用于荧光素酶和核苷磷酸的发光检测的稳定制剂的制作方法
【专利说明】用于荧光素酶和核苷磷酸的发光检测的稳定制剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月22日提交的美国临时申请No. 61/767, 875和2013年3 月14日提交的美国临时申请No. 61/783, 726的优先权，这两个临时申请均通过引用的方式 整体并入本文。
【背景技术】
[0003] 荧光素是外消旋化合物，在溶液中，其由D-荧光素外消旋至L-荧光素或者由 L-荧光素外消旋至D-荧光素。D-荧光素可以用作荧光素酶的底物而产生光，而L-荧光素 很大程度上是抑制性的并且导致发光减少。由于D-荧光素底物的可用性的变化和降低以 及L-荧光素的抑制作用，在储存过程中D-荧光素至L-荧光素的缓慢外消旋对于利用荧光 素酶活性的测定存在问题。
技术领域
[0004] 本公开涉及用于测定酶和代谢产物的组合物、方法和试剂盒。
【发明内容】
[0005] 在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素的组合物，其中 所述组合物基本上不含ATP。在某些实施方案中，提供了包含ATP、L-荧光素和D-荧光素 的组合物，其中所述组合物基本上不含荧光素酶。
[0006] 在一些实施方案中，提供了包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物。
[0007] 在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素和ATP的组合物， 其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。
[0008] 在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含荧光素酶、L-荧 光素和D-荧光素，所述组合物基本上不含ATP且包装在容器中。所述试剂盒可以包括至少 一种额外组分，例如一种或多种洗涤剂，例如十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷，磷 酸钾、消泡剂、缓冲剂、盐和螯合剂，例如乙二胺四乙酸（EDTA)。
[0009] 在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含D-荧光素、 L-荧光素和ATP，其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。所述试剂盒可以包 括至少一种额外组分，例如一种或多种洗涤剂，例如十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二 烷，磷酸钾、消泡剂、缓冲剂、盐和螯合剂，例如乙二胺四乙酸（EDTA)。
[0010] 在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含L-荧光素、 D-荧光素和ATP，所述组合物基本上不含荧光素酶且包装在容器中。所述试剂盒可以包括 至少一种额外组分，例如缓冲剂、二价阳离子螯合剂、镁盐、离子型或非离子型洗涤剂、含硫 醇化合物，如辅酶A或DTT、一种或多种含硫还原剂或其组合。
[0011] 在一些实施方案中，提供了用于测定样品中ATP的存在或量的方法，其中使包含 荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素的组合物与样品接触并检测和/或测量产生的发光度以 测定样品中ATP的存在或量。
[0012] 在一些实施方案中，提供了用于测定样品中荧光素酶的存在或量的方法、试剂盒 或组合物，其中使包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物与样品接触，所述样品可以含 有表达荧光素酶的细胞。然后检测和/或测量产生的发光度以测定样品中荧光素酶的存在 或量。含有表达荧光素酶的细胞的样品可以是裂解的细胞、未加工的细胞提取物或澄清的 细胞提取物。
[0013] 在一些实施方案中，提供了用于检测来自表达荧光素酶的细胞的荧光素酶活性的 方法，其中荧光素酶在细胞中表达，并且使所述细胞与包含L-荧光素和D-荧光素的混合物 接触，在所述混合物中所述L-荧光素与所述D-荧光素的比率为至少约5:95至约75:25。 在一些实施方案中，所述混合物包含L-焚光素和D-焚光素，所述L-焚光素和所述D-焚光 素的比率为至少约5:95至约55:45,或至少约5:95至约50:50。然后检测和/或测量产生 的发光度以测定细胞中荧光素酶的存在或量。
[0014] 在一些实施方案中，提供了用于检测或定量细胞或其他样品中核苷磷酸例如ATP 或ATP源的方法，其中使所述细胞或样品与包含L-荧光素和D-荧光素的混合物和荧光素 酶接触，在所述混合物中所述L-荧光素与所述D-荧光素的比率为至少约0. 5:1至约2:1。 然后检测和/或测量产生的发光度以测定细胞中核苷磷酸的存在或量。
[0015] 在一些实施方案中，提供了用于进行荧光素酶反应的方法。将包含L-荧光素和 D-荧光素的混合物在约(TC至约35°C的温度下储存一定时间段。当在荧光素酶活性测定中 使用所述混合物时，测量了光输出，即发光度。允许所述混合物与含有或表达荧光素酶，ATP 或ATP源的样品或部分样品接触，以形成反应测定物。然后检测反应测定物中产生的发光 度。已经储存一定时间段的含有混合物的反应测定物产生光输出，在某些实施方案中，所述 光输出为在储存时间段开始时（时间t = 0)含有所述混合物的可比较的反应测定物的光 输出的至少约50 %或至少约90%。在某些实施方案中，储存时间段可能为至少约30分钟， 至少约1小时，至少约4小时或更长。
[0016] 在一些实施方案中，提供了用于配制用于荧光素酶反应的组分的方法。使D-荧光 素和L-荧光素合并以形成混合物，所述混合物在约0°C至约35°C的温度下储存一定时间 段，如约1、2、3或4小时或1周或2周的时间段。当在荧光素酶活性测定中使用时，所述混 合物允许产生光输出，即发光度，以致在所述时间段之后产生的光输出为在所述时间段开 始时的光输出的至少约50 %或至少约90%。
[0017] 本公开涉及包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素的组合物。所述组合物基本上 不含ATP。所述组合物可以包含至少约0. 5:1至约2:1的L-荧光素与D-荧光素的比率。 所述组合物可以包含至少约5:95至约55:45的L-荧光素与D-荧光素的比率。所述组合 物可以具有至少约5且小于约9的pH。所述荧光素酶可以是甲虫荧光素酶，如萤火虫荧光 素酶或叩头虫荧光素酶。D-荧光素可以是D-5'氟荧光素且L-荧光素是L-5'氟荧光素。 所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金 属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶A、还原剂或其组合。所述组合 物可以包含硫酸镁和反式-1，2-环己二胺四乙酸（⑶TA)。所述组合物还可以包含至少一 种选自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、1，2-二氨基环己烷四乙酸、Tergitol洗涤剂、 Mazu消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。所述组合物还 可以包含至少一种选自如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消 泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、乙二胺四乙酸（EDTA)和AMP。所述组合物可以包含所述额外组分 中的至少两种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少三种。所述组合物可以包含所 述额外组分中的至少四种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少五种。所述组合物 还可以包含镁离子、柠檬酸缓冲剂、MES缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基 十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸（EDTA)。所述组合物还可以包含柠檬酸 缓冲剂、ffiPES缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸（EDTA)、磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、 羟基聚乙氧基十二烷和AMP。与未包含L-荧光素的组合物相比，当在约0°C至约35°C之间 的温度下储存时，所述组合物可以具有增加的储存寿命和/或稳定性。
