定利用报告基因系统研究在Jurkat T细胞中过量表达PKD2基因的野生型或ATP结合位点突变型。萤光素酶活性可以在转染24小时后得到。由于萤光素酶法是一种很灵敏的方法，容易引入实验误差，计划每组实验数据独立重复三次以上以求得平均值。结果在JurkatT细胞中转染PKD2基因对Anti-TCR(T细胞受体)刺激的NF-AT活性有影响(结果见图3)。
实施例6、PKD2的组织分布实时荧光定量PCR(Q-PCR)是目前对基因进行定量分析最为灵敏、精确的技术。本发明者已经构建了有300余对肿瘤组织及其对应正常组织的冰冻组织库，包含18种肿瘤类型。为了进一步确定PKD2基因在各种肿瘤组织中的表达情况，本发明者利用该冰冻组织库，通过Q-PCR技术，进行定性、定量的研究。
如表1结果所示，PKD2基因在人食道和直肠癌组织中表达比正常组织有升高。
表1
注表达升高的界定为MT/N＞5，表达下调界定为MT/N＜0.2，表达持平为0.2＜MT/N＜5尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。
序列表<110>上海睿星基因技术有限公司<120>磷酸激酶PKD2及其应用<130>053605<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1acgctggcca atccggccat ggccaccgcc ccctcttatc c 41<210>2<211>42<212>DNA<213>智人<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2acgctggcct ctaaggcctc agagaacact gatgcgctcc gc 42<210>3<211>2637<212>DNA<213>智人<400>3atggccaccg ccccctctta tcccgccggg ctccctggct ctcccgggcc ggggtctcct 60ccgccccccg gcggcctaga gctgcagtcg ccgccaccgc tactgcccca gatcccggcc 120ccgggttccg gggtctcctt tcacatccag atcgggctga cccgcgagtt cgtgctgttg 180cccgccgcct ccgagctggc tcatgtgaag cagctggcct gttccatcgt ggaccagaag 240ttccctgagt gtggcttcta cggcctttac gacaagatcc tgcttttcaa acatgacccc 300
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Lys His Asp Pro Thr Ser Ala Asn Leu Leu Gln Leu Val Arg Ser Ser100 105 110Gly Asp Ile Gln Glu Gly Asp Leu Val Glu Val Val Leu Ser Ala Ser115 120 125Ala Thr Phe Glu Asp Phe Gln Ile Arg Pro His Ala Leu Thr Val His130 135 140Ser Tyr Arg Ala Pro Ala Phe Cys Asp His Cys Gly Glu Met Leu Phe145 150 155 160Gly Leu Val Arg Gln Gly Leu Lys Cys Asp Gly Cys Gly Leu Asn Tyr165 170 175His Lys Arg Cys Ala Phe Ser Ile Pro Asn Asn Cys Ser Gly Ala Arg180 185 190Lys Arg Arg Leu Ser Ser Thr Ser Leu Ala Ser Gly His Ser Val Arg195 200 205Leu Gly Thr Ser Glu Ser Leu Pro Cys Thr Ala Glu Glu Leu Ser Arg210 215 220Ser Thr Thr Glu Leu Leu Pro Arg Arg Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser225 230 235 240Ser Ser Ala Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Pro Ile Glu Leu Asp Lys Met245 250 255Leu Leu Ser Lys Val Lys Val Pro His Thr Phe Leu Ile His Ser Tyr260 265 270Thr Arg Pro Thr Val Cys Gln Ala Cys Lys Lys Leu Leu Lys Gly Leu275 280 285Phe Arg Gln Gly Leu Gln Cys Lys Asp Cys Lys Phe Asn Cys His Lys290 295 300Arg Cys Ala Thr Arg Val Pro Asn Asp Cys Leu Gly Glu Ala Leu Ile305 310 315 320Asn Gly Asp Val Pro Met Glu Glu Ala Thr Asp Phe Ser Glu Ala Asp325 330 335Lys Ser Ala Leu Met Asp Glu Ser Glu Asp Ser Gly Val Ile Pro Gly340 345 350Ser His Ser Glu Asn Ala Leu His Ala Ser Glu Glu Glu Glu Gly Glu355 360 365Gly Gly Lys Ala Gln Ser Ser Leu Gly Tyr Ile Pro Leu Met Arg Val
370 375 380Val Gln Ser Val Arg His Thr Thr Arg Lys Ser Ser Thr Thr Leu Arg385 390 395 400Glu Gly Trp Val Val His Tyr Ser Asn Lys Asp Thr Leu Arg Lys Arg405 410 415His Tyr Trp Arg Leu Asp Cys Lys Cys Ile Thr Leu Phe Gln Asn Asn420 425 430Thr Thr Asn Arg Tyr Tyr Lys Glu Ile Pro Leu Ser Glu Ile Leu Thr435 440 445Val Glu Ser Ala Gln Asn Phe Ser Leu Val Pro Pro Gly Thr Asn Pro450 455 460His Cys Phe Glu Ile Val Thr Ala Asn Ala Thr Tyr Phe Val Gly Glu465 470 475 480Met Pro Gly Gly Thr Pro Gly Gly Pro Ser Gly Gln Gly Ala Glu Ala485 490 495Ala Arg Gly Trp Glu Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Met Pro Val Ile500 505 510Leu Gln Asp Ala Pro Ser Ala