[0018] 本公开涉及包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物。所述组合物基本上不含 荧光素酶。所述组合物可以包含至少约〇. 5:1至约2:1的L-荧光素与D-荧光素的比率。 所述组合物可以包含至少约5:95至约55:45的L-荧光素与D-荧光素的比率。所述组合 物可以具有至少约5且小于约9的pH。所述荧光素酶可以是甲虫荧光素酶，如萤火虫荧光 素酶或叩头虫荧光素酶。D-荧光素可以是D-5'氟荧光素且L-荧光素是L-5'氟荧光素。 所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金 属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶A、还原剂或其组合。所述组合 物可以包含硫酸镁和反式-1，2-环己二胺四乙酸（⑶TA)。所述组合物还包含至少一种选 自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、1，2-二氨基环己烧四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu 消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。所述组合物还包含至 少一种选自如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸 盐、磷酸钾、乙二胺四乙酸（EDTA)和AMP。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少两 种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少三种。所述组合物可以包含所述额外组分 中的至少四种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少五种。所述组合物还可以包含 镁离子、柠檬酸缓冲剂、MES缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡 剂、焦磷酸盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸（EDTA)。所述组合物还可以包含柠檬酸缓冲剂、HEPES 缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸（EDTA)、磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基 十二烷和AMP。与未包含L-荧光素的组合物相比，当在约0°C至约35°C之间的温度下储存 时，所述组合物可以具有增加的储存寿命和/或稳定性。
[0019] 本公开涉及包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物，其中所述L-荧光素的浓 度超过所述D-荧光素的浓度。所述组合物可以具有至少约5且小于约9的pH。所述荧光 素酶可以是甲虫荧光素酶，如萤火虫荧光素酶或叩头虫荧光素酶。D-荧光素可以是D-5' 氟荧光素且L-荧光素是L-5'氟荧光素。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额 外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸 盐、AMP、辅酶A、还原剂或其组合。所述组合物可以包含硫酸镁和反式-1，2-环己二胺四 乙酸（⑶TA)。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、 1，2-二氨基环己烷四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、 DTT、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的组分：氟化钠、 十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、乙二胺四乙酸（EDTA) 和AMP。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少两种。所述组合物可以包含所述额外组 分中的至少三种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少四种。所述组合物可以包含 所述额外组分中的至少五种。所述组合物还可以包含镁离子、柠檬酸缓冲剂、MES缓冲剂、氟 化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸 (EDTA)。所述组合物可以包含柠檬酸缓冲剂、HEPES缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸（EDTA)、 磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷和AMP。与未包含L-荧光素的组 合物相比，当在约〇°C至约35°C之间的温度下储存时，所述组合物可以具有增加的储存寿 命和/或稳定性。
[0020] 本公开涉及具有增加的储存寿命和/或稳定性的组合物。所述组合物可以包含荧 光素酶、L-荧光素和D-荧光素，其中所述组合物基本上不含ATP。所述荧光素酶可以是甲 虫荧光素酶。所述甲虫荧光素酶可以是萤火虫荧光素酶或叩头虫荧光素酶。所述组合物可 以包含至少约0. 5:1至约2:1的L-荧光素与D-荧光素的比率。所述组合物可以包含至少 约5:95至约55:45的L-荧光素与D-荧光素的比率。与未包含L-荧光素的组合物相比， 当在约0°C至约35°C的温度下储存时，所述反应混合物可具有增加的储存寿命和/或稳定 性。所述组合物可以具有至少约5且小于约9的pH。D-荧光素可以是D-5'氟荧光素，且 L-荧光素是L-5'氟荧光素。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：缓冲 剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶 A、还原剂或其组合。所述组合物可以包含硫酸镁和反式-1，2-环己二胺四乙酸（⑶TA)。所 述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、1，2-二氨基环己 烷四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐和 硫代硫酸盐。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基 铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、乙二胺四乙酸（ED