Pro Gly His Ala Pro His Arg Gln Ala515 520 525Ser Leu Ser Ile Ser Val Ser Asn Ser Gln Ile Gln Glu Asn Val Asp530 535 540Ile Ala Thr Val Tyr Gln Ile Phe Pro Asp Glu Val Leu Gly Ser Gly545 550 555 560Gln Phe Gly Val Val Tyr Gly Gly Lys His Arg Lys Thr Gly Arg Asp565 570 575Val Ala Val Lys Val Ile Asp Lys Leu Arg Phe Pro Thr Lys Gln Glu580 585 590Ser Gln Leu Arg Asn Glu Val Ala Ile Leu Gln Ser Leu Arg His Pro595 600 605Gly Ile Val Asn Leu Glu Cys Met Phe Glu Thr Pro Glu Lys Val Phe610 615 620Val Val Met Glu Lys Leu His Gly Asp Met Leu Glu Met Ile Leu Ser625 630 635 640Ser Glu Lys Gly Arg Leu Pro Glu Arg Leu Thr Lys Phe Leu Ile Thr645 650 655
Gln Ile Leu Val Ala Leu Arg His Leu His Phe Lys Asn Ile Val His660 665 670Cys Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Ala Ser Ala Asp Pro Phe675 680 685Pro Gln Val Lys Leu Cys Asp Phe Gly Phe Ala Arg Ile Ile Gly Glu690 695 700Lys Ser Phe Arg Arg Ser Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Leu Ala Pro705 710 715 720Glu Val Leu Leu Asn Gln Gly Tyr Asn Arg Ser Leu Asp Met Trp Ser725 730 735Val Gly Val Ile Met Tyr Val Ser Leu Ser Gly Thr Phe Pro Phe Asn740 745 750Glu Asp Glu Asp Ile Asn Asp Gln Ile Gln Asn Ala Ala Phe Met Tyr755 760 765Pro Ala Ser Pro Trp Ser His Ile Ser Ala Gly Ala Ile Asp Leu Ile770 775 780Asn Asn Leu Leu Gln Val Lys Met Arg Lys Arg Tyr Ser Val Asp Lys785 790 795 800Ser Leu Ser His Pro Trp Leu Gln Glu Tyr Gln Thr Trp Leu Asp Leu805 810 815Arg Glu Leu Glu Gly Lys Met Gly Glu Arg Tyr Ile Thr His Glu Ser820 825 830Asp Asp Ala Arg Trp Glu Gln Phe Ala Ala Glu His Pro Leu Pro Gly835 840 845Ser Gly Leu Pro Thr Asp Arg Asp Leu Gly Gly Ala Cys Pro Pro Gln850 855 860Asp His Asp Met Gln Gly Leu Ala Glu Arg Ile Ser Val Leu865 870 87权利要求
1.一种分离的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段，其特征在于，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)相对于SEQ ID NO4的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且保留SEQ ID NO4的磷酸激酶PKD2的生物活性的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码权利要求1所述的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的核酸序列或其互补序列。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有SEQID NO3所示的核酸序列。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的核酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的载体转化。
6.一种产生权利要求1所述的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段的方法，其特征在于，该方法包括(a)在适合磷酸激酶PKD2蛋白多肽表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；(b)分离出权利要求1所述的磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段。
7.一种抗体，其特征在于，它与权利要求1所述的磷酸激酶PKD2蛋白多肽或其活性片段特异性结合。
8.权利要求1所述的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段或权利要求2所述的其核酸序列的用途，其特征在于，用于制备治疗T细胞活化、自身免疫、及器官移植排斥等疾病的药物。
9.权利要求1所述的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段或权利要求2所述的核酸序列作为肿瘤标志物中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了分离的磷酸激酶PKD2多肽或其活性片段，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列(a)序列表SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)相对于SEQ ID NO4的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且保留SEQ ID NO4的磷酸激酶PKD2的生物活性的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述多肽的核酸序列、含有该核酸序列的载体和宿主细胞、其制备方法和用途。
文档编号A61K38/45GK1920014SQ20051002903
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月24日 优先权日2005年8月24日
发明者罗楹, 吴骏, 李庆 申请人:上海睿星基因技术有限